CN110904191A

CN110904191A - 一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法及应用

Info

Publication number: CN110904191A
Application number: CN201911331788.3A
Authority: CN
Inventors: 李占杰; 王凯; 欧阳凯
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-12-21
Filing date: 2019-12-21
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明涉及一种快速简便构建植物DNase‑seq文库的方法，采用AMPure beads首先去除1000bp以上的大片段，然后利用醇沉的方法回收所有小片段用于PCR建库，建库后再一次AMPure beads片段筛选去除插入片段大于200bp的DNA用于测序。本发明通过两轮的AMPure beads筛选，即可获得用于测序的DNase‑seq文库，在建库的同时进行片段筛选，明显的缩短有效DNA片段回收的时间和步骤。该方法简便、快速，易操作，且稳定、可靠，重复性好，该方法的建立可加快DNase‑seq文库的构建，推动植物开放染色质鉴定相关领域研究的发展，具有重要意义。

Description

一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法，更具体的涉及一种改进的植物开放染色质区域的鉴定。

背景技术

真核生物中，基因组DNA由组蛋白包裹并进一步折叠组装成以核小体为基本单位的染色质结构，因此，基因的表达受一系列顺式调控元件和反式作用因子协同调控作用。当调控蛋白结合到DNA上时，其结合部位缺少核小体结构，染色质结构疏松，从而表现出对DNA酶（DNase I）的高度敏感性，被称为DNase I超敏感位点，这些区域也被称作开放染色质区域。这些区域的DNA序列往往与启动子，增强子，绝缘子及抑制因子等多种调控元件有关，因此，对于开放染色质区域的鉴定有利于揭示植物细胞中基因表达调控机制，尤其是植物在生长发育以及环境变化响应过程中的分子调控机制密切相关。

早期有关开放染色质区域鉴定多采用基于Southern blot的方法，该方法仅能针对少数已知位点进行鉴定。伴随着高通量测序技术的发展，2008年出现了DNase I酶解结合高通量测序的方法（DNase-seq）。2013年底，DNase-seq的替代方法ATAC-seq（assay fortransposase-accessible chromatin using sequencing）也被开发出来。这些方法的出现使得动物及人类细胞相关领域的研究发展如火如荼。

2012年，第一篇关于植物开放染色质鉴定的研究被报道出来，相关的DNase-seq方法也随即被转化应用到植物领域。然而，随后的几年中，植物开放染色质鉴定相关的报道却一直很少，仅有少数几篇报道出现在模式植物拟南芥以及少数小基因组作物水稻、番茄上。究其原因，主要是经典的DNase-seq方法步骤繁琐，流程长，不易掌握，而ATAC-seq方法对供试材料细胞核的完整度和纯净度要求又较高。

发明内容

鉴于上述内容，本发明提供一种解决和部分解决上述问题的快速简便构建植物DNase-seq文库的方法及应用。

本发明的目的是提供一种快速简便的植物DNase-seq文库构建方法。

本发明的另一目的是将这种快速简便的植物DNase-seq文库构建方法应用于较复杂的植物基因组材料。

本发明的通过以下技术方案达到上述目的：

将纯化的植物DNA片段采用AMPure beads首先去除1000bp以上的大片段，然后利用醇沉的方法回收所有小片段用于PCR建库，建库后再一次AMPure beads片段筛选去除插入片段大于200bp的DNA用于测序；通过两轮的 AMPure beads筛选，获得用于测序的DNase-seq文库。

优选地，所述AMPure beads用于去除1000bp以上大片段时，DNA与AMPure beads体积比为1:0.6。

优选地，所述醇沉方法回收小片段，采用3倍体积乙醇-20 °C沉淀过夜，有利于更高效的回收小片段，尤其是100bp以下的片段。

具体地，DNA文库构建过程采用illumina公司DNA文库构建试剂盒完成。

优选地，所述第二轮AMPure beads片段筛选在建库的最后一步进行，片段筛选系数为0.7*1.3。

所述纯化的植物DNA片段的制备方法为：将植物组织在液氮中研磨成粉末后加入预冷的植物细胞核提取缓冲液（Nuclei isolation buffer，NIB），充分混匀后过滤，滤液至一新的离心管，离心收集沉淀，并向沉淀中加入细胞核洗涤缓冲溶液（Nuclei washingbuffer, NWB），离心去除上清，重复洗涤沉淀2-3次后，用细胞核酶解缓冲液（Nucleidigestion buffer, NDB）悬浮沉淀，得到待酶切的细胞核悬浮液。通过设置不同的DNase I酶加入量对细胞核进行部分酶解（37 °C 温育10分钟），酶解后的细胞核通过酚氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤后得到纯净的DNA片段。

所述细胞核提取缓冲液（NIB）成分包括：10 mM Tris-HCl, 80 mM KCl, 10 mMEDTA, 1 mM 亚精氨, 1 mM 精氨, 0.15 % 巯基乙醇, 0.5 M sucrose, pH 9.5（巯基乙醇使用前加入）。

细胞核洗涤缓冲液（NWB）成分包括：NIB溶液加入0.5 % Triton X-100。

细胞核酶解缓冲液（NDB）成分包括：10 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2,pH 7.4。

优选地，所述植物组织为新鲜的或冷冻的新鲜植物组织。

优选地，所述植物组织与细胞核提取液加入比例为3-5g植物样品加入10-15mlNIB溶液，提取液量太少会造成细胞核悬浮或裂解不充分，过量会导致细胞核浓度太低，影响后续酶切实验的效率。

优选地，Triton X-100加入量控制在0.5%-1%，量少会造成细胞器尤其是叶绿体细胞器清除不干净，过量会导致细胞核大量裂解。

优选地，当植物组织样品中含有较多酚类或多糖物质时，可向NIB溶液中加入终浓度1.0 mg/ml 的聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrrolidone, PVP) 。

优选地，为了有效的保障细胞核的完整性以及回收率，离心过程采用4℃ 800-1000g 离心5min。

本发明上述方法获得的细胞核可满足大多数植物材料开放染色质检测的需求。优选地，不同植物材料，以及同一植物材料的不同组织部位，DNase I 的用量不同，推荐设置4-5个DNase I 酶切梯度。针对于拟南芥叶片组织，合适的DNase I量为：1.5-2.0U/80μl 细胞核。

具体地，所述酚氯仿抽提及乙醇沉淀步骤与经典方法相同。

优选地，最适DNase I 酶切梯度的选择可依赖于qPCR检测或DNase I 滴度实验。对于有已知开放染色质区域信息的植物材料，即已有先验知识的材料可采用qPCR方法检测，对没有先验知识的物种采用DNase I 滴度实验（即通过对建库后的文库进行少量测序分析，根据数据分析结果筛选最优酶解状态）亦可找出最适酶切梯度。

本发明的有益效果在于：经典的DNase-seq方法通过密度梯度离心对酶切后的DNA片段进行纯化和筛选，回收过程步骤繁琐复杂，DNA损失较多，同时操作技术难度也较高，不易掌握。本发明提供了一种改进的DNase-seq方法，通过对植物组织细胞核提取方法的改进，以及通过使用AMPure beads筛选技术分离纯化有效DNA片段，大大缩短了经典DNase-seq文库构建的流程及操作环节，简便、快速，易操作，且其结果与经典方法获得的检测结果一致。该方法将目前DNase-seq检测技术简化，并使其能应用于不同复杂程度植物基因组，对植物开放染色质区域的鉴定，以及植物基因组转录调控相关研究有重要意义。

附图说明

图1为本发明DNase-seq文库构建流程示意图。

图2 为本发明经过两轮AMPure Beads筛选后的DNase-seq文库插入片段分布图。

图3为应用本发明方法构建拟南芥叶片组织DNase-seq文库，鉴定到的开放染色质区域与已有相似研究结果比较。

图4为采用qPCR的方法筛选最适酶切梯度的方法。

图5为采用DNase I滴度实验确定最适酶切梯度的方法。

图6 为应用本发明方法鉴定菠萝叶片组织不同区域在不同时间点的染色质开放区域情况。

具体实施方式

为了更清楚、明白的说明本发明内容，以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但此处的具体实施例并不对本发明做任何形式的限制。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1拟南芥叶片组织开放染色质区域鉴定

细胞核提取缓冲液（NIB）成分包括：10 mM Tris-HCl, 80 mM KCl, 10 mM EDTA, 1 mM亚精氨, 1 mM 精氨, 0.15 % 巯基乙醇, 0.5 M sucrose, pH 9.5（巯基乙醇使用前加入）。

一、方法

1、取3-5g新鲜拟南芥叶片组织，在液氮中研磨成粉末后转移至50ml离心管，粉末体积大约为10-15 ml；

2、向离心管中加入等体积预冷的细胞核提取缓冲液NIB，充分混匀（在冰上摇动5-10min），然后用四层尼龙布过滤，滤液至另一新的50ml离心管；

3、4 °C 800g 离心5min，弃上清，沉淀用10ml 细胞核洗涤缓冲液NWB重悬，边加缓冲液边用毛刷将沉淀刷起，沉淀充分悬浮后，静置1-2min；

4、4 °C 800g 离心5min，弃上清，沉淀再用10 ml 细胞核洗涤缓冲液NWB重悬，此处可重复洗涤沉淀1-2次；

5、向沉淀中加入5 ml 细胞核酶解缓冲液NDB，并用毛刷将沉淀轻轻刷起，静置2min，4°C 800g 离心5min，弃上清；

6、用800-1000 μl 细胞核酶解缓冲液NDB重悬细胞核沉淀，并分装到6个1.5 ml离心管中，每管80 μl；

7、将分装好的细胞核悬浮液置于37°C金属浴中，并向6个离心管中分别加入0U、0.2U、0.5U、1.0U、1.5U、2.0U的DNase I，37°C 温育10min；

8、温育结束后向每个离心管中加入80 µl 50 mM EDTA终止酶解反应，颠倒充分混匀后置于冰上；

9、向每个离心管中加入一定量的ddH₂O，补充体积到200 µl，再向每个离心管加入2ulproteinase K，颠倒混匀后，置于55°C温育1h;

10、温育后的样品经过常规的酚氯仿抽提得到纯净的DNA样品，具体步骤如下：

（1）向每个离心管中加入100 µl Tris 平衡酚和100 µl 氯仿，颠倒混匀，然后4°C4000g 离心10min；

（2）上层水相转移入一新的1.5 ml 离心管，加入3倍体积无水乙醇，2 μl 糖原（20mg/μl），-20°C 冰箱过夜；

（3）过夜沉淀出来的DNA经4°C 10,000rpm 离心10min收集至管底；

（4）加入500 µl 75%乙醇清洗沉淀后，4°C 10,000rpm 离心5 min，弃上清，空气干燥3-4min后，加入40 µl ddH₂O溶解沉淀；

11、取5 µl 上述DNA样品于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切效果；

12、用AMPure beads对上述剩余DNA样品进行片段筛选以去除大于1,000bp的片段：

（1）向35 µl DNA样品中加入21 µl AMPure beads，用移液器吹吸数次，充分混匀后，室温静置10min；

（2）将含有DNA样品和AMPure beads的离心管放置于磁力架上，静置5min，待液体澄清后，将上清液吸出至一新的1.5 ml离心管中；

（3）向上清液中加入1 μl 糖原（20mg/μl），5μl 3M醋酸钠，以及180 μl 无水乙醇，置于-20°C沉淀过夜；

（4）4 °C 12,000 rpm 离心10 min，收集DNA沉淀；

（5）加入500 µl 75%乙醇清洗沉淀后，4°C 10,000rpm 离心5 min，弃上清，空气干燥3-4min后，加入30 µl ddH₂O溶解DNA沉淀；

13、使用illumina DNA建库试剂盒对上述回收的DNA样品进行文库构建，包括平末端处理、接头连接、DNA纯化、PCR反应等主要步骤，其中DNA纯化步骤为避免DNA片段丢失，DNA回收时DNA与AMPure beads的体积比为1:2。

14、对构建好的DNA文库进行第二轮片段筛选：

（1）向50 µl DNA文库样品中加入35 µl AMPure beads，用移液器吹吸数次，充分混匀后，室温静置10min；

（2）将含有DNA和AMPure beads混合液的离心管放置于磁力架上，静置5min，待液体澄清后，将上清液吸出至一新的1.5 ml离心管中；

（3）再加入65 µl AMPure beads，吹吸数次，充分混匀后置于磁力架上，静置5min，待液体澄清后，移除上清；

（4）加入200 µl 80% 乙醇溶液，室温放置30s 后移除上清，利用80% 乙醇重复洗涤1次；

（5）尽量除净乙醇，室温放置5min；

（6）干燥后加入15 µl ddH₂O重悬beads，室温静置2min，离心管置于磁力架上，待液体澄清后，小心吸取上清溶液，即为DNase-seq文库。

15、将上述DNase-seq文库进行二代测序。

二、结果

1、本发明实验操作流程简便、快速，易上手，总流程主要包括细胞核提取，DNase I 部分酶解，去除1000bp以上的大片段（同时回收小片段），文库构建，第二次片段筛选几个部分，流程示意图如图1所示。

2、本发明经过两轮AMPure Beads筛选后的DNase-seq文库插入片段集中在200bp以下，富集了用于开放染色质鉴定的有效DNA片段。如图2所示，使用本发明方法构建的拟南芥DNase-seq文库经测序，mapping到基因组后，发现文库的插入片段主要分布在200bp以下。

3、应用本发明方法构建的拟南芥叶片组织DNase-seq文库经测序比对后，分析获得38691个开放染色质区域。如图3所示，与已报道相似研究相比，可以重复获得前人报道中63.64%（Zhang et al., 2012）到83.62%（Sijacic P et al., 2018）开放染色质区域，重复性好，说明本发明方法稳定、可靠。

实施例2 qPCR或DNase I滴度实验

对于有已知开放染色质区域信息，即有先验知识的物种而言，可以采用qPCR的方法筛选最适酶切梯度。即根据已知信息，选择高度敏感位点、中度敏感位点、以及不敏感位点各1-2个，设计引物，经过qPCR分析，选择70%以上高度敏感位点被切割，而不敏感位点基本未被切割的梯度作为最适酶切梯度。如图4所示，1.5-2.0 U 为最适酶切梯度。

对于无已知开放染色质区域信息，即没有先验知识的物种而言，最适DNase I 酶切梯度可以采用DNase I 滴度实验进行确定。具体而言，对设置的4-5个酶切梯度分别建库并进行少量测序，分析文库测序片段在全基因组范围内分布情况，选择在基因TSS区及其附近分布密度高的样品为最适酶切梯度。如图4所示，1.5-2.0 U为最适酶切梯度。

实施例3 本发明在菠萝等非模式植物上的应用

本发明已成功应用于非模式植物开放染色质的鉴定，图5显示的是本发明应用于菠萝叶片组织的结果，有效的获得了其全基因组范围内的开放染色质区域。最外圈为菠萝基因组示意图，其次是各染色体上基因的密度分布，然后，剩余四圈为菠萝叶片不同组织部位在不同时间点的开放染色质区域分布。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法，其特征在于，将纯化的植物DNA片段采用AMPure beads首先去除1000bp以上的大片段，然后利用醇沉的方法回收所有小片段用于PCR建库，建库后再一次AMPure beads片段筛选去除插入片段大于200bp的DNA用于测序；通过两轮的 AMPure beads筛选，获得用于测序的DNase-seq文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用AMPure beads去除1000bp以上的大片段时，DNA与AMPure beads体积比为1:0.6。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇沉为采用3倍体积无水乙醇-20 °C沉淀过夜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二轮AMPure beads片段筛选在建库的最后一步进行，片段筛选系数为0.7*1.3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化的植物DNA片段的制备方法为：将植物组织在液氮中研磨成粉末后加入预冷的植物细胞核提取缓冲液NIB，充分混匀后过滤，滤液至一新的离心管，离心收集沉淀，并向沉淀中加入细胞核洗涤缓冲溶液，离心去除上清，重复洗涤沉淀2-3次后，用细胞核酶解缓冲液悬浮沉淀，得到待酶切的细胞核悬浮液；通过设置不同的DNase I酶加入量对细胞核进行部分酶解，酶解后的细胞核通过酚氯仿抽提、乙醇沉淀后得到纯化的DNA片段。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞核提取缓冲液NIB包括以下终浓度成分：10 mM Tris-HCl, 80 mM KCl, 10 mM EDTA, 1 mM 亚精氨, 1 mM 精氨, 0.15 %v/v 巯基乙醇, 0.5 M sucrose, pH 9.5；巯基乙醇在使用前加入；

细胞核洗涤缓冲液成分包括：NIB溶液加入终浓度0.5 %v/v Triton X-100；

细胞核酶解缓冲液包括以下终浓度成分：10 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, pH 7.4。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞核提取缓冲液NIB中还包括终浓度1.0 mg/ml 的聚乙烯吡咯烷酮。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物组织与植物细胞核提取缓冲液NIB加入比例为：3-5g植物样品加入10-15ml NIB溶液；所述酶解条件为37 °C 温育10分钟；所述DNase I 的用量为1.5-2.0U/80μl细胞核。

9.一种如权利要求1所述的方法在植物开放染色质鉴定中的应用。