CN116254323B - 一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒，该方法包括取植物叶肉细胞在交联缓冲液中进行处理，然后经研磨、过滤得到细胞核；将细胞核经通透处理后加入酶切反应液，得到平末端DNA序列，进一步进行加尾反应；加入连接反应体系，完成反应后加入外切酶处理；解交联后纯化DNA进行测序。本发明的方法简化了细胞核的提取步骤，并且只需要一轮消化和连接就可以完成主要实验。此外，本发明的方法与传统高通量染色质构象捕获技术相比信号值更高，背景噪音也更低，这增强了其检测染色质相互作用的可靠性和准确性。

Description

一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及三维基因组领域，具体地涉及植物的基因组结构、基因调控和基因组组装，特别涉及一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒。

背景技术

真核细胞核中的DNA的空间结构影响着基因转录、DNA复制和其他功能。染色体构象捕获的方法大大促进了对染色体三维结构的理解。高通量染色体构象捕获可以同时获得所有的互作位点，通过高通量测序形成一个全基因组的互作图谱。在哺乳动物中获得高分辨的互作图谱后，发现了基因组三维空间结构的层次结构特征，如染色体领地(CT)、核斑点、染色质区室、拓扑关联域(TADs)、染色质环和条带。尽管高通量染色体构象捕获技术在揭示三维基因组的结构方面有很大的潜力，但复杂的实验流程和高背景噪音限制了其广泛的应用。

为了解决上述问题，最近在哺乳动物中开发了几种新型的高通量染色体构象捕获方法，例如使用特定的探针来捕获与目标区域相关的片段；目标蛋白特异性抗体在消化和连接后沉淀出DNA-蛋白复合物；使用两轮酶切和连接来完成主要的实验过程；利用Tn5转座酶和染色质就近连接来分析开放染色质锚定的互作。这些新型的技术在哺乳动物中的应用发现了许多通过远距离相互作用调节基因表达的顺式调控元件，从而扩展了对三维基因组学的理解。

研究发现染色体占据了一个相对固定的核区域，被称为染色体区域(CT)，它显示了不同的形态，如Rabl、Rosette和Bouquet。通过构建三维基因组模型，研究人员发现水稻的三维基因组特征为非Rabl构象。基于热图，小麦和大麦的端粒和中心粒被发现聚集在相反的细胞核位置，反映了Rabl的构象。在拟南芥中，热图显示着丝粒区域互作较强，而常染色质向外代表Rosette构象，该结果也被基因组荧光原位杂交(GFISH)所证实。Bouquet构型是减数分裂的一个普遍特征，所有端粒都聚集在细胞核一极，有利于染色体配对和减数分裂重组。对染色质结构的空间分布的研究有助于对基因组功能和基因表达的理解。白菜是经济上最重要的芸苔属物种之一，在世界范围内主要作为一种蔬菜作物栽培。然而，白菜染色质结构的构象在很大程度上仍然是未知的。

传统的高通量染色体构象捕获是研究植物三维基因组的主要方法。由于高通量染色体构象捕获的近距离连接策略，在这个过程中可能会产生噪声。从高噪声的数据中提取可靠的远端相互作用通常需要深度测序和大量的生物信息学工作。因此，高噪声也阻碍了三维植物基因组学的发展。此外，传统的高通量染色体构象捕获通常需要大量的起始材料(3-5g叶片)，使得建立一个库的成本更高，对多个样品来说不可行。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，尤其是解决现有技术中常规高通量染色质构象捕获技术复杂的实验流程和高背景噪音问题，本发明提供一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒，通过优化桥式连接开发了一种能够用于研究植物的三维基因组的简单而有效的方法。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其包括以下步骤：

(1)取植物叶肉细胞在交联缓冲液中进行处理，然后经研磨、过滤得到细胞核；

(2)将细胞核经通透处理后加入酶切反应液，得到平末端DNA序列，进一步进行加尾反应；

(3)加入连接反应体系，完成反应后加入外切酶处理，其中，所述反应体系包含连接子和连接酶，所述连接子为双链结构且具有突出的胸腺嘧啶；

(4)解交联后纯化DNA进行测序。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，所述植物叶肉细胞的样本起始量低于0.1g。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，所述交联缓冲液包含10-40mM的Hepes、100-400mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45％甘油、0.01-2％的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2％的2-巯基乙醇、0.1-10％甲醛和0.01-2M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，步骤(1)中，所述研磨通过研磨机进行，其参数包括30-90秒、30-90赫兹、2-8个循环。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，步骤(2)中，所述酶切反应液包含CutSmart Buffer、Hae III限制性内切酶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，步骤(2)中，使用0.01-2％的SDS在40-70℃孵育进行所述通透处理。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，步骤(2)中，加尾反应体系包括：5-15mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，步骤(3)中，用于外切酶处理的反应体系包括：Lambda外切酶缓冲液、Lambda外切酶、外切酶I。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其中，所述植物包括双子叶植物、单子叶植物，优选十字花科植物。

本发明的第二方面，提供一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的试剂盒，其包括：

(I)用于交联的试剂，其包含10-40mM的Hepes、100-400mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45％甘油、0.01-2％的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2％的2-巯基乙醇、0.1-10％甲醛和0.01-2M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)；

(II)用于酶切的试剂，其包含CutSmart Buffer、Hae III限制性内切酶；

(III)用于加尾的试剂，其包括：5-15mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶；

(IV)用于桥式连接的试剂，其包含连接子和连接酶。

本发明的方法首先简化了细胞核的提取步骤，并且只需要一轮消化和连接就可以完成主要实验。此外，本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术相比信号值更高，背景噪音也更低，这增强了其检测染色质相互作用的可靠性和准确性。本发明进一步评估了该方法在低投入的潜力，发现本发明的方法适合于100mg的叶片组织。通过模拟十字花科(如白菜)叶细胞的三维基因组结构发现其属于Bouquet构象。因此，本发明的方法可以用于对植物的基因组结构、基因调控和基因组组装的研究。

附图说明

图1为本发明方法的示意图。其中细胞核提取过程包括双交联、研磨和裂解、过滤和再悬浮(A)。本发明的方法、低样本量的本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术的效率比较(B)。顺式互作是指染色体内的相互作用，反式互作是指染色体间的相互作用。本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术中染色质互作频率(y轴)与线性基因组距离(x轴)的关系(C)。

图2示出了本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术的结果比较。其中，使用传统高通量染色质构象捕获技术、本发明的方法和低投入产生的数据构建的热图(A)。整个基因组的分辨率被设定为500Kb，A08染色体为150Kb，局部区域为20Kb。本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术之间的区室和TAD的重叠(B)。部分基因组浏览器图像显示本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术在A01上检测的TAD结构(C)。

图3为本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术检测到的峰值周围的相互作用信号分布。染色体A01的局部区域的相互作用信号(A)。维恩图显示两个生物重复的重叠峰(B-C)。百分比是由共同峰除以平均峰计算的。Boxplots显示落在峰上的读数和峰的-log(q值)(D-E)，(n＝1000)。峰周围信号富集的元图(F)。随机选择的区域被作为背景。

图4为本发明的方法和低样本量的本发明的方法检测到的峰的比较。染色体A01的局部区域的相互作用信号(A)。峰周围信号富集的图谱(B)。随机选择的区域被作为背景。不同数据集的峰值(n＝144,832)位点之间的峰值强度散点图(C)。R值是Spearman的相关系数。

图5为重建的白菜三维基因组。白菜基因组的三维结构，有独立的染色体区域的扩展视图(A)。在白菜三维基因组中十个染色体的端粒和着丝粒的空间分布(B)。每个像素相当于十个千碱基对。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。本发明中，传统染色质构象信息分析方法是指叶片起始量较大，例如通常为3-5g，并且使用手动研磨的方式破坏细胞壁的方法。

用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法

本发明的一个方面，提供了一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，本文有时简称为“本发明的方法”，其包括步骤(1)-(4)：

(1)取植物叶肉细胞在交联缓冲液中进行处理，然后经研磨、过滤得到细胞核；

(2)将细胞核经通透处理后加入酶切反应液，得到平末端DNA序列，进一步进行加尾反应；

(3)加入连接反应体系，完成反应后加入外切酶处理，其中，所述反应体系包含连接子和连接酶，所述连接子为双链结构且具有突出的胸腺嘧啶；

(4)解交联后纯化DNA进行测序。下面进行详细说明。

本发明的步骤(1)为从植物来源的叶肉细胞中获取细胞核的步骤。植物可以是任何来源的植物，对此不特别限定，例如植物可以是任何双子叶植物、单子叶植物。在具体实施方案中，植物为选自十字花科的植物。十字花科的植物的实例包括但不限于油菜、青菜、甘蓝、大白菜、甘蓝、花椰菜、西兰花、擘蓝、萝卜、诸葛菜、菥蓂、播娘蒿、拟南芥等等。

本发明的方法中，叶肉细胞来源于叶片组织，叶片的量不特别限定，但本发明特别适用于低起始量和多样本(即高通量)的叶片。因此，在一个优选的实施方案中，叶片的起始量可以高于0.1g，例如0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g。在另一个优选的实施方案中，叶片的起始量低于0.1g，例如低于0.09、0.08、0.07、0.06、0.05g，甚至低于0.05g，例如低于0.04、0.03、0.02、0.01g。

在破碎叶片之前，本发明的方法首先在交联缓冲液中进行交联细胞核处理。交联缓冲液包含10-40mM的Hepes、100-400mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45％甘油、0.01-2％的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2％的2-巯基乙醇、0.1-10％甲醛和0.01-2M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)。优选地，交联缓冲液包含15-30mM的Hepes、150-270mM蔗糖、0.5-2mM的MgCl₂，0.1-1mM的KCl、30-40％甘油、0.1-0.4％的Triton X-100、0.05-0.2mM苯基甲磺酰氟、0.05-0.2％的2-巯基乙醇、2-4％甲醛和0.10-0.3M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)。交联结束后，可以使用氨基酸，例如甘氨酸结束反应，并清洗叶片以去除未反应的交联缓冲液。

本发明的步骤(1)进一步包括将叶片进行研磨、过滤得到细胞核的步骤。研磨过程优选使用研磨机进行处理，本发明发现采用特定参数的研磨机处理能够得到更为有利的染色质构象信息，其原因不清楚，可能在于常规研钵处理不仅破坏细胞核(使其破碎)，而且还会影响交联结构，由此影响得到的构象信息准确性。此外，常规研钵研磨处理还会损失叶片中的细胞核，从而丢失大量的染色质构象信息。优选地，研磨机的参数设置为30-90秒、30-90赫兹、2-8个循环。还优选地，研磨机的参数设置为40-70秒、40-80赫兹、2-6个循环。进一步优选地，研磨机的参数设置为55-65秒、50-70赫兹、2-5个循环。更优选地，研磨机的参数设置为58-62秒、58-62赫兹、2-4个循环。最优选地，研磨机的参数设置为60秒、60赫兹、4个循环。在该参数下，不仅保持细胞核的完整性，同时最大量的保留叶片中的细胞核。

研磨过程中，叶片处于以下缓冲液体系：10-40mM的Hepes、100-400mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45％甘油、0.01-2％的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2％的2-巯基乙醇。优选地，叶片处于以下缓冲液体系：15-30mM的Hepes、150-270mM蔗糖、0.5-2mM的MgCl₂，0.1-1mM的KCl、30-40％甘油、0.1-0.4％的Triton X-100、0.05-0.2mM苯基甲磺酰氟、0.05-0.2％的2-巯基乙醇。

在研磨之后，本发明的步骤(1)仅过滤一次，因此可以大大节省实验步骤和时间。滤液经离心去上清后进行步骤(2)。

本发明的步骤(2)为细胞核通透处理以及酶切过程，从而得到平末端DNA序列，并进一步进行加尾反应。将细胞核悬浮0.1-2％ SDS溶液中，优选0.3-0.8％ SDS溶液，最优选0.5％ SDS溶液，然后在50-70℃孵育1-20min，优选在60-65℃孵育8-15min，同时900rpm震荡，从而破坏细胞核增加核膜的通透性。孵育后结束SDS反应，加入酶切反应液在30-40℃孵育1-20min，优选在35-40℃孵育10-18min，其中，酶切反应液包含CutSmart Buffer、HaeIII限制性内切酶。

酶切反应结束后进行加尾反应，用于加尾反应的体系包括：5-15mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶。优选地，用于加尾反应的体系包括：8-12mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶，同时dATP溶液和大片段DNA聚合酶的体积比为1:1。加尾反应在30-40℃孵育20-60min，优选在35-40℃孵育30-50min。随后进行步骤(3)的就近连接过程。

本发明的步骤(3)目的是通过桥式反应与特定连接子(本文简称为“linker”)进行基因组连接。用于该步骤的连接反应体系包含10×T4 DNA连接酶缓冲液、5-20％的TritonX-100、T4 DNA连接酶和100-400ng/μl的linker(本文有时也称为连接子)。优选地，用于该步骤的连接反应体系包含10×T4 DNA连接酶缓冲液、8-15％的Triton X-100、T4 DNA连接酶和150-300ng/μl的linker。本发明对linker进行了优化，该linker为双链结构且具有突出的胸腺嘧啶。本发明通过研究发现，该linker与后续的特定核酸外切酶，例如λ核酸外切酶组合可以去除只连接到基因组一端的linker。一方面，不仅改善了常规连接方式中效率较低出现超长时间反应的问题，解决了实验周期和不确定性。另一方面，还显著降低了由于linker所产生的背景噪音，增加了染色质构象分析结果准确性。

在一个优选的实施方案中，本发明的linker具有以下序列：F：pCGCGATATC/iBiodT/TATCTGACT，R：pGTCAGATAAGATATCGCGT。

本发明中，连接反应在低温下进行，低温是指12-20℃下孵育1-6h，优选在13-19℃下孵育1-5h，还优选在14-18℃下孵育2-4h。

本发明的步骤(4)为解交联后纯化DNA进行测序的步骤。在连接完成后，得到染色质DNA-蛋白复合物，随后进行去除linker和杂质的过程，这些杂质包括了之前反应过程中的核酸内切酶、连接酶等等，这些杂质不同程度的影响后续建库以及数据分析，因此，需要加入外切酶处理。优选地，用于该步骤中的外切酶包括：Lambda外切酶缓冲液、Lambda外切酶和外切酶I。将混合物在35-40℃下孵育0.5-3小时，优选在36-38℃下孵育1-1.5小时。

DNA纯化步骤不特别限定，可以采用本领域已知的纯化试剂和步骤进行。在具体的实施方案中，采用苯酚、氯仿、异丙醇进行，使用沉淀试剂沉淀DNA后通过一定体积分数的乙醇进行洗涤得到纯化后的DNA。

纯化后的DNA随后进行文库构建和高通量测序过程。本领域技术人员熟知如何进行DNA文库构建和高通量测序过程，对此不特别限定。高通量测序可以采用多种第二代测序平台进行，其包括但不限于Illumina公司的Hiseq2000、454FLX(Roche公司)、SolexaGenome Analyzer和Applied Biosystems公司的SOLID等。

本发明的方法进一步包括对测序数据的数据分析以得到植物的染色质构象信息，本领域技术人员已知如何进行数据过滤、标准化、可视化、三维模型构建等。在研究植物为白菜时，其使用的参考基因组为Brassicarapav3.0。

本领域技术人员可以理解的是，在上述步骤(1)-(4)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。在某些实施方案中，在步骤操作之间后操作之后还包括震荡的操作，例如以500-1500rpm对步骤中的反应液进行震荡。

试剂盒

本发明的另一方面，提供一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的试剂盒，其包括：

(I)用于交联的试剂，其包含10-40mM的Hepes、100-400mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45％甘油、0.01-2％的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2％的2-巯基乙醇、0.1-10％甲醛和0.01-2M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)；

(II)用于酶切的试剂，其包含CutSmart Buffer、Hae III限制性内切酶；

(III)用于加尾的试剂，其包括：5-15mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶；

(IV)用于桥式连接的试剂，其包含连接子和连接酶；

以及可选的用于核酸纯化的试剂、用于建库的试剂等、用于高通量测序的试剂等等。

除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，核酸外切酶、连接酶等)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如酶的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。

实施例

本实施例示例性的以白菜为研究对象，探究了低起始量植物细胞的染色质构象分析，具体如下：

一、实验方法

1、双交联

对于白菜，将每个样品的0.1g材料收集到1.5mL的试管中，加入500μl的核分离缓冲液(20mM Hepes(pH8)、250mM蔗糖、1mM MgCl₂、0.5mM KCl、40％甘油、0.25％ Triton X-100、0.1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)、0.1％2-巯基乙醇)、500μl 4％甲醛(Sigma,#F8775)和10μl 0.15M EGS(Thermo.#21565)浸没叶片。然后将管子抽真空1小时。交联完成后，加入67μl的2M甘氨酸(Sigma，G7126)中和剩余的甲醛，并继续抽真空5分钟。接下来，除去缓冲液/甲醛混合物，用ddH₂O清洗叶片。

2、细胞核提取

用电动研磨机研磨叶片，参数为60秒，60赫兹，4个循环，然后在缓冲液(20mMHepes(pH8)、250mM蔗糖、1mM MgCl₂、0.5mM KCl、40％甘油、0.25％ Triton X-100、0.1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)、0.1％2-巯基乙醇)、500μl4％甲醛(Sigma,#F8775)和10μl 0.15M EGS(Thermo.#21565))中裂解。将混合物转移到新的试管中，用Miracloth(Millipore，#475855)过滤一次。滤液在4℃下以3000g旋转15分钟后，除去上清液。随后，将细胞核重新悬浮在1.3×CutSmart Buffer中，在4℃下以1900g旋转5分钟。

3、细胞核裂解和酶切

细胞核被重新悬浮在50μl 0.5％的SDS中，并在62℃下孵育10分钟，在900r.p.m下摇动。在细胞核裂解后，在管中加入145μl ddH₂O和25μl10％(v/v)Triton X-100以淬灭SDS反应。然后在37℃下轻轻摇动混合物15分钟。然后在每支试管中加入25μl 10×CutSmartBuffer和10μl Hae III(NEB，#R0108L)，在37℃下孵育12小时，以900r.p.m的速度旋转，最后加入2.5μl100mM dATP溶液和2.5μl Klenow Fragment(3′->5′exo-)(NEB,#M0212L)加入到混合物中，在37℃下培养40分钟，900r.p.m旋转。

4、就近连接

在限制性酶消化后，linker(F:pCGCGATATC/iBiodT/TATCTGACT,R:pGTCAGATAAGATATCGCGT)被连接到酶切后的染色质上。在每个试管中，将750μl ddH₂O、120μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液、100μl 10％(v/v)Triton X-100、5μl T4 DNA连接酶(NEB，#M0202L)和4μl 200ng/μl连接剂加入到260μl酶切的染色质中并充分混合。连接完成后，染色质DNA-蛋白复合物在4℃下以3500g离心5分钟，弃去上清液。接着将颗粒重新悬浮在309μlddH₂O、35μl Lambda外切酶缓冲液、3μl Lambda外切酶(NEB，#M0262L)和3μl外切酶I(NEB，#M0293L)。然后将混合物在37℃下以900r.p.m的速度孵化1小时。

5、DNA纯化

近端连接后，在试管中加入45μl 10％SDS和55μl 10mg/ml蛋白酶K(Solarbio，#P1120)，在60℃下孵育约3小时以解除交联。孵化完成后向试管中加入450μl苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，剧烈摇晃，然后以14,000r.p.m离心15分钟。用400μl异丙醇、40μl 3M醋酸钠(pH5.2)和4μl Dr.GenTLE沉淀剂(Takara，#9094)沉淀DNA，并在12000r.p.m下离心15分钟，沉淀的DNA用80％的乙醇洗涤一次，并溶解在40μl 0.1×TE缓冲液中。

6、文库构建

使用Bioruptor(Diagenode)将DNA打断成300-500bp，设置如下。循环数32；开30秒，关30秒。然后用1.2×Ampure XP磁珠(Beckman，#A63881)来纯化DNA片段。在拉下带生物素标记的DNA片段(Thermo，#11205D)后，使用Illumina的DNA文库制备试剂盒(Enzyme，ND608)来完成DNA损伤修复、末端修复、接头连接和PCR文库扩增。经过12个扩增周期后，用1×Ampure XP磁珠纯化DNA产物，进行深度测序。

7、本发明的方法数据的分析

使用ChIA-PET2(v0.9.3)的trimLinker进行过滤，使用HiC-Pro(v3.0.0)将序列与参考基因组(Brassicarapav3.0；http://39.100.233.196:82/download_geno me/Brassica_Genome_data/Brara_Chiifu_V3.0/Brapa_sequence_v3.0.fasta.gz)。筛选出比对质量低的reads(MAPQ<10)，并去除重复。应用ICE方法对不同分辨率(10Kb、20Kb、40Kb、150Kb和500Kb)的相互作用矩阵进行标准化。HiCExplorer(v2.1.4)被用来将矩阵数据转换为h5格式和其他格式，以便进一步分析。使用HiCExplorer对皮尔逊相关系数和相互作用矩阵进行了可视化。将生物重复数据结合起来分析区室和TADs。A/B区间是由Juicer(v1.9.9)以50Kb的分辨率确定。TAD的边界由HiTAD以10Kb的分辨率(v0.4.2)进行分析。峰值由MACS2(v2.2.7.1)以默认参数从有效接触中调用。用CPM进行归一化处理后，通过WashUEpigenome Browser对读数富集情况进行可视化。根据以前对水稻单细胞的研究，选择10千碱基的像素作为Nuc_dynamic(https://github.com/tjs23/nuc_dynamics)分析的参数。随机选择50万个有效的接触点，构建三次三维模型。通过Nuc_dynamic软件(参数：-s 8 210.5 0.2 0.1 0.05 0.02 0.01)计算模拟退火，创建PDB文件，在pymol(v4.60)中查看三维基因组结构。

此外，本发明还设计了以下实验：以正常样本投入量(1-4g)的白菜为研究对象，同时细胞核提取过程中使用液氮研磨方法进行染色质构象信息分析。

二、实验结果

1、染色质构象信息分析方法的开发

传统的染色质构象信息分析(补齐切口后只进行平末端连接，并且没有去除linker步骤)需要至少50万个细胞来鉴定染色体的相互作用。然而，由于从植物中分离出来的细胞核存在杂质，在显微镜下计算细胞核的数量是不可能的。本发明开发了一种半定量的方法，通过使用适量的植物叶片来估计细胞核的数量。结果显示，1g白菜的鲜叶足以获得50万个细胞核。传统的染色质构象信息分析通常需要3-5g的鲜叶。起始材料的减少不仅简化了实验程序，而且可以在1.5mL的试管中在2天内完成实验(图1A)。此外，通过减少反应体积，能够将文库生成的成本降低到每个样品低至92美元，大约是传统染色质构象信息分析的三分之一。

本发明的方法中，引入了双交联剂和细胞核提取步骤。为了提高顺式互作的比例，使用(琥珀酰亚胺琥珀酸)(EGS)和甲醛(FA)作为双交联剂，而不是用FA进行单交联(步骤1，图1A)。本发明的方法最突出的特点之一是核提取步骤。目前的染色质构象信息分析最初是针对人类细胞开发的。由于细胞壁包围着植物细胞的质膜，所以酶和连接物很难穿透细胞核。先前的细胞核分离方案需要大量的材料和大量的时间来完成，因为需要在液氮下手动研磨样品和多个纯化步骤。而本发明通过用电动研磨机研磨叶片(步骤2，图1A)并将过滤步骤从多次减少到一次(步骤3，图1A)来简化细胞核提取程序。在CutSmart缓冲液中重新悬浮后(步骤4，图1A)，按照标准的建库程序细胞核被用来构建文库。本发明的结果表明，细胞核提取方法在植物的染色质构象信息分析中是容易和稳健的。此外，本发明的方法也可用于其他技术，如植物ATAC-seq和CUT&Tag。

为了确保本发明的方法中文库构建的所有步骤都正确进行，对每个步骤的DNA片段进行纯化，并通过凝胶电泳进行分析。使用限制性酶Hae III对染色质进行消化后，观察到典型的DNA片段弥散。将消化的染色质与linker连接后，DNA片段又重新聚集起来。这些结果表明，基因组酶切和近端连接成功完成。

2、通过本发明的方法鉴定的全基因组互作

将本发明的方法应用到白菜上，在两个生物重复中产生了1.65和2.03亿的测序reads。为了进一步评估本发明的方法，本发明比较了由传统高通量染色质构象捕获技术和本发明的方法产生的白菜的三维基因组数据，使用相同的流程进行数据分析。经过比对和数据过滤，在本发明的方法中获得了2880万和3870万有效数据(具有双末端的非冗余读数被映射到不同的酶切片段)。有效数据相对于总的测序reads的比例为18％，该比例高于传统高通量染色质构象捕获技术(图1B)。在将读数比对到基因组并过滤低质量读数(MAPQ<10)后，本发明的方法的唯一比对reads的比率(～30％)明显高于传统高通量染色质构象捕获技术(～12％)。这一发现表明，linker连接可以帮助分割嵌合片段，从而提高比对率。此外，本发明的方法拥有高达3.6的cis:trans比例，而传统高通量染色质构象捕获技术的cis:trans比为1.2(图1B)，这表明文库的质量得到了大幅提高。接下来，采用HiCExplorer对本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术文库进行了定量评估。发现本发明的方法中的文库在生物重复中具有高度的可重复性(皮尔逊相关系数＝0.96)。重要的是，本发明的方法能在广泛的距离范围内识别染色质互作，其效率与传统高通量染色质构象捕获技术方法相当(图1C)。

为了验证本发明的方法是否能识别基因组结构的关键特征，本发明比较了两种方法产生的互作热图(图2A)。虽然测序深度不同，但它们在基因组、染色体和局部位置水平上显示了类似的互作。此外，它们都显示顺式相互作用比反式相互作用更频繁，染色体臂内相互作用比臂间更频繁。

在三维基因组学中，区室结构和TADs在调控基因表达方面起着关键作用。为了评估本发明的方法检测区室和TADs的能力，本发明采用相同分析流程比较了本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术得到的区室和TAD。本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术在A/B区间方面显示了高度的一致性。大约88.4％的区间是相同的(图2B)。这里只有本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术的TADs相互重叠超过80％被认为是重叠的TADs。本发明从得到的3.68亿条原始读数中发现了1880个TADs，其中1449个(77.1％)与传统高通量染色质构象捕获技术的TADs是公共的。此外，TADs的可视化结果显示本发明的方法中的TADs与传统高通量染色质构象捕获技术中的非常相似(图2C)。综上所述，本发明的方法在捕捉白菜基因组结构的关键特征方面表现出了强大的功能。

3、本发明方法的低背景噪音

为了评估本发明的方法相对于传统高通量染色质构象捕获技术的信噪比，在此比较了由本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术产生的信号(图3A)。本发明通过基因组浏览器的可视化发现本发明的方法的信号比传统高通量染色质构象捕获技术更清晰明了。此外，本发明的方法的染色质相互作用更加明显。接下来，本发明的方法发现了生物重复间有140,944个重叠峰(图3B)。本发明的方法中重叠峰的比例(97.92％)高于传统高通量染色质构象捕获技术(88.87％)，后者在生物重复间鉴定了131,405个重叠峰(图3B)。这一结果突出了本发明的方法更好的峰值重现性。平均而言，本发明的方法中，每个峰有143个相互作用，这明显高于从传统高通量染色质构象捕获技术数据中发现的相互作用的数量(P值<2.2e-16，图3D)。本发明的方法的峰也比传统高通量染色质构象捕获技术峰有更高的-log(qvalue)(p-value<2.2e-16，图3E)。为了进一步评估信号，比较了高峰周围的本发明的方法和传统高通量染色质构象捕获技术数据集的平均读数。结果发现，本发明的方法显示在峰顶有更多的信号积累，这意味着本发明的方法在区分相互作用方面会更有效(图3F)。有趣的是，本发明的方法读数在峰顶两侧的覆盖率较低(图3F)。这个结果意味着本发明的方法的峰是相互分离的。通过目测，还发现本发明的方法检测到的相互作用更集中于峰的周围(图3A)。这些结果表明，在染色体构象捕获方面，本发明的方法比传统高通量染色质构象捕获技术具有信噪比的优势。

4、低材料投入

传统高通量染色质构象捕获技术在稀有细胞研究中的适用性是有限的，因为它需要大量的材料，这也使实验过程复杂化，阻碍了高通量文库的构建。本发明的方法的更佳的性能表明，这种方法可能在少量的样品中有效地使用。为了测试使用少量样品的可行性，本发明只用100mg的叶片建立了文库。利用这个小样本库，本发明能够在两个生物重复中分别产生9300万和9700万个原始reads。值得注意的是，低输入本发明的方法的有效接触比例(21.1％)和cis:trans的比例(3.3)与正常输入本发明的方法相似(图1B)。此外，低输入的本发明的方法(100mg)显示出与常规样本量的本发明的方法相似的互作模式。

为了确定通过低投入的本发明的方法识别的峰的特征，本发明进行了低起始量与常规样本量的比较分析。基因组浏览器的可视化显示了二者接触信号之间的高度一致性(图4A)。进一步在两个生物复制的低输入中分别鉴定了121,303和123,155个峰。其中，117,095个峰是重复的，占总数的95.8％(图4B)。值得注意的是，99％的低输入峰与常规样本量峰相重叠(图4C)。很明显，低输入的reads也在峰的周围表现出富集，这与常规样本量相似(图4B)。两个重复之间的低输入峰强度的高重现性(Spearman's correlation＝0.986)也被证明(图4D)。此外，在低投入和常规样本量之间也观察到了峰强度的高相关性(Spearman's correlation＝0.963)(图4D)，证实了两种方法都能识别相同的基因组区域。这些结果表明，在低输入材料的情况下，依然保持了高的数据质量。

5、白菜三维基因组的构建

为了研究白菜细胞核中的染色体结构，使用软件Nuc_dynamic构建了三维基因组结构(图5A)。三维结构显示，本发明的方法的染色体比传统高通量染色质构象捕获技术的染色体显得更加紧凑。对白菜细胞核的三维基因组结构的分析表明，每条染色体在细胞核内占据一个专属区域，支持"染色体领土"的概念。此外，通过比较不同批次数据的三维结构模型，观察到，染色体的构象保持稳定(图5A)。然而，三维基因组结构表明有可能发生动态变化。具体来说，A07号染色体与A04号染色体相邻，在本发明的方法中与A02号染色体相对，而在低输入中则与A04和A02号染色体相邻。

本发明在白菜细胞中观察到Bouquet构象。由于对白菜细胞核的形态感兴趣，本发明在基因组的三维结构模型上用不同的颜色标记了十个着丝粒和二十个端粒。结果发现端粒的位置相互靠近，而着丝粒则位于细胞核的外围(图5B)。值得注意的是，A03的一个端粒位于表面而不是三维拓扑结构内部。然后，通过三维基因组模型的不同角度观察着丝粒的位置，发现中心粒区域在细胞核的一侧清晰可见。荧光原位杂交也支持着丝粒的聚集。这些结果证明了白菜叶片中Bouquet构象的存在。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (7)

1.一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 取植物叶肉细胞在交联缓冲液中进行处理，然后经研磨、过滤得到细胞核；

(2) 将细胞核经通透处理后加入酶切反应液，得到平末端DNA序列，进一步进行加尾反应；

(3) 加入连接反应体系，完成反应后加入外切酶处理，其中，所述反应体系包含连接子和连接酶，所述连接子为双链结构且具有突出的胸腺嘧啶；

(4) 解交联后纯化DNA进行测序；

其中，所述植物叶肉细胞的样本起始量低于0.1 g；

所述交联缓冲液包含10-40mM的Hepes、100-400 mM蔗糖、0.01-5mM的MgCl₂，0.01-2mM的KCl、10-45%甘油、0.01-2%的Triton X-100、0.01-2mM苯基甲磺酰氟、0.01-2%的2-巯基乙醇、0.1-10%甲醛和0.01-2M的乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)；

步骤(1)中，所述研磨通过研磨机进行，其参数包括30-90秒、30-90赫兹、2-8个循环。

2. 根据权利要求1所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶切反应液包含CutSmart Buffer、Hae III限制性内切酶。

3.根据权利要求2所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用0.01-2%的SDS在40-70°C孵育进行所述通透处理。

4.根据权利要求3所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，步骤(2)中，加尾反应体系包括：5-15mM的dATP溶液、大片段DNA聚合酶。

5.根据权利要求4所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，步骤(3)中，用于外切酶处理的反应体系包括：Lambda外切酶缓冲液、Lambda外切酶、外切酶I。

6.根据权利要求5所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。

7.根据权利要求5所述的用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法，其特征在于，所述植物包括十字花科植物。