CN108441502A

CN108441502A - 一种犁头鳅dna条形码序列及其应用

Info

Publication number: CN108441502A
Application number: CN201711214821.5A
Authority: CN
Inventors: 刘红艳; 熊飞; 王莹
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2018-08-24

Abstract

本发明公开了一种犁头鳅DNA条形码序列及其应用，属于物种鉴定技术领域。该所述犁头鳅DNA条形码为犁头鳅COI基因，该DNA条形码序列可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，有效的对犁头鳅特有种进行鉴定。

Description

一种犁头鳅DNA条形码序列及其应用

技术领域

本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种犁头鳅DNA条形码序列及其应用。

背景技术

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。

犁头鳅(Lepturichthys fimbriata)，为平鳍鳅科(Balitoridae)平鳍鳅亚科(Balitorinae)，犁头鳅属(Lepturichthys)，是长江特有鱼类。犁头鳅是生活于急流石滩的底栖小型鱼类,利用宽大平展的偶鳍和平坦裸露的胸腹部适应急流生境。由于长江上游大型水水利工程的梯级开发，使其种群数量急剧下降。因此，对犁头鳅特有种进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、有足够变异的、标准的、易扩增并且相对较短的DNA片段，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前，各国研究者已经开展了从湖泊到海洋不同地理区域的鱼类DNA条形码研究计划，研究表明DNA条形码在物种鉴定方面具有高效可行性。在实际操作中，往往会遇到标本量较少以及样本保存不完整等问题，这样给传统的物种分类和鉴定研究带来了很大的困难。

COI为线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)，由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。线粒体DNA的COI基因具有长度适中、进化速率适中和富含系统进行发育信息等特点。在研究中，能够较好地对物种的COI基因片段进行有效扩增。因此，在动物物种分类和鉴定中，COI基因作为条形码应用有很大的潜力。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对一些动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为动物条形码数据库的标准条形码。

在现有的技术中心，均没有犁头鳅DNA条形码标准检测序列以及犁头鳅COI基因作为犁头鳅DNA条形码标准检测序列的记载和报道。

发明内容

本发明目的是提供一种可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，能够有效的对犁头鳅特有种进行鉴定。

本发明所采用的技术方案是：

一种犁头鳅DNA条形码序列，序列为SEQ ID NO.1。

优选地，所述犁头鳅DNA条形码为犁头鳅COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。

一种犁头鳅DNA条形码序列的应用，该DNA条形码序列可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，有效的对犁头鳅特有种进行鉴定。

本发明具有以下优点：

(1)本发明所得到的犁头鳅DNA条形码序列可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，对犁头鳅特有种高效和准确的进行鉴定和分类，其准确率达到99.5％以上。

(2)在实际操作中，该犁头鳅DNA条形码便于保存且完整性极强。

(3)犁头鳅作为长江上游珍稀、特有鱼类国家级自然保护区的一种重要经济鱼类，其野生犁头鳅种群资源数量日益下降，本发明技术方案可以对犁头鳅物种进行有效的保护。

具体实施方式

实施例1

取朱杨溪和宜宾犁头鳅各1尾与本发明的犁头鳅DNA条形码序列进行验证。

1.DNA的提取

剪取5mg左右的鱼类肌肉组织，尽可能剪碎，置于1.5ml的离心管中，室温下放置，待乙醇完全挥发干净后采用GENEray公司的细胞/组织基因组试剂盒进行基因组DNA的抽提。

2.PCR扩增

PCR引物采用COI基因在鲤科鱼类中的通用引物，上、下游引物序列分别为：FCOI：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，RCOI：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反应体系总体积为50μl，采用PCR试剂盒进行PCR扩增，具体反应体系见表1，PCR反应程序见表2。

表1 PCR反应体系

反应成分	体积(μl)
		灭菌双蒸水	22
P1	1
		P2	1
基因组DNA模板	1
		2ⅹPCR mix	25

表2 PCR反应程序

步骤	温度	时间
			1.预变性	94℃	5min
2.变性	94℃	30s
			3.退火	58℃	30s
4.延伸	72℃	1min
			5.4to2		循环30次
6.终延伸	72℃	6min

3.琼脂糖凝胶电泳检测

以恒压5V/cm的标准进行对PCR产物进行电泳，当溴酚蓝移到距琼脂糖凝胶前沿约5cm时，停止电泳。取出凝胶，置于EB染色液中浸泡15min，然后用紫外透射仪进行观察。

4.序列测定

经琼脂糖电泳检测目的条带清晰的PCR产物，用离心柱式PCR产物纯化试剂盒进行目的片段的回收纯化后，送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行双向测序。

实施例1中的1尾朱杨溪犁头鳅的COI基因片段为：ACT GCT CTC AGT CTA CTA ATCCGC GCT GAA CTA AAC CAA CCC GGA TCA CTC CTT GGT GAT GAC CAG ATT TAC AAT GTCATT GTC ACT GCC CAT GCT TTT GTT ATA ATT TTC TTT ATA GTA ATG CCT ATT CTC ATTGGA GGC TTT GGC AAC TGA CTA GTG CCC CTA ATA ATT GGG GCC CCG GAT ATG GCA TTCCCA CGA ATG AAC AAC ATA AGC TTC TGA TTA CTA CCA CCA TCT TTC CTT CTA CTC CTGGCC TCA TCT GGT GTA GAA GCC GGG GCA GGG ACG GGA TGA ACC GTT TAC CCG CCA CTAGCA GGC AAC TTA GCC CAC GCG GGG GCA TCC GTA GAC CTA ACT ATC TTC TCC CTA CACTTA GCT GGT GTA TCA TCC ATT TTA GGG GCA ATT AAT TTT ATT ACC ACA ACT ATT AATATA AAA CCC CCA GCC ATC TCC CAA TAT CAA ACG CCG CTA TTT GTG TGA GCC GTC TTAGTA ACA GCA GTC CTT CTC TTA CTC TCC CTA CCA GTC CTA GCA GCC GGA ATT ACA ATGCTT CTA ACA GAC CGA AAC TTA AAC ACA ACA TTC TTT GAC CCC GCA GGA GGA GGA GACCCA ATC CTA TAT CAA CAC TTA TTC TGA TTC TT。

经过对比，与犁头鳅DNA条形码序列相似性度为99.8％，即可以判断该物种为犁头鳅。

实施例2

取宜宾犁头鳅各1尾与本发明的犁头鳅DNA条形码序列进行验证。

1.DNA的提取

2.PCR扩增

3.琼脂糖凝胶电泳检测

4.序列测定

实施例2中的1尾宜宾河内犁头鳅的COI基因片段为：ACT GCT CTC AGT CTA CTAATC CGC GCT GAA CTA AAC CAA CCC GGA TCA CTC CTT GGT GAT GAC CAG ATT TAC AATGTC ATT GTC ACT GCC CAT GCT TTT GTT ATA ATT TTC TTT ATA GTA ATG CCT ATT CTCATT GGA GGC TTT GGC AAC TGA CTA GTG CCC CTA ATA ATT GGG GCC CCG GAT ATG GCATTC CCA CGA ATG AAC AAC ATA AGC TTC TGA TTA CTA CCA CCA TCT TTC CTT CTA CTCCTG GCC TCA TCT GGT GTA GAA GCC GGG GCA GGG ACG GGA TGA ACC GTC TAC CCG CCACTA GCA GGC AAC TTA GCC CAC GCG GGG GCA TCC GTA GAC CTA ACT ATC TTC TCC CTACAC TTA GCT GGT GTA TCA TCC ATT TTA GGG GCA ATT AAT TTT ATT ACC ACA ACT ATTAAT ATA AAA CCC CCA GCC ATC TCC CAA TAT CAA ACG CCG CTA TTT GTG TGA GCC GTCTTA GTA ACA GCA GTC CTT CTC TTA CTC TCC CTA CCA GTC CTA GCA GCC GGA ATT ACAATG CTT CTA ACA GAC CGA AAC TTA AAC ACA ACA TTC TTT GAC CCC GCA GGA GGA GGAGAC CCA ATC TTA TAT CAA CAC TTA TTC TGA TTC TT。

实施例1和实施例2PCR反应体系和PCR反应程序均相同，这样可以更加客观的印证本发明得到的犁头鳅DNA条形码序的准确性。

本发明所得到的犁头鳅DNA条形码序列可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，对犁头鳅特有种高效和准确的进行鉴定和分类，其准确率达到99.5％以上。在实际操作中，该犁头鳅DNA条形码便于保存且完整性极强。犁头鳅作为长江上游珍稀、特有鱼类国家级自然保护区的一种重要经济鱼类，其野生犁头鳅种群资源数量日益下降，本发明技术方案可以对犁头鳅物种进行有效的保护。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SWQMENCE LISTINE

<110> 江汉大学

<120> 一种犁头鳅DNA条形码序列及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 623

<212> DNA

<213> 犁头鳅（Lepturichthys fimbriata）DNA条形码序列

<400> 1

ACTGCTCTCAGTCTACTAATCCGCGCTGAACTAAACCAACCCGGATCACTCCTTGGTGAT 60

GACCAGATTTACAATGTCATTGTCACTGCCCATGCTTTTGTTATAATTTTCTTTATAGTA 120

ATGCCTATTCTCATTGGAGGCTTTGGCAACTGACTAGTGCCCCTAATAATTGGGGCCCCG 180

GATATGGCATTCCCACGAATGAACAACATAAGCTTCTGATTACTACCACCATCTTTCCTT 240

CTACTCCTGGCCTCATCTGGTGTAGAAGCCGGGGCAGGGACGGGATGAACCGTCTACCCG 300

CCACTAGCAGGCAACTTAGCCCACGCGGGGGCATCCGTAGACCTAACTATCTTCTCCCTA 360

CACTTAGCTGGTGTATCATCCATTTTAGGGGCAATTAATTTTATTACCACAACTATTAAT 420

ATAAAACCCCCAGCCATCTCCCAATATCAAACGCCGCTATTTGTGTGAGCCGTCTTAGTA 480

ACAGCAGTCCTTCTCTTACTCTCCCTACCAGTCCTAGCAGCCGGAATTACAATGCTTCTA 540

ACAGACCGAAACTTAAACACAACATTCTTTGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCAATCCTA 600

TATCAACACTTATTCTGATTCTT 623

Claims

1.一种犁头鳅DNA条形码序列，其特征在于，序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的犁头鳅DNA条形码序列，其特征在于，所述犁头鳅DNA条形码为犁头鳅COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。

3.一种犁头鳅DNA条形码序列的应用，其特征在于，该DNA条形码序列可以作为犁头鳅DNA的标准检测序列，有效的对犁头鳅特有种进行鉴定。