CN117701780B - 汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒高通量测序，具体涉及汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组及其应用。所述引物组包括如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.20所示的10对叠瓦式PCR扩增引物。通过使用该引物组进行PCR靶向捕获汉滩病毒全基因组，经捕获后的PCR产物可直接对接二代和三代测序平台进行文库构建和基因组序列测定，获得高质量的汉滩病毒全基因组序列。
Description
技术领域
本发明涉及病毒高通量测序，具体涉及汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组及其应用。
背景技术
汉滩病毒（Orthohantaan viurs，HTNV）可引起肾综合征出血热，是导致重症、危重症肾综合征出血热的主要病原，主要存在于啮齿类动物中。HTNV基因组为分节段的RNA病毒，基因组分为大（L）、中（M）、小（S）三个片段，大小分别约为6.3kb、3.6kb、1.7kb。分节段的RNA病毒在自然界易变异和重组，近年来啮齿类动物中新基因亚型的HTNV不断被发现，对人类生命安全产生严重威胁，因此需要建立一套快速、方便、经济、有效的获取汉滩病毒基因组的方法来监测病毒的变异情况。
病原宏基因组测序以及探针捕获测序是目前针对病原最常用的基因测序方法，这些方法可一次性完成包括HTNV在内的细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测，但是操作过程复杂、引物数量多、检测时间长、背景信号高、测序深度低、成本高，对于未经培养的样本很难获得全基因组的序列，无法实现大量样本的检测以及大规模的应用。
发明内容
基于此，本发明提供汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组及其应用，至少解决现有技术中的一个问题。
第一方面，本发明提供一种汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组，其包括如SEQ IDNo. 1- SEQ ID No. 20所示的10对叠瓦式PCR扩增引物。
其中，SEQ ID No. 1为TAGTAGTAGACTCCCTAAGTGACAA，SEQ ID No. 2为GTGTGTTTAGTAGTAGAATACTCTTG，SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示引物构成一对；
SEQ ID No. 3为AAGAGTGGTGAAAAACATGG，SEQ ID No. 4为CTCAGCCAACTCTGCATTTTC，SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示引物构成一对；
SEQ ID No. 5为CTGAGGTAACTACCTGTTTCTT，SEQ ID No. 6为CAGCACAACCTTCAAAGAATG，SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示引物构成一对；
SEQ ID No. 7为ACCACTCAGATGATGCCC，SEQ ID No. 8为GTCTTTAGGTCAACAGATAAGG，SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示引物构成一对；
SEQ ID No. 9为TTGGCTATAAGTTTGCTGTGAC，SEQ ID No. 10为ATCATGCTGTGCAATTGCAC，SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示引物构成一对；
SEQ ID No. 11为ACAGAATCTGGATTTGAATGGG，SEQ ID No. 12为TAGTAGTAGTACGCTCCGGAA，SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示引物构成一对；
SEQ ID No. 13为TAGTAGTAGACACCGCAA，SEQ ID No. 14为CCTATGACTAAGGTCTTTG，SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示引物构成一对；
SEQ ID No. 15为GGCATCATGTGAGGCAT，SEQ ID No. 16为AAACTGCCTGGGAACTC，SEQID No. 15和SEQ ID No. 16所示引物构成一对；
SEQ ID No. 17为GGTTGTAACCCAGCAGATTG，SEQ ID No. 18为TAGTAGTAGACTCCGCAAGATGTT，SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示引物构成一对；
SEQ ID No. 19为TAGTAGTAGACTCCCTAAAGA，SEQ ID No. 20为TAGTAGTAGTATGCTCCCTAA，SEQ ID No. 19和SEQ ID No. 20所示引物构成一对。
通过使用所述汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组进行PCR靶向捕获汉滩病毒全基因组，经捕获后的PCR产物可直接对接二代和三代测序平台进行文库构建和基因组序列测定，获得高质量的汉滩病毒全基因组序列。
第二方面，本发明提供所述汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组在汉滩病毒靶向基因组高通量测序中的应用。
第三方面，本发明提供一种汉滩病毒靶向基因组高通量测序方法，其包括以下步骤：
提取待测序核酸；
将所述汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组和所述待测序核酸加入至PCR扩增体系，进行反转录和靶向扩增，并纯化DNA产物；
进行文库构建和序列测定。
在一些优选的实施方式中，所述将所述汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组和所述待测序核酸加入至PCR扩增体系具体为：将所述汉滩病毒全基因组靶向捕获引物组分为pool1、pool2和pool3三组，分别加入至PCR扩增体系，并分别加入待测序核酸。
在一些优选的实施方式中，每个PCR扩增体系加入5微升待测序核酸。
在一些优选的实施方式中，所述反转录和靶向扩增的PCR程序为：
50℃ 30min；
94℃ 2min；
94℃ 15s，52℃ 30s，68℃ 1min 45s，30个循环；
68℃ 5 min。
在一些优选的实施方式中，采用AMPure XP磁珠纯化DNA产物。
在一些优选的实施方式中，采用第二代测序技术进行文库构建和序列测定。
在一些优选的实施方式中，采用第三代测序技术进行文库构建和序列测定。
由于采用了以上技术方案，本发明的实施例至少具有以下有益效果：
（1）有效提高高通量测序信噪比，降低背景信息，靶向捕获得到的目标基因组（mapping）占比可达99%以上；低浓度的样本（Ct值31以内），基因组覆盖度可达99%以上，平均测序深度6000以上；
（2）适用性广，仅通过10对针对汉滩病毒保守区设计的引物靶向捕获病毒基因组，减少了引物对基因组的影响，有利于对病毒变异的监测；靶向捕获后可对接ABI IonGeneStudio S5、illumina和Nanopore等高通量测序平台进行文库构建和序列测定；
（3）较少的测序数据就可以获得全基因组序列，对于可以实时分析测序平台的高通量测序平台，短时间内即可获得全基因组序列；采用Nanopore平台 （GridION X5）测序，从样本接收到获得全基因组序列最快5h；
（4）经济，一块测序芯片可用于多个样本检测，大大降低测序成本。
附图说明
图1为本发明实施例中引物组靶向捕获HTNV全基因组示意图。
图2为本发明实施例中PCR产物凝胶电泳图。
图3为本发明实施例中基于汉滩病毒靶向捕获进行三代测序基因组覆盖度和测序深度图。
图4为本发明实施例中基于汉滩病毒靶向捕获二代测序（illumina平台）基因组覆盖度和测序深度图之一。
图5为本发明实施例中基于汉滩病毒靶向捕获二代测序（illumina平台）基因组覆盖度和测序深度图之二。
图6为本发明实施例中基于汉滩病毒靶向捕获二代测序（illumina平台）基因组覆盖度和测序深度图之三。
具体实施方式
以下将对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。
基于多重PCR原理，采用针对特定病毒基因全序列设计叠瓦式靶向扩增引物的基因组捕获方法可减少文库构建操作步骤，有效降低测序背景信号，提高待测病毒基因组数据占比和测序深度，并获得高质量全基因组序列，可实现一块测序芯片进行多个样本测序，降低测序成本。
本发明通过比对现有HTNV基因组全序列，针对保守区域设计10对叠式PCR扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真酶扩增体系，仅需少量病毒RNA便可有效的捕获出汉滩病毒全基因组，可对接二代和三代测序平台，可快速、方便、高效地获得高质量的HTNV全基因组序列，实现HTNV的检测和基因变异分析研究。
具体地，本发明提供一种HTNV全基因组靶向捕获的引物组，所述引物组包括针对HTNV基因组设计的10对叠瓦式PCR扩增引物，引物序列依次为SEQ ID No. 1- SEQ IDNo.20。针对病毒全基因组相对保守区域设计合理的多重PCR引物对组合，获得片段大小不同的扩增子，实现了基因组全覆盖，所有引物组分为3个pool，每个pool 含3-4对引物同时PCR捕获，减少了核酸和扩增试剂的用量，通过对引物组合调试，降低了引物之间相互干扰，使得在较少测序数据量就能获得全基因组序列，可以经济、高效的进行HTNV基因组测序。
在以下实施例中，HTNV样本均为来自江西省疾病预防控制中心经Vero-E6细胞分离保存的病毒株。
实施例1：靶向捕获后建库测序和RNA直接建库测序比较
按照以下步骤进行测序：
1．引物设计和使用
使用针对HTNV保守区域设计的10对扩增引物，覆盖HTNV基因组全长（表1和图1）。各引物对单独PCR反应，将得到大小不同的汉滩病毒基因片段（图2）。
表110对扩增引物
这10对扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2．核酸提取
使用广州达安基因股份有限公司生产的达安基因自动核酸提取仪和核酸提取试剂或纯化试剂（磁珠法）提取HTNV分离株样本核酸。
3．RNA反转录和靶向扩增
采用Invitrogen Super Sprit III One-Step RT-PCR扩增体系进行反转录和靶向扩增。将引物分别合并成pool1、pool2和pool3三组，分别加入至扩增体系，每个反应体系加入5微升样本核酸，按照如下PCR程序扩增出HTNV病毒的全基因组：
靶向捕获时间约2.5h。其中，Pool1包括引物M2-F、M2-R、L1-F、L1-R、L3-F和L3-R，Pool2包括引物M1-F、M1-R、L2-F、L2-R、L4-F、L4-R、L6-F和L6-R，Pool3包括引物S1、S2、L5-F、L5-R、M3-F和M3-R，这样的分组可以将扩增反应减少到3个，降低了核酸的使用量和扩增试剂的用量，避免了引物之间的干扰。
4．扩增产物回收
PCR反应结束后，将三个pool 反应的产物合并，采用AMPure XP磁珠（BeckmanCoulter生产）纯化DNA产物，采用Qubit 4.0对纯化产物进行定量。
5．文库构建和基因测序
采用Thermo Fisher Scientific公司生产的Ion ShearTMPlus Regents Kit、IonPlus Fragment Library Kit、Ion520TM＆Ion530TMOT2 Reagents试剂盒进行文库构建和IonSphereTMParticles 生成，采用Ion 530TM芯片及Ion GeneStudio S5平台进行序列测定。
另外，设置对照实验：采用Nugen Ovation®RNA-Seq System 试剂盒（NuGEN公司），根据说明书对病毒RNA进行第一链逆合成、第二链逆合成、SPIA扩增；合成的DNA产物经AMPure XP磁珠回收；回收的DNA根据上述步骤5进行文库构建和基因测序。
结果显示，靶向捕获后建库可有效提高目标基因组reads数占比，提升测序深度和基因组覆盖度。靶向捕获后建库与RNA直接建库测序数据比较见表2。RNA直接建库方法目标基因组reads数仅占总reads数的0.02%，而采用特异性引物组合靶向捕获建库基因组占比79.23%，基因组覆盖度为100%。RNA直接建库中RNA逆转录步骤共需要4h，而靶向捕获过程仅2.5h。
表2靶向捕获后建库与RNA直接建库测序数据比较
实施例2：采用三代测序平台对HTNV实时测序
对另一HTNV分离株样本按照实施例1步骤1-步骤4进行靶向捕获，采用 OxfordNanopore Kits: SQK-LSK110 进行文库构建，在GridION X5 测序仪上进行序列测定。
结果显示，三代测序可以实时分析测序数据，收集24.5M的三代原始测序数据进行基因组组装分析，过滤后的数据量为20.6M，目标基因组数据量为17.6M（85.4%），基因组30X覆盖度为100%。从核酸提取开始至获得基因组测序总时长为5h。由此可知，短时间内、较少的测序数据就可以获得全基因组序列。
收集996.3M原始测序数据进行基因组组装分析，全基因组测序深度均在20000以上（图3）。
实施例3：不同病毒含量HTNV样本同时测序
选取4份病毒含量不同HTNV样本鼠肺，按照实施例1步骤1-步骤4进行靶向捕获，采用Nextera XT Library Prep Kit（illumina生产）试剂盒进行文库构建，4份样本的文库合并后加入测序卡夹，采用一块MinseqTMFlow Cell测序芯片在illumina Mini Seq测序仪上进行序列测定。
4份样本测序数据见表3，样本编号1的基因组覆盖度和测序深度如图4至图6所示。Ct值20.7-31.28的四份样本同时测序，基因组平均深度在6000以上，基因组覆盖度在99.7%以上。
表3不同病毒量样本同时测序数据
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同或等同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内，其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (8)
1.一种汉滩病毒HTNV全基因组靶向捕获引物组，其特征在于，包括如SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 20所示的10对叠瓦式PCR扩增引物。
2.根据权利要求1所述汉滩病毒HTNV全基因组靶向捕获引物组在汉滩病毒靶向基因组高通量测序中的应用。
3.一种非诊断目的汉滩病毒HTNV靶向基因组高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测序核酸；
将权利要求1所述汉滩病毒HTNV全基因组靶向捕获引物组分为pool1、pool2和pool3三组，分别加入至PCR扩增体系，并分别加入待测序核酸，进行反转录和靶向扩增，并纯化DNA产物；
进行文库构建和序列测定；
其中，pool1包括引物M2-F、M2-R、L1-F、L1-R、L3-F和L3-R，Pool2包括引物M1-F、M1-R、L2-F、L2-R、L4-F、L4-R、L6-F和L6-R，Pool3包括引物S1、S2、L5-F、L5-R、M3-F和M3-R；所述引物序列如下表所示：
。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每个PCR扩增体系加入5微升待测序核酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反转录和靶向扩增的PCR程序为：
50℃ 30min；
94℃ 2min；
94℃ 15s，52℃ 30s，68℃ 1min 45s，30个循环；
68℃ 5 min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用AMPure XP磁珠纯化DNA产物。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用第二代测序技术进行文库构建和序列测定。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用第三代测序技术进行文库构建和序列测定。
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- 2024-02-06 CN CN202410166465.8A patent/CN117701780B/zh active Active
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|---|---|
| CN117701780A (zh) | 2024-03-15 |
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