JP2001526182A

JP2001526182A - 核酸単離の方法

Info

Publication number: JP2001526182A
Application number: JP2000524413A
Authority: JP
Inventors: ラルフソマック，; ステファンイー．モーリング，
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1997-12-09
Filing date: 1998-12-09
Publication date: 2001-12-18
Also published as: US5972613A; AU1633199A; EP1037971A1; CA2310782A1; WO1999029840A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＲＮＡが、ＤＮＡから差示的に沈殿され得るという驚くべき知見を用いる新規のＲＮＡ単離方法に関係する。本方法は、ＲＮＡ含有沈殿物が由来する溶液のＲＮＡ対ＤＮＡの比率と比べた場合、ＤＮＡに対して少なくとも２倍濃縮されたＲＮＡ含有量を有する、ＲＮＡ含有沈殿物の形成を生じる。溶液からＲＮＡを沈殿することより、ＲＮＡは、遠心分離または濾過のような簡単な手段によって収集され得、それによってＲＮＡを固相へ結合する必要性を回避している。好ましい沈殿形成カオトロピック塩は、塩酸グアニジンおよびチオシアン酸グアニジンである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸の比較的純粋なサンプルの調製は、多くの分
子生物学的手順おいて重要な工程である。精製は、後の分子生物学的手順の妨げ
になり得る不純物（例えば、細胞細片）の除去を保証する必要がある。ＲＮＡ精
製は、多くの用途を有する（例えば、ｃＤＮＡの調製、および遺伝子発現の監視
において）。多くの細胞型からのＤＮＡ精製は、比較的簡単であるが、ＲＮＡ精
製は、しばしば問題がある。この様な困難さは、遍在するＲＮＡ分解酵素を不活
性化する必要性、およびアルカリ性のｐＨ環境におけるＲＮＡの不安定性を包含
する。別のＲＮＡ精製の困難さは、ＲＮＡおよびＤＮＡの頻繁な共精製（ｃｏ−
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。混入ＤＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの類似
した塩基対形成特性のため、後の分子生物学的手順または遺伝学的分析手順の妨
げとなり得る。同様に、ＲＮＡは、ＤＮＡの調製物に混入し得る。

【０００２】多数の手順が、ＲＮＡを精製するために開発されている。これらの以前に利用
可能なＲＮＡ手順は、１つ以上の欠点に苦しんでいる（例えば、高い毒性の化学
物質の必要性、不便な多数の操作の使用、ゲノムＤＮＡの混入、超遠心分離の必
要性、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼ分解の使用、および遺伝学的分
析手順（例えば、ＰＣＲおよび塩基配列決定）のインヒビターの混入）。このよ
うなＲＮＡ単離方法は通常、固相支持体への核酸の吸着、そして次に支持体から
の核酸を優先的に溶出する、という扱いにくい工程を含んでいる。同様の問題が
ＤＮＡ単離のための以前に利用可能な技術で生じている。従って、ＲＮＡおよび
ＤＮＡ精製の新規の方法および改善された方法を提供することが目的である。理
想的には、このような新規の方法は、簡単に行われ、そして容易に自動化され得
る。

【０００３】（発明の要旨）本発明は、ＲＮＡが、実質的に一工程でＤＮＡから差示的に沈殿され得るとい
う驚くべき発見を利用するＲＮＡおよびＤＮＡ単離の新規の方法に関係する。本
方法は、ＲＮＡ含有沈殿物が由来する溶液のＲＮＡ対ＤＮＡの比率と比べた場合
、ＤＮＡに対して少なくとも２倍濃縮されたＲＮＡ含有量を有するＲＮＡ含有沈
殿物の形成を生じる。達成されるＲＮＡ濃縮の度合いは、しばしば２倍よりも高
い；１００倍またはそれよりも大きな倍率の濃縮が、頻繁に得られる。溶液から
ＲＮＡを沈殿することにより、ＲＮＡを、遠心分離または濾過のような簡単な物
理的手段によって収集し得、それによって固相へＲＮＡを結合するか、または酵
素学的な分解を利用する必要性を回避している。次に集めたＲＮＡ沈殿物は、可
溶化され得る。

【０００４】本方法の１つの実施態様は、ＲＮＡ含有核酸組成物を形成する工程、ＲＮＡ沈
殿物を形成するカオトロピック塩を核酸組成物に対し、ＲＮＡ含有沈殿物を形成
するのに十分な濃度で添加する工程、ＲＮＡ含有沈殿物を収集する工程、そして
（必要に応じて）その沈殿物を可溶化する工程を包含する。好ましい沈殿物形成
カオトロピック塩は、塩酸グアニジンおよびチオシアン酸グアニジンである。

【０００５】ＲＮＡ含有沈殿を形成する工程は、好ましくは１℃〜２５℃の温度範囲で行わ
れ、より好ましくは４℃〜１０℃の範囲で行われる。代表的には、必要ではない
が、沈殿物形成工程は、少なくとも１時間で行われる。

【０００６】本発明の別の実施態様は、ＤＮＡを単離する方法を包含する。本ＤＮＡ単離方
法は、ＲＮＡ含有沈殿物を形成することによりＲＮＡを単離することに用いられ
得る、本発明の差示的ＲＮＡ沈殿工程を利用しており、ＤＮＡが溶液中に残って
いることによりＲＮＡに対するＤＮＡの精製を生じる。ＲＮＡの収集プロセスは
、ＲＮＡを枯渇した溶液の生成を生じる。次にＤＮＡは、核酸沈殿剤（例えば、
エタノール）を添加することによりＲＮＡを枯渇した溶液から沈殿され得る。

【０００７】本発明の他の実施態様は、本発明の方法を行うためのキットを包含する。本発
明は、本発明の方法を行うためのシステムもまた包含する。ＲＮＡを単離するた
めのシステムは、細胞溶解チャンバ、沈殿物コレクタ、およびカオトロピック塩
の導入のためのポートを包含する。

【０００８】（本発明の特定の実施態様）本発明は、ＲＮＡがＤＮＡから差示的に沈殿され得るという、驚くべき発見を
利用するＲＮＡ単離の新規の方法に関係する。従って、本方法は、ＲＮＡを精製
する方法としてのみならず、ＤＮＡからのＲＮＡを分離する方法としても考えら
れ得る。従って、本発明は、ＤＮＡを単離する方法もまた提供する。本方法は、
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および細
胞核ＲＮＡを含む、多くの異なる形態のＲＮＡの精製に用いられ得る。同様に、
本発明は、実質的に全ての形態のＤＮＡの精製に用いられ得る。本方法は、ＲＮ
Ａ沈殿物が由来する溶液のＲＮＡ／ＤＮＡ比率を比較した場合、ＤＮＡに対して
少なくとも２倍濃縮されたＲＮＡ含有量を有するＲＮＡ含有沈殿物の形成を生じ
る。達成されるＲＮＡ濃縮の度合いは、しばしば２倍よりもかなり高い。そのＲ
ＮＡは、遠心分離または濾過のような簡単な手段により集められ得、それによっ
てＲＮＡを固相に結合する必要性を回避している。次に、集めたＲＮＡ沈殿物は
、可溶化され得る。従って、本発明の実施態様が、ＲＮＡの選択的沈殿を提供す
るのみならず、固相支持体への吸着を増強するフェノール／クロロフォルム抽出
、または薬剤の添加（例えば、エタノール）のような扱い難いさらなる工程も、
不必要である。

【０００９】本明細書で核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）に対して用いる場合、用語「単離」と
は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはｃＤＮＡの生成のような、ポリメー
ラーゼが触媒した反応における、プライマー伸長のためのテンプレートとして機
能するのに十分な純度である組成物を生成する方法をいう。組成物を含有する核
酸の純度は、とりわけ、Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀の吸収比率を測定することにより分光光学
的に確かめられ得る。この比率は、組成物中の核酸およびタンパク質の量を示し
ている。好ましくは、精製した目的の核酸のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀は、少なくとも１．８
であり、より好ましくは、少なくとも２．０である。本ＲＮＡおよびＤＮＡ調製
法により生成されている組成物を含有する核酸は、「精製した」といわれる。本
発明の方法により形成されたＲＮＡ含有沈殿物は、精製したＲＮＡといわれる。
本発明の方法により形成されたＲＮＡ含有沈殿物は、ＲＮＡ以外の種々の成分を
含有し得る。この様な付加的な成分は、対イオン、タンパク質、ＤＮＡ、などを
包含（比較的微量を）する。

【００１０】本発明の方法により形成されたＲＮＡ含有沈殿物は、とくに有利である。なぜ
ならば、本方法は、ＤＮＡよりもＲＮＡを優先的に沈殿するからである。この差
示的沈殿効果は、ＲＮＡおよびＤＮＡとの間の化学的類似性を考慮に入れると全
く驚くべきことである。多くのＲＮＡ精製方法が、ＲＮＡ調製物に混入するＤＮ
Ａを除去する特別な工程を必要とする（例えば、ＤＮＡｓｅの添加）。本発明の
方法により形成されたＲＮＡ含有沈殿物は、そのＲＮＡ含有沈殿物が形成された
組成物を含有する核酸において、ＲＮＡ／ＤＮＡ比率に対して少なくとも２倍の
濃縮を示す。本方法のほとんどの実施態様において、ＲＮＡ含有沈殿中に見出さ
れたＤＮＡに対するＲＮＡ濃縮の度合いは、２倍よりも有意に高い。少なくとも
１００倍のＲＮＡ濃縮が、ほとんどの実施態様において達成され得る。

【００１１】本発明の方法は、ほとんどのＲＮＡ含有材料からのＲＮＡの単離に適用され得
る。可能性のある供給源の例は、組織培養サンプル、生物学的調製物（植物組織
ホモジネートを含む）および患者のサンプル（例えば、血液、唾液、精液、髄液
、生検サンプルなど）を包含する。ＲＮＡ含有組成物は、細胞（またはウイルス
の）溶解によるか、または目的の環境にすでに放出されている核酸の収集により
得られ得る。核酸含有組成物は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかの
溶解により得られ得る。細胞は、溶解の前に濃縮され得る（例えば、遠心分離ま
たは濾過による）。細胞は、従来の核酸調製手順における細胞の溶解に有用な種
々の方法により溶解され得る。核酸単離のための細胞溶解物の形成方法は、周知
であり、そして、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、およびＪｏｎ
ｅｓら、ＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ，ＢＩＯＳ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９４）にお
いて、見出され得る。このような溶解方法は、界面活性剤、洗浄、酵素処理、酵
素そして超音波処理を包含するが、これに限定されない。本発明の好ましい実施
態様において、溶解は、グアニジン塩および界面活性剤を含有する溶解液の添加
を通してなされる。カオトロピック塩の添加は細胞溶解、および同じ工程におい
てＲＮＡ含有沈殿物の形成に用いられ得る。

【００１２】カオトロピック塩は、ＲＮＡ含有沈殿物の形成に用いられる。用語カオトロピ
ック塩とは、タンパク質または核酸の二次構造または三次構造を変化し得るが、
タンパク質または核酸の一次構造を変化し得ない物質をいう。カオトロピック塩
の例としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、
ヨウ化カリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、尿素が挙げられるが、これに限
定されない。チオシアン酸グアニジンおよび塩酸グアニジン以外のグアニジン塩
が、本方法におけるカオトロピック塩として用いられ得る。全てのカオトロピッ
ク塩が、ＲＮＡ含有調製物からＲＮＡ含有沈殿物の形成を生じ得るわけではない
。ＲＮＡ含有沈殿物の形成を生じ得るカオトロピック塩は、便宜上、「ＲＮＡ沈
殿物形成カオトロピック塩」といわれ得る。ＲＮＡ沈殿物形成カオトロピック塩
を、ＲＮＡ含有沈殿物形成を生じる能力についての目的のカオトロピック塩の慣
用的実験法の使用により同定し得る（例えば、ＲＮＡを含むことが既知である溶
液へのカオトロピック塩を添加し、そしてＲＮＡ含有沈殿物の形成を監視するこ
と）。本方法における使用に好ましいカオトロピック塩は、塩酸グアニジンおよ
びチオシアン酸グアニジンである。ＲＮＡ含有沈殿物を形成するために用いられ
たカオトロピック塩の濃度は、選択された特定のカオトロピック塩により異なり
得る。特定の塩の溶解度のような要素を、考慮しなければならない。慣用的実験
法が、ＲＮＡ含有沈殿物形成を生じるためのカオトロピック塩の適切な濃度を決
定するために用いられ得る。カオトロピック塩として塩酸グアニジンを使用する
本発明の実施態様において、ＲＮＡ含有沈殿物が得られる核酸を含有する溶液中
の塩酸グアニジンの濃度は、１Ｍ〜４Ｍの範囲である。カオトロピック塩として
チオシアン酸グアニジンを使用する本発明の実施態様において、ＲＮＡ含有沈殿
物が得られる核酸を含有する溶液中のチオシアン酸グアニジンの濃度は、０．５
Ｍ〜３Ｍの範囲である。カオトロピック塩の組み合わせは、ＲＮＡ含有沈殿物の
形成を生じるため用いられ得る。複数のカオトロピック塩を使用する本発明の実
施態様において、カオトロピック塩は、濃縮された溶液の形態で、または固体と
して（そして最初のＲＮＡ含有調製物中に溶解されて）添加され得る。

【００１３】カオトロピック塩の添加後、その溶液は、ＲＮＡ含有沈殿物の形成を可能にす
るのに十分な期間、インキュベートされる。インキュベートは、好ましくは一定
の温度条件下で行う。対象の目的（例えば、ｃＤＮＡライブラリー形成）に十分
な量のＲＮＡ沈殿物が形成される場合、そのＲＮＡ沈殿物は、収集され得る。形
成されたＲＮＡ沈殿物の量は、インキュベーションの間に監視され得る。監視は
、沈殿物の形成の外観上の観察（例えば、視覚的に）をする工程、インキュベー
ションプロセスの間の沈殿物を収集する工程など、を含む方法のような、多くの
方法により達成され得る。本発明のほとんどの実施態様において、インキュベー
ション時間は、少なくとも５分である。インキュベーションの時間は、５分より
も相当長くあり得る；適切な所要時間で単離したＲＮＡを得る必要性を強いられ
得るが、インキュベーション時間の上限は意図されない。

【００１４】目的のＲＮＡ含有組成物（例えば、細胞溶解物）へのカオトロピック塩の添加
により形成した混合物の温度は、本方法において形成したＲＮＡ含有沈殿物の量
に影響する。一般に、より高い沈殿物収量は、温度をより低くすることで得られ
る（すなわち、室温より低い温度）。好ましくは、凍結は避けられる：しかし、
新鮮な細胞溶解物が急速に凍結される場合、ＲＮＡ含有沈殿物を形成し得る。さ
らに、より低い温度は、ＲＮＡｓｅの活性または処理したサンプル中で生じる有
害な化学反応を減少するため用いられ得る。好ましくは、ＲＮＡ含有沈殿物を形
成した溶液の温度は、１℃〜２５℃の範囲であり、より好ましくは、４℃〜１０
℃の範囲である。

【００１５】ＲＮＡ含有沈殿物が形成された後、ＲＮＡ含有沈殿物は収集される。収集は、
沈殿物が形成される溶液からのＲＮＡ含有沈殿物の除去を要する。その沈殿物は
、液相からの固相分離のための任意の周知の方法により、溶液から分離され得る
。例えば、ＲＮＡ含有沈殿物は、濾過または遠心分離により回収され得る。多く
の型の濾過および遠心分離システムが、ＲＮＡ含有沈殿物を収集するために用い
られ得る。ＲＮＡ分解に対する予防策は、ＲＮＡ沈殿物収集工程の間に講じられ
るべきである（例えば、ＲＮａｓｅを含まないフィルターおよびＲＮａｓｅを含
まないチューブの使用、温度の減少）。

【００１６】ＲＮＡ含有沈殿物が回収された後、その沈殿物は残留夾雑物を除去するため必
要に応じて洗浄され得る。種々の洗浄液が、用いられ得る。洗浄液および洗浄条
件は、ＲＮＡ含有沈殿物からのＲＮＡ損失を最小化できるように設計されるべき
である。好ましくは、そのＲＮＡ含有沈殿物の形成に用いたのと同じカオトロピ
ック塩を含む洗浄液が、収集したＲＮＡ含有沈殿物の洗浄に用いられる。洗浄液
中のカオトロピック塩の濃度は、好ましくはＲＮＡ含有沈殿物を形成するのに十
分高く、それによって洗浄工程の間のＲＮＡ含有沈殿物の損失を最小化する。さ
らに、洗浄液は、好ましくはＲＮＡ含有沈殿物を形成するのに十分に低い温度で
あり、それによって洗浄工程の間のＲＮＡ含有沈殿物の損失を最小化する。

【００１７】収集したＲＮＡ含有沈殿物は、溶液中の精製したＲＮＡの次の操作を可能にす
るように可溶化され得る。可溶化は、ＲＮＡ含有沈殿物の形成を生じない溶液と
、収集したＲＮＡ含有沈殿物との接触により達成され得る。代表的には、このよ
うな溶液は、水溶性の緩衝液（低イオン強度）または水である。このような緩衝
液の例は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭＥＤＴ
Ａを含む；適切な緩衝剤は、トリス塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリシ
ン、ピロリン酸塩、アミノメチルプロパノールなどを含むが、これらに限定され
ない。そのＲＮＡ含有沈殿物およびその溶液は、可溶化プロセスを促進するため
に、（例えば、ボルテックスにより）積極的に混合され得る。

【００１８】ＤＮＡが、本発明の方法に従うＲＮＡ含有沈殿物の形成により、核酸を含有す
る溶液（ＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含有）から単離され得ることは、当業者によ
って容易に理解される。ＲＮＡを枯渇した溶液は、ＤＮＡおよびＲＮＡ含有溶液
からのＲＮＡ含有沈殿物の形成の必然的な結果として生成される。ＤＮＡは、核
酸沈殿剤の添加によりＲＮＡを枯渇した溶液から単離され得る。本方法において
使用する核酸沈殿剤は、ＤＮＡ含有溶液からＤＮＡを沈殿し得る。本方法におい
て使用する核酸沈殿剤は、ＲＮＡもまた沈殿し得る。ＲＮＡおよびＤＮＡを沈殿
し得る化合物は、周知であり、そして多くのアルコール性の化合物が含まれる。
濃縮したエタノールが特に好ましい。次に、ＤＮＡ沈殿物は、（ＲＮＡ含有沈殿
物と同じ方法で）収集され、必要に応じて洗浄され、そして可溶化され得る。形
成されたＲＮＡ含有沈殿物は、分析のために保存してもよいし、保存しなくても
よい。

【００１９】本発明の実施態様は、ＲＮＡ単離の本方法を行うためのシステムを含む。その
システムの一つの実施態様において、そのシステムは、本方法に従うＲＮＡ含有
沈殿物の形成に用いられ得る、細胞溶解チャンバ、沈殿物コレクタ、およびカオ
トロピック塩の導入のためのポートを含む。本発明のシステムの部品は、ＲＮＡ
単離の本方法の一つ以上の実施態様の実行を可能とするように協同する。本発明
のＲＮＡ単離システムの種々の部品は、単一のデバイスまたは装置の一部であっ
ても、そうでなくてもよい。細胞溶解チャンバは、細胞溶解物を収容するのに用
いられ得る。細胞溶解物は、細胞溶解チャンバ中で（細胞および溶解液の導入後
）形成され得るか、あるいは細胞溶解物は、細胞溶解チャンバ中に直接的に導入
され得る。カオトロピック塩の導入のためのポートは、チャンバへの（乾燥形状
または溶液としてのいずれかで）カオトロピック塩の導入を許容するために、細
胞溶解チャンバと協同するように構成される。そのシステムの実施態様は、溶解
チャンバへの導入のためのカオトロピック塩のリザーバーを包含し得る。リザー
バーおよびエントリーポートは、同一の構造であっても、そうでなくてもよい。
沈殿物コレクタは、カオトロピック塩の添加により形成されたＲＮＡ含有沈殿物
を収集するのに役立つ。そのコレクタは、フィルタを含む形状のような、多くの
形状を取り得る。フィルタは移動可能であっても、そうでなくてもよい。

【００２０】本発明の他の実施態様は、本核酸単離方法を実施するためのキットを含む。キ
ットは、ともに包装された複数の試薬の提供により、本方法の実施を促進するの
に役立つ。試薬は、本方法の正確さおよび信頼度を向上するように予め測定され
たユニットで供給され得る。キットは、好ましくは、本核酸の調製方法の一つ以
上の実施態様を実践するための詳細な使用説明書を含む。本発明のキットは、カ
オトロピック塩を含む細胞溶解緩衝液、ＲＮＡ含有沈殿物を洗浄するための緩衝
液、および（本方法により形成された）ＲＮＡ含有沈殿物を可溶化するための緩
衝液を含有する。そのキットは、沈殿物コレクタ（例えば、濾過装置）を最適に
は、含有し得る。

【００２１】上述の、本発明は、以下の実施例を参照することによってより理解され得る。
次の実施例は本発明を例示する目的で提供され、そして本発明を制限するものと
して解釈をされるべきではない。

【００２２】（実施例）（実施例１）（培養細胞由来の総ＲＮＡの精製のための遠心分離の手順）（１．溶解および遠心分離）ａ．１００μＬの細胞溶解溶液（塩酸グアニジン、塩化ナトリウムおよび界面
活性剤（ｐＨ６．０）を含む）を、１００μｌのＰＢＳ緩衝溶液中の細胞懸濁液
を含むサンプルチューブに添加する。ｂ．そのサンプルを、ピペット動作で、２００μｌピペットマンチップ（１７
５μｌに設定）を通して、３回〜５回注排水することにより混合する。チューブ
を覆い、そして室温で１０分間、静置させる。氷上で４℃で１時間インキュベー
トする。ｃ．溶解物を２２〜２５℃になるまで放置する。溶解物を、２００μｌチップ
を通して、１０回〜１５回注排水することにより、ＤＮＡを剪断する。ｅ．サンプルチューブを１０,０００ｒｐｍ（〜６０００×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を捨てる。その上清は、ゲノムＤＮＡの回収に用いられ得るこ
とに注意すること。

【００２３】（２．精製洗浄）ａ．５００μｌの洗浄液Ｉ（細胞溶解溶液（１ａ）を希釈した）を遠心分離チ
ューブに添加し、そして５秒間ボルテックスすることによりペレットを再懸濁す
る。ｂ．サンプルチューブを１０,０００ｒｐｍ（〜６０００×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を捨てる。

【００２４】（３．最終洗浄）ａ．５００μｌの洗浄液ＩＩ（ＤＥＰＣ処理したＨ₂Ｏ中の２０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ塩化ナトリウムに、無水エタノールを最終濃
度が７０％Ｖ／Ｖになるように加えた）を、遠心分離チューブに添加し、そし
て５秒間ボルテックスすることによりペレットを再懸濁する。ｂ．サンプルチューブを１０,０００ｒｐｍ（〜６０００×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を捨てる。ｃ．工程３ａおよび３ｂを繰り返す。ｄ．ペレットの上部の全ての液体を除去し、そして５５℃で５分間風乾する。

【００２５】（４．ＲＮＡの可溶化）ａ．１００〜２００μｌのＤＥＰＣ水をペレットを含むチューブに添加し、そ
して５秒間ボルテックスする。室温で２分〜５分間、静置させる。ｂ．即時にチューブを氷上に置くか、または−８０℃で保存する。

【００２６】（５．溶解物上清からのゲノムＤＮＡの回収：）（ＤＮＡ沈殿）ａ．４０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム溶液を工程１ｅの上清に添加し、そして１
秒間ボルテックスすることにより混合する。ｂ．４００μｌの無水エタノールを添加し、そしてボルテックスすることによ
り混合した（総容積６４０μｌ）。室温で１０分間、静置させる。ｃ．サンプルチューブを１０,０００ｒｐｍ（〜６０００×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を捨てる。

【００２７】（洗浄）ｄ．ペレットを洗浄液ＩＩの溶液５００μｌに再懸濁する。チューブを２秒〜
４秒間ボルテックスする。ｅ．サンプルチューブを１０,０００ｒｐｍ（〜６０００×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を捨てる。ｆ．工程ｄおよびｅを繰り返す。ｇ．ペレットの上方の全ての液体を取り除き、そして５５℃で５分間風乾する
。

【００２８】（ＲＮＡの可溶化）ｈ．１０ｍＭＴｒｉｓ塩酸、０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液１０
０μｌ〜２００μｌをペレットを含むチューブに添加し、そして５秒間ボルテッ
クスする。４０℃で１０分間インキュベートし、そして５秒間ボルテックスする
。ｉ．チューブを氷上に置くか、または−１５℃で保存する。

【００２９】（実施例２）（精製トレイカラムでの培養細胞および組織由来の総ＲＮＡおよびＤＮＡの精
製のための手順）（Ａ．ＲＮＡの精製）（１．核酸の濾過）ａ．（細胞懸濁液から）１００μｌの細胞溶解溶液（実施例１を参照のこと）を
、１００μｌのＰＢＳ緩衝溶液中に細胞懸濁液を含むサンプルチューブに添加す
る。（接着細胞を有する細胞培養プレートから）１００μｌの細胞溶解溶液を、培養
培地が取り除かれた９６ウェルの細胞培養プレートの個別のウェルに添加する。
（動物細胞から）１ｍｇ〜３ｍｇの組織を切除し、そしてＰＢＳ緩衝液で洗浄す
る。組織をマイクロホモジネ―ションチューブ中に置く。１００μｌの細胞溶解
溶液を添加し、そして電動ピストル（ｐｉｓｔｌｅ）で３０秒間ホモジナイズす
る。ホモジネートを室温で１０分間、静置させる。細胞細片粒子を全く含まない
ように注意して、ホモジネート懸濁液の上部５０μｌを取り除く。その透明なホ
モジネートを、きれいなサンプルチューブ中に置き、そして５０μｌのＰＢＳま
たはＲＮａｓｅを含まない水で希釈する。そのサンプルを、ピペット動作で３回
〜５回注排水することによって混合する。４℃で１時間インキュベートする。工
程１ｃに飛ぶ。ｂ．そのサンプルを、ピペット動作で、２００μｌピペットマンチップ（１７
５μｌに設定）を通して、３回〜５回注排水することによって、混合する。チュ
ーブを覆い、そして室温で１０分間、静置させる。（細胞コントロール溶解物および細胞懸濁溶解物のために：）４℃で１時間イン
キュベートする。（細胞培養プレート溶解物のために：）１００μｌの１０ｍＭトリス塩酸、０．
１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加により溶解物を希釈し、そしてサンプル
を、ピペット動作で３回〜５回注排水することによって混合する。４℃で１時間
インキュベートする。ｃ．プレウェット（ｐｒｅ−ｗｅｔ）トレイフィルタ：９６ウェル精製トレイ
の選択したウェルに、５０μＬの洗浄緩衝液Ｉ（実施例Ｉを参照のこと）を添加
する。その溶液をトレイフィルタに五分間浸透させる。ｄ．溶解物を、２００μｌチップを通して、１０回〜１５回注排水することに
より、ＤＮＡを剪断する。ｅ．溶解混合物をトレイウェルに移す。カラムトレイを８〜１０インチＨｇで
減圧し、そして空気がフィルタを通過するまで１滴／３〜５秒の速度でろ過する
。ＤＮＡを精製の後に回収する場合、適切な９６ウェルサンプルトレイ中にフロ
ースルーを収集する。

【００３０】（２．精製洗浄）ａ．トレイウェルを４００μｌの洗浄液Ｉで一度流す。空気がフィルタを通過
するまで８〜１０インチＨｇで減圧する。

【００３１】（３．最終洗浄）ａ．トレイウェルを５００μｌのＲＮＡ洗浄液ＩＩで流す。注意してウェルの
側面をリンスする。ｂ．トレイウェルを３００μｌのＲＮＡ洗浄液ＩＩで二度洗浄する。フロース
ルー（濾液）を捨てる。ｃ．トレイウェルを３０ｍｌの空気で（または３０秒）パージし、残留エタノ
ールを取り除く。

【００３２】（４．ＲＮＡの溶出）ａ．精製トレイを９６ウェルＰＣＲトレイ（サンプル保存トレイ）の上に置く
。ｂ．０．０１％アジ化ナトリウムを含む１５０μｌの０．１ｍＭＥＤＴＡを
精製トレイフィルタの上部に添加する。２０〜２５℃で５分間インキュベートす
る。ｃ．液体が全てのトレイフィルタメンブランの上部に接するまで、２〜４イン
チの減圧下で、コレクションチューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐウェル）中を流す。
ｄ．減圧を５〜１０秒間で１０インチＨｇへ増加する。ｅ．即時にチューブを氷上に置くか、または−８０℃で保管する。

【００３３】（Ｂ．ＤＮＡの精製）（１．ＤＮＡの精製および濾過）総ＲＮＡ精製手順において収集された細胞溶解濾液より：ａ．４０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム溶液を溶解物の濾液へ添加し、そしてピペ
ット動作で、２００μｌピペットマンチップ（２００μｌに設定）を通して、３
回〜５回注排水することにより、混合する。ｂ．３００μｌの無水エタノールを添加し、そしてピペット動作により混合す
る（総容積；５５０μｌ）。ｃ．プレウェット精製トレイフィルタ：選択された第二の９６ウェルフィルタ
精製トレイのウェルに、５０μｌの洗浄緩衝液ＩＩを添加する。その溶液を精製
トレイフィルタに浸透させる。ｄ．溶解混合物を、精製トレイウェルに移す。トレイを８〜１０インチＨｇで
減圧し、そして空気がフィルタを通過するまで１滴／３〜５秒の速度でろ過する
。フロースルーを捨てる（廃棄へ出す）。

【００３４】（２．洗浄）ａ．精製トレイウェルを５００μｌの洗浄液ＩＩで流す。注意してウェルの側
面をリンスする。ｂ．トレイウェルを３００μｌの洗浄液ＩＩで二度洗浄する。フロースルー（
濾液）を捨てる。ｃ．トレイウェルを３０ｍｌの空気で（または３０秒）パージし、残留エタノ
ールを取り除く。

【００３５】（３．ＤＮＡの溶出）ａ．精製トレイを９６ウェルＰＣＲトレイ（または２００μｌコレクショント
レイ）の上に置く。ｂ．１５０μｌの０．１ｍＭＥＤＴＡをカラムメンブランに添加する。５０
℃で５分間インキュベートする。ｃ．液体が全てのトレイフィルタメンブランの上部に接するまで、２〜４イン
チの減圧下で９６ウェルＰＣＲトレイ中に流す。ｄ．減圧を５〜１０秒間で１０インチＨｇへ増加する。サンプルトレイを４℃
〜８℃で保存する。

【００３６】（実施例３）（スピンカラムを用いる培養細胞および組織由来の総ＲＮＡおよびＤＮＡの精
製のための手順）（Ａ．ＲＮＡの精製）（１．核酸の濾過）ａ．（細胞懸濁液から）１００μｌの細胞溶解溶液を、１００μｌのＰＢＳ緩衝
溶液中に細胞懸濁液を含むサンプルチューブに添加する。（接着細胞を有する細胞培養プレートから）１００μｌの細胞溶解溶液を、培養
培地が取り除かれた９６ウェルの細胞培養プレートの個別のウェルに添加する。
（動物組織から）１ｍｇ〜３ｍｇの組織を切除し、そしてＰＢＳ緩衝液で洗浄す
る。組織をマイクロホモジネ―ションチューブ中に置く。１００μｌの細胞溶解
溶液を添加し、そして電動ピストル（ｐｉｓｔｉｌ）で３０秒間ホモジナイズす
る。ホモジネートを室温で１０分間、静置させる。細胞細片粒子を全く含まない
ように注意して、ホモジネート懸濁液の上部５０μｌを取り除く。その透明なホ
モジネートを、きれいなサンプルチューブ中に置き、そして５０μｌのＰＢＳま
たはＲＮａｓｅを含まない水で希釈する。そのサンプルを、ピペット動作で３回
〜５回注排水することによって混合する。４℃で１時間インキュベートする。工
程１ｃに飛ぶ。ｂ．そのサンプルを、ピペット動作で、２００μｌピペットマンチップ（１７
５μｌに設定）を通して、３回〜５回注排水することにより混合する。チューブ
を覆い、そして室温で１０分間、静置させる。（細胞懸濁溶解物のために：）４℃で１時間インキュベートする。（細胞培養プレート溶解物のために：）０．１ｍＭＥＤＴＡを含む１００μｌ
の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加により溶解物を希釈し、そ
してサンプルを、ピペット動作で３回〜５回注排水することによって混合する。
４℃で１時間インキュベートする。ｃ．プレウェット（ｐｒｅ−ｗｅｔ）スピンカラムフィルタ：５０μＬの洗浄
緩衝液Ｉを添加する。その溶液をカラムフィルタに５分間浸透させる。ｄ．溶解物を、２００μｌチップを通して、１０回〜１５回注排水することに
より、ＤＮＡを剪断する。ｅ．溶解混合物をスピンカラムウェルに移す。２０００ｒｐｍで６０秒間、遠
心分離する。スピンカラム挿入物を、きれいなコレクションチューブに移す。Ｄ
ＮＡをサンプルから回収する場合、細胞溶解物の濾液を含むコレクションチュー
ブを保存する。

【００３７】（２．精製物の洗浄）５００μｌの洗浄液Ｉをスピンカラムに添加する。２０００ｒｐｍで２分間、
遠心分離する。濾液（フロースルー）を取り除き、そして捨てる。５００μｌの
洗浄液Ｉの添加の工程を繰り返す。カラム挿入物をコレクションチューブ中に戻
す。

【００３８】（３．最終洗浄）ａ．５００μｌの洗浄液ＩＩをスピンカラムに添加する。注意して挿入物の側
面をリンスする。２０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、ろ過する。ｂ．５００μｌの洗浄液ＩＩを用いて上記工程を二度繰り返し、そして２００
０ｒｐｍで２分間、遠心分離する。８０００ｒｐｍでさらに１分間、遠心分離す
る。濾液を捨てる。ｃ．スピンカラム挿入物をきれいなコレクションチューブへ移す。

【００３９】（４．ＲＮＡの溶出）ａ．２００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）を、スピンカラムに添加する。２０〜２５℃で５分間インキュベートす
る。ｂ．コレクションチューブ中に、４０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離する（総
容積６４０μｌ）。ｃ．スピンカラム挿入物を取り出し、そして捨てる。即時に、コレクションチ
ューブを氷上に置くか、または−８０℃で保存する。

【００４０】（Ｂ．ＤＮＡの精製）（１．ＤＮＡの精製および濾過）総ＲＮＡ精製手順において収集された細胞溶解物濾液より：ａ．４０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム溶液を溶解物の濾液へ添加し、そしてピペ
ット動作で、２００μｌピペットマンチップ（２００μｌに設定）を通して、３
回〜５回注排水することにより、混合する。ｂ．４００μｌの無水エタノールを添加し、そしてピペット動作により混合す
る（総容積；６４０μｌ）。ｃ．プレウェットスピンカラムフィルタ：スピンカラム挿入物のフィルタメン
ブラン（以下の２ａを参照のこと）に、３０μｌの洗浄緩衝液ＩＩを添加する。
その溶液をフィルタに浸透させる。ｄ．溶解混合物を、スピンカラム挿入物へ移す。２０００ｒｐｍで６０秒間遠
心分離する。フロースルー（濾液）を捨てる。コレクションチューブの含有物を
吸引し、そして再使用する。

【００４１】（２．洗浄）ａ．５００μｌの洗浄液ＩＩをスピンカラム挿入物に添加する。注意してウェ
ルの側面をリンスする。２０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、そしてフロース
ルーを捨てる。ｂ．５００μｌの洗浄液ＩＩの添加をともなう工程１（ａ）を二回繰り返す。
ｃ．８０００ｒｐｍでさらに６０秒間、遠心分離し、残留エタノールを取り除
く。

【００４２】（３．ＤＮＡの溶出）ａ．スピンカラムコレクションチューブを、きれいなチューブに置き換える。
ｂ．２００μｌの加熱（７０℃）ＴＢＥ緩衝液をカラム挿入物に添加する。５
０℃で５分間インキュベートする。ｃ．スピンカラムを２０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。ｄ．挿入物を取り除き、そして捨て、そしてコレクションチューブを４℃〜８
℃で保管するか、または−１５℃で凍結して保存する。

【００４３】（参考文献の援用）本明細書中の全ての研究論文および文献（特許を含む）を、本明細書で参考と
して援用する。

【００４４】（等価物）本発明は、特定の方法および特定の実施態様を参照して記載されているが、種
々の改変および変更は、本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解され
る。これらおよび他の等価物は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者モーリング，ステファンイー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94038，モスビーチ，カリフォルニアアベニュー 423 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA20 4C057 AA05 BB02 BB05 DD01 MM04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＲＮＡおよびＤＮＡを含有する核酸組成物から、ＲＮＡを単
離する方法であって、該方法は、該核酸組成物からＲＮＡ含有沈殿物を形成する工程であって、ここで、該ＲＮ
Ａ含有沈殿物中のＲＮＡ対ＤＮＡの比率が、該核酸組成物中の該ＲＮＡにおける
ＲＮＡ対ＤＮＡの比率よりも少なくとも２倍高い工程、および該ＲＮＡ含有沈殿
物を収集する工程を包含する方法であって、それによりＲＮＡを枯渇した溶液が
生成される、方法。
【請求項２】前記ＲＮＡ含有沈殿物を可溶化する工程を包含する、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】前記核酸組成物からＲＮＡ含有沈殿物を形成する工程が、該
核酸組成物にカオトロピック塩を添加する工程を包含する、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記カオトロピック塩が、チオシアン酸グアニジンおよび塩
酸グアニジンから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジンである、請求項４
に記載の方法。
【請求項６】前記核酸組成物中の前記塩酸グアニジンの濃度が、１Ｍ〜４
Ｍの範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】前記カオトロピック塩が、チオシアン酸グアニジンである、
請求項４に記載の方法。
【請求項８】前記核酸組成物中の前記チオシアン酸グアニジンの濃度が、
０．５Ｍ〜３Ｍの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】ＤＮＡおよびＲＮＡを含有する前記核酸組成物が、細胞を溶
解することにより形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記細胞溶解の工程が、界面活性剤の添加を包含する、請
求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記界面活性剤が、洗剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】前記核酸含有組成物が、前記ＲＮＡ含有沈殿物の生成に十
分な時間、４〜２５℃の範囲の温度でインキュベートされる、請求項３に記載の
方法。
【請求項１３】前記時間が、１時間以下である、請求項１２に記載の方法
。
【請求項１４】前記ＲＮＡ含有沈殿物が、濾過、遠心分離、および重力沈
降から成る群から選択される方法により収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】ＲＮＡおよびＤＮＡを含有する核酸組成物からＤＮＡを単
離する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法に従いＲＮＡを単離し、前記ＲＮＡを枯渇した溶液に核酸沈殿剤を添加し、それによりＤＮＡ含有沈殿
物が形成され、該ＤＮＡ含有沈殿物を収集する、方法。
【請求項１６】前記核酸沈殿剤が、エタノールである、請求項１５に記載
の方法。
【請求項１７】前記カオトロピック塩が、チオシアン酸グアニジンおよび
塩酸グアニジンから成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀の比率により測定される前記精製したＲＮＡ
の純度が、少なくとも１．８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀の比率により測定される前記精製したＲＮＡ
の純度が、少なくとも２．０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】請求項１に記載の方法を行うためのキットであって、該キ
ットは、細胞溶解緩衝液、グアニジン塩、およびＲＮＡ含有沈殿物を収集するた
めの濾過装置を含有する、キット。
【請求項２１】細胞からＲＮＡを単離するシステムであって、該システム
は、細胞溶解チャンバ、沈殿物コレクタ、カオトロピック塩の導入のためのポー
トを含有する、システム。
【請求項２２】さらにカオトロピック塩リザーバーを含有する、請求項２
１に記載のシステム。