CN109706236A - 一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法，该方法包括如下步骤：(1)交联植物材料；(2)提取纯化植物材料的细胞核；(3)不同浓度的MNase酶切消化细胞核；(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测MNase酶切效果；(5)选取合适的MNase酶切细胞核DNA再次进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序；(6)对测序数据进行生物信息学分析，鉴定全基因组MH位点。整个方法流程简单，耗时较短，一个周期大约需要2.5天，酶切效果可视化效果强，适合应用于多数植物物种。可直接用于鉴定功能性DNA元件的核心区域。

Description

一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的新方法。

背景技术

在动植物基因组中，根据染色质结构可将全基因组染色质分成两大类：一类是开放性染色质，该区域核小体丰度较低甚至无核小体结构存在；另一类为封闭性染色质，该区域具有明显的或较高丰度的核小体存在。与封闭性染色质相比，开放性染色质区通常含有处于一系列不同表达状态的功能基因或功能性DNA调控元件，如启动子和增强子等。开放性染色质对真核生物正常的生长发育、组织器官的分化以及对内外界环境因子应答等具有十分重要的调节作用。因此，开放性染色质位点的鉴定，既有利于挖掘基因组中各类重要功能的DNA调控序列，同时又有利于解析动植物基因组内基因表达调控的分子机理。

核小体是动植物基因组中染色质的基本结构单元，主要由双链DNA、蛋白质和RNA等分子组成的一种致密结构。组蛋白是由2个H3-H4二聚体，2个H2A-H2B二聚体形成的八聚体。在细胞核内，组蛋白八聚体和146bp双链DNA结合形成核小体核心区。DNA暴露在核小体表面或者无核小体保护的DNA容易受一些物理或生物化学因子如核酸酶等接近并切割。理论上，任何能有效区分基因组中核小体区(封闭性染色质)和无核小体区(开放性染色质)的技术和方法均可用于鉴定开放性染色质位点。目前，在动植物中广泛应用的方法主要有基于DNase I(脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶)的DNase-seq(脱氧核糖核酸酶I酶切测序法)方法，基于超声波的FARIE-seq(调控元件的甲醛辅助分离测序法)方法和基于转座子插入的ATAC-seq(转座酶可接触性染色质测序分析法)方法等。相关鉴定方法在原理上均十分相似，无论是酶切、超声波还是转座酶，在一定条件下，它们对开放性染色质区DNA进行切割或片段化效率要明显高于封闭性染色质区DNA，因此在一定处理条件下，实现了开放性染色质区DNA的有效分离，结合第二代高能量测序以及生物信息学分析，最终在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。

微球菌核酸酶(micrococcal nuclease,MNase)是一种非特异性的核酸内切酶和核酸外切酶。它特异切割核小体连接区DNA，而核小体相关的DNA因被核小体组蛋白保护而不被切割降解，因此，微球菌核酸酶处理细胞核中染色质能分别产生核小体和无核小体区(开放性染色质区)相关的DNA片段。如能有效分离开放性染色质区相关的DNA片段，同时结合第二代高能量测序以及生物信息学分析，最终在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。这是我们本发明(RE-MNase-seq，调控序列相关的微球菌核酸酶酶切测序法)的主要理论和技术基础。

与本发明(RE-MNase-seq)方法最接近的现有技术主要是DNase-seq。目前DNase-seq主要有两种方法，主要区别在于，在细胞核提取和一系列DNase I酶切消化后，一种方法对酶切后产生的较大的基因组DNA片段进行单端测序(DNase-seq-I)，对测序结果进行生物信息学分析，通过确定DNase I酶切切点的方式来鉴定DNase I超敏感位点(DH位点)，又称为开放性染色质位点。另一种方法主要通过分离酶切后产生的小片段DNA(100-300bp),进行单端或双端测序(DNase-seq-II)，对测序结果进行生物信息学分析，通过确定酶切片段位点的方式来鉴定DNase I超敏感位点，又称为开放性染色质位点。DNase-seq-I主要方法步骤如图1所示，它主要包括以下几个关键步骤(图1DNase-seq-I主要技术流程图(Boyleet al.,2008,Cell,132:311-322))：1.提取并纯化细胞核；2.用一系列不同的DNase I酶切纯化细胞核；3.低熔点琼脂糖凝胶包埋；4.对包埋有酶切的细胞核的胶块进行脉冲场电泳分离检测；5.选取合适酶切的包埋胶块对酶切末端进行钝化处理；6.提取末端钝化的基因组DNA；7.连接上带有生物素标记的接头I；7.通过琼脂糖凝胶电泳去除多余的未与基因组DNA连接的接头I；8.用限制性内切酶Mme I将DNA进行片段化处理并抽提DNA；9.用特异性识别生物素标记的磁珠捕获连接有接头I的基因组DNA片段；10.磁珠捕获到的基因组DNA片段再连接上接头II，并用NaOH进行碱化处理；11.对连接上双接头的基因组DNA片段进行PCR扩增；12.对PCR扩增产物进行PAGE胶分离纯化100bp左右的DNA片段；13.对纯化的100bp左右的DNA片段文库进行质量检测；14.对质检合格的文库第二代高通量测序。15.对测序结果进行生物信息学分析，在全基因组水平鉴定DH位点，又称为开放性染色质位点。

DNase-seq-II主要方法步骤如图2所示，它主要包括以下几个关键步骤(图2DNase-seq-II主要技术流程图(Mercer et al.,2013,Nat Genet,45:852-859))：1.提取并纯化细胞核；2.用一系列不同的DNase I酶切纯化细胞核；3.提取DNase I酶切基因组DNA；并进行蔗糖密度梯度离心；4.选取合适酶切的基因组DNA回收100-300bp DNA片段；5.对回收DNA片段进行测序文库构建；6.纯化的200-400bp左右的DNA片段文库进行质量检测；7.对质检合格的文库第二代高通量测序。8.对测序结果进行生物信息学分析，在全基因组水平鉴定DH位点，又称为开放性染色质位点。

目前，这两种DNase-seq方法已广泛应用于人和动物基因组中开放性染色质位点的鉴定，但用于植物基因组中开放性染色质位点的鉴定的成功案例还不是十分多见。因此，发展一种广泛适用于鉴定植物基因组中开放性染色质位点的新方法就十分重要。

目前，DNase-seq-I方法过程繁锁，整个过程耗时长，成本高，还需要有一定染色质研究经验的研究者才可以掌握，不利于该方法植物研究领域的普遍推广；另外，该方法需要脉冲场电泳仪设备，这样限制了该方法在实验条件有限的实验室中应用。特别重要的是，该方法所产生文库的插入片段只有20bp左右，对测序平台的兼容性差，并且在比较复杂基因组的植物物种如玉米和小麦等适用性差。与DNase-seq-I方法相比，DNase-seq-II方法过程相对简单，并且所产生文库的插入片段在100-300bp左右，但该方法需要蔗糖密度梯度离心，此过程比较复杂，也需要有一定工作经验的研究者来进行操作，影响了该方法植物研究领域的普遍推广；另外，该方法没有明确适于建库的酶切效果，在不同实验室或不同的操作人员，选取用于建库的酶切浓度具有很大的随机性，这样导致数据质量高度不一致性。因此，目前该方法在植物基因组中的应用也非常有限。ATAC-seq目前主要在人和动物基因组中应用非常广泛，但在植物基因组中的应用也非常有限，主要是该方法对植物细胞的均一性要求非常高，而植物组织通常都是由很多细胞类型组成的混合体，需要利用流式细胞仪对细胞进行分选，来保证细胞的均一性，因此限制该方法了在实验条件有限的实验室中应用。同时，该方法成功率偏低，增加了实验成本。另一方面，上述三种方法均不能用来直接鉴定功能性DNA元件的核心序列。

因此，发展一种广泛适用于鉴定植物基因组中开放性染色质位点的新方法就十分迫切和必要。

发明内容

针对背景技术指出的现有几种方法在植物研究中的缺点，本发明的目的在于提供一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的新方法。该方法是一种在不同植物物种中适用强，对酶切效果易于判断，DNA分离纯化相对简单，易被多数相关研究的实验室或操作者所掌握，并且可直接用于鉴定功能性DNA元件的核心序列的新方法，该方法是基于MNase酶切测序，简称为RE-MNase-seq。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法，该方法包括如下步骤：

(1)交联植物材料；

(2)提取纯化植物材料的细胞核；

(3)不同浓度的MNase酶切消化细胞核；

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测MNase酶切效果；

(5)选取合适的MNase酶切细胞核DNA再次进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序；

(6)对测序数据进行生物信息学分析，鉴定全基因组MH位点。

作为一种优选技术方案，步骤(1)中交联植物材料的过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联；再向交联液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理，最后得到交联的植物材料；将交联的植物材料清洗干燥后，用锡铂纸包裹于液氮中速冻后将叶片取出于-80℃保存待用。

进一步优选的，步骤(1)中将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下4℃交联8～12分钟；向交联液中加入甘氨酸溶液后在4℃条件下真空处理3～7分钟。

所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。

作为一种优选技术方案，步骤(2)中提取纯化植物材料细胞核的过程为：将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后，往粉末中加入等体积核提取缓冲液，搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃去上清，再加入细胞核清洗液重悬细胞核离心弃上清液对细胞核进行纯化，重复纯化直到细胞核为白色或淡黄色，用MNase酶切缓冲液重悬细胞核，离心后弃尽上清，保留沉淀得到纯化的细胞核。

作为一种优选技术方案，步骤(3)中MNase酶切消化细胞核的过程为：将纯化后的细胞核重悬于MNB缓冲液中，然后加入不同浓度的MNase，于37℃水浴中孵育得到反应液；向反应液中加入0.5M EDTA(pH 8.0)终止MNase酶切反应，同时加入解交联试剂，于65℃水浴反应过夜进行解交联反应；第二天向反应液中加入RNase A，于37℃水浴中孵育，然后再加入proteinase K，于55℃水浴中孵育；用等体积的酚、酚仿(1:1)和仿抽提后保留上清液并加入Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置后离心沉淀DNA，将DNA沉淀清洗干燥后，用EB溶解DNA。

进一步优选的，所述解交联试剂的配方为：16μl 5M NaCl，8μl 20％SDS和160μl1xTE。

作为一种优选技术方案，步骤(5)中回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序的过程为：回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-450bp DNA片段用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。

所述的交联固定液、核提取缓冲液(NEB)、细胞核清洗液(NWB)、MNase酶切缓冲液(MNB)的配方见表1。

表1核提取缓冲液的配方

MNase：微球菌核酸酶；MNB：微球菌核酸酶酶切缓冲液；NEB：细胞核提取缓冲液；NWB：细胞核清洗缓冲液；RNase A：核糖核酸酶A；Proteinase K：蛋白酶K；Glycogen：糖元；Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷；pH:酸碱度；KCl：氯化钾；CaCl2：氯化钙；MgCl2：氯化镁；HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；EDTA：乙二胺四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；Spermidine；亚精胺；spermine：精胺；Glycerol:甘油；Mercaptoethanol：巯基乙醇；Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚；mM：毫摩尔；M:摩尔；TE：三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸配置成的缓冲液；Sequencing：测序；bp：碱基对。

本发明所述方法最优选技术方案的详细步骤为：

(1)植物材料交联

选取2-5g需要供试的实验材料(小麦、玉米、水稻或拟南芥)，剪成碎片浸泡于交联固定液中，在真空条件于4℃交联10分钟。

向交联液中加入2.5M的甘氨酸溶液成终浓度为125mM，在4℃条件下真空处理5分钟。

弃去所有交联液，用灭菌的蒸馏水冲洗三次，将所有叶片置于吸水纸上，于空气中干燥10分钟，待所有叶片表面水份吸干后，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后于液氮中速冻10分钟，将叶片取出放置于-80℃冰箱中保存待用。

(2)提取纯化植物材料的细胞核：将交联后的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml的粉末提取细胞核。往粉末中加入等体积核提取缓冲液(NEB)，搅拌成匀浆后离心管平放于冰上100rpm摇晃6分钟。

将匀浆过滤于一个新的50ml离心管中，3,000rpm升降速为8离心12分钟。弃去上清，加入200μl细胞核清洗液(NWB)，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用NWB冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同一个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀三至五次，3,000rpm升降速为8离心12分钟，重复该步骤三次，直到细胞核为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。

用5ml的MNase酶切缓冲液(MNB)重新悬细胞核，3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。

(3)不同浓度的MNase酶切消化细胞核：将纯化后的细胞核重新悬浮于1.2ml MNB缓冲液中，平均分装于6个1.5ml离心管中，每管200μl，然后分别加入不同浓度的MNase，于37℃水浴中孵育10分钟，每3分钟取出上下颠倒混匀5次，再放入37℃水浴中，共孵育10分钟。

向每管反应液中加入16μl 0.5M EDTA(pH 8.0)终止MNase酶切反应，同时加入16μl 5M NaCl，8μl 20％SDS和160μl 1xTE于65℃水浴反应过夜进行解交联反应。

第二天向每管反应液中分别加入2μl RNase A，于37℃水浴中孵育30分钟，然后加入5μl proteinase K，于55℃水浴中孵育2小时。

分别用等体积的酚、酚仿(1:1)和仿抽提3次，保留上清液并加入20μg Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱放置1小时沉淀DNA，离心后DNA沉淀于70％酒精清洗后，于空气中干燥5分钟，用20μl EB溶解DNA。

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测MNase酶切效果。

(5)选取合适的酶切DNA(例如小麦和玉米为60U酶切DNA)，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-450bp DNA片段用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。

(6)对测序数据进行生物信息学分析，鉴定全基因组MH位点：对测序数据进行质控分析，初步质量分析结果显示，小麦全基因组比对率为97.32％，Q20的比对率为64％-69％，说明数据质量可靠，可用于小麦全基因组开放性染色质位点的鉴定和功能分析。初步共鉴定100,000位点，通过与基因表达的关系进行关联分析，发现在全基因组水平，MH位点与基因表达呈相关性。整个方法流程图如图11。

与现有的方法相比，本发明具有以下优点：

(1)整个方法流程简单，与DNase-seq-II方法相似，耗时较短，一个周期大约需要2.5天，而DNase-seq-I方法一个周期大约需要7天。(2)每步操作不需要特殊仪器设备。(3)酶切效果可视化效果强，有一个相比明确的判断标准，实验结果在同一个或不同的操作者间易重复。(4)适合应用于多数植物物种。(5)可直接用于鉴定功能性DNA元件的核心区域。(6)本发明可在不同实验室广泛应用和推广。

附图说明

图1.DNase-seq-I主要技术流程图(Boyle et al.,2008,Cell,132:311-322)。

图2.DNase-seq-II主要技术流程图(Mercer et al.,2013,Nat Genet,45:852-859)。

图3.MNase酶切小麦细胞核DNA的琼脂糖电泳检测结果。

图4.MNase酶切玉米细胞核DNA的琼脂糖电泳检测结果。

图5.MNase酶切水稻细胞核DNA的琼脂糖电泳检测结果。

图6.MNase酶切拟南芥细胞核DNA的琼脂糖电泳检测结果。

图7.MNase酶切小麦细胞核DNA片段回收。

图8.Illumina测序文库的胶图。

图9.小麦MH位点的可视化图。

图10.小麦MH位点与基因表达的关系分析结果。

图11.MH方法主要步骤流程图。

图12.玉米MH位点与基因表达的关系分析结果。

图13.玉米MH位点的可视化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1

(1)植物材料交联：

选取2-5g需要供试的实验材料(小麦、玉米、水稻或拟南芥叶片)，剪成一定大小的碎片浸泡于终浓度为交联固定液中，在真空条件于4℃交联10分钟。

向交联液中加入2.5M的甘氨酸溶液成终浓度为125mM，在4℃条件下真空处理5分钟。

弃去所有交联液，用灭菌的蒸馏水冲洗三次，将所有叶片置于吸水纸上，于空气中干燥10分钟，待所有叶片表面水份吸干后，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后于液氮中速冻10分钟，将叶片取出放置于-80℃冰箱中保存待用。

(2)提取纯化植物材料的细胞核：

将固定好的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml的粉末提取细胞核。往粉末中加入等体积核提取缓冲液(NEB)，搅拌成匀浆后离心管平放于冰上100rpm摇晃6分钟。

将匀浆过滤于一个新的50ml离心管中，3,000rpm升降速为8离心12分钟。弃去上清，加入200μl细胞核清洗液(NWB)，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用NWB冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同一个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀三至五次，3,000rpm升降速为8离心12分钟，重复该步骤三次，直到细胞核为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。

用5ml的MNase酶切缓冲液(MNB)重新悬细胞核，3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。

(3)不同浓度的MNase酶切消化细胞核：

将纯化后的实验材料的细胞核重新悬浮于1.2ml MNB缓冲液中，平均分装于6个1.5ml离心管中，每管200μl，然后如图3-6所示，分别加入不同浓度的MNase，于37℃水浴中孵育10分钟，每3分钟取出上下颠倒混匀5次，再放入37℃水浴中，共孵育10分钟。

向每管反应液中加入16μl 0.5M EDTA(pH 8.0)终止MNase酶切反应，同时加入16μl 5M NaCl，8μl 20％SDS和160μl 1xTE于65℃水浴过夜反应进行解交联反应。

第二天向每管反应液中分别加入2μl RNase A，于37℃水浴中孵育30分钟，然后加入5μl proteinase K，于55℃水浴中孵育2小时。

分别用等体积的酚、酚仿(1:1)和仿抽提3次，保留上清液并加入20μg Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱放置1小时沉淀DNA，DNA沉淀于70％酒精清洗后，于空气中干燥5分钟，用20μl EB溶解DNA。

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测MNase酶切效果(如图3-6所示)。

(5)选取合适的酶切DNA(如60U酶切DNA)，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库(图7)，分离纯化200-450bp DNA片段(图8)用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。

(6)对测序数据进行生物信息学分析，鉴定全基因组MH位点。整个方法流程图见图11。

实验结果显示：

(1)分别加入不同浓度的MNase(0U，20U，60U，100U，200U，500U)对小麦细胞核酶切，不同MNase对小麦细胞核酶切效果检测如图3所示，随着MNase酶切浓度的增加，150bp和300bp的条带亮度在逐渐增加，主带大小也在逐渐变小，60U浓度的MNase酶切小麦细胞核效果最佳。

(2)分别加入不同浓度的MNase(0U，20U，60U，100U，200U，500U)对玉米细胞核酶切，不同MNase对玉米细胞核酶切效果检测如图4所示，随着MNase酶切浓度的增加，150bp和300bp的条带亮度在逐渐增加，主带大小也在逐渐变小，60U浓度的MNase酶切玉米细胞核效果最佳。

(3)分别加入不同浓度的MNase(0U，0.01U，0.03U，0.1U，0.5U，1.2U，1.5U)对水稻细胞核酶切，不同MNase对水稻细胞核酶切效果检测如图5所示，随着MNase酶切浓度的增加，150bp和300bp的条带亮度在逐渐增加，主带大小也在逐渐变小。

(4)分别加入不同浓度的MNase(0U，0.01U，0.03U，0.05U，0.08U)对拟南芥细胞核酶切，不同MNase对拟南芥细胞核酶切效果检测如图6所示，随着MNase酶切浓度的增加,150bp和300bp的条带亮度在逐渐增加，主带大小也在逐渐变小。

实施例2 RE-MNase-seq鉴定小麦全基因组开放性染色质位点

选取60U MNase酶切小麦细胞核DNA，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库(图7)，分离纯化200-450bp DNA片段(图8)用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。

对测序数据进行质控分析，结果如表2所示。初步质量分析结果显示，小麦全基因组比对率为97.32％，Q20的比对率为64％-69％，说明数据质量可靠，可用于小麦全基因组开放性染色质位点的鉴定和功能分析。初步共鉴定100,000位点(图9)，通过与基因表达的关系关联分析，发现在全基因组水平，MH位点与基因表达呈相关性(图10)。

表2.小麦MH数据质控结果

实施例3 RE-MNase-seq鉴定玉米全基因组开放性染色质位点。

选取60U MNase酶切玉米细胞核DNA，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-450bpDNA片段用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。

对测序数据进行质控分析，初步质量分析结果显示，玉米全基因组比对率为94.50％，Q20的比对率为45％，说明数据质量可靠，可用于玉米全基因组开放性染色质位点的鉴定和功能分析。初步共鉴定40,000位点(图13)，能过与基因表达的关系进行关联分析，发现在全基因组水平，MH位点与基因表达呈相关性(图12)。

该技术方法是利用微球菌核酸酶对核小体连接区DNA进行特异性酶切特性，有选择性收集部分酶切片段进行构建文库并测序，通过序列比对，在全基因组中鉴定出无核小体区域，而这些对微球菌核酸酶敏感的区域同样属于开放性染色质区域。

九、相关技术术语的名词解释

交联固定液：用于固定染色质上蛋白质和DNA的一种缓冲溶液。

核提取缓冲液(NEB)：用于提取细胞核的缓冲溶液。

核清洗液(NEB)：用于纯化细胞核。

MNase：微球菌核酸酶，一种特异降解核小体连接区DNA的核酸内切酶。

转座酶：具有转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点。

RNaseA：一种降解RNA的核糖核酸酶。

Proteinase K：蛋白酶K,主要降解蛋白质。

开放性染色质:是指真核生物基因组中，部分染色质DNA处于祼露状态，易于被一些调控或功能蛋白识别并结合，该区域称为开放性染色质位点，多数开放性染色质位点含有功能性DNA调控元件，对基因表达具有十分重要的调控作用。

核小体：由DNA和组蛋白形成的染色质基本结构单位，每个核小体由146bp的双链DNA缠绕组蛋白八聚体1.75圈形成。

琼脂糖凝胶电泳：用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，根据蛋白质和核酸pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，在凝胶上跑的速度不同而将其分开。

Illumina测序文库：基于第二代DNA测序技术而建立的DNA文库。

PCR：又称多聚酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

Claims (9)

1.一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)交联植物材料；

(2)提取纯化植物材料的细胞核；

(3)不同浓度的MNase酶切消化细胞核；

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测MNase酶切效果；

(5)选取合适的MNase酶切细胞核DNA再次进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序；

(6)对测序数据进行生物信息学分析，鉴定全基因组MH位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中交联植物材料的过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联；再向交联液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理，最后得到交联的植物材料；将交联的植物材料清洗干燥后，用锡铂纸包裹于液氮中速冻后将叶片取出于-80℃保存待用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下4℃交联8～12分钟；向交联液中加入甘氨酸溶液后在4℃条件下真空处理3～7分钟。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的交联固定液包括：50mM HEPESpH7.5、1mM EDTA(pH8.0)、0.1M NaCl、1mM PMSF和1％甲醛；所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取纯化植物材料细胞核的过程为：将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后，往粉末中加入核提取缓冲液，搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃去上清，再加入细胞核清洗液重悬细胞核离心弃上清液对细胞核进行纯化，重复纯化直到细胞核为白色或淡黄色，用MNase酶切缓冲液重悬细胞核，离心后弃尽上清，保留沉淀得到纯化的细胞核。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核提取缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mM spermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol；所述细胞核清洗液的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mMSpermidine、0.15mM spermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol、0.5％Triton X-100；所述MNase酶切缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl pH7.5、15mM NaCl、60mM KCl、1mMCaCl2、4mM MgCl2。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中MNase酶切消化细胞核的过程为：将纯化后的细胞核重悬于MNB缓冲液中，然后加入不同浓度的MNase，于37℃水浴中孵育得到反应液；向反应液中加入0.5M EDTA(pH 8.0)终止MNase酶切反应，同时加入解交联试剂，于65℃水浴反应过夜进行解交联反应；第二天向反应液中加入RNase A，于37℃水浴中孵育，然后再加入proteinase K，于55℃水浴中孵育；用等体积的酚、酚仿(1:1)和仿抽提后保留上清液并加入Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置后离心沉淀DNA，将DNA沉淀清洗干燥后，用EB溶解DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述解交联试剂的配方为：16μl 5M NaCl，8μl 20％SDS和160μl 1xTE。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序的过程为：回收50-280bp中不含有150bp的所有DNA片段用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-450bp DNA片段用于Illumina Nova-seq测序平台进行2x150PE测序。