CN110373502A

CN110373502A - 一种用于以rpa检测汉滩病毒的成套核酸、试剂盒以及检测方法

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Publication number: CN110373502A
Application number: CN201910795040.2A
Authority: CN
Inventors: 韩一芳; 张锦海; 齐永; 汪春晖; 叶福强; 王太武; 张琪; 胡丹; 郑懿; 王长军
Original assignee: Center For Disease Control And Prevention In Eastern War Zone Of Chinese People's Liberation Army
Current assignee: Center For Disease Control And Prevention In Eastern War Zone Of Chinese People's Liberation Army
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110373502B

Abstract

本发明提供一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸、试剂盒以及检测方法。该成套核酸包括引物对和探针；引物对包括正向引物与反向引物，正向引物序列为SEQ ID NO.2，反向引物序列为SEQ ID NO.3；探针序列为SEQ ID NO.4。该试剂盒含有该成套核酸。该检测方法采用该试剂盒。本发明可在接近体温条件下实现扩增，扩增产物可通过一次性核酸检测装置实现可视化判别，具有高灵敏度、高特异性，且对硬件设备的要求很低，反应时间短，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测等优点，适于推广应用。

Description

一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸、试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸、试剂盒以及检测方法，该成套核酸包括引物和探针，属于生物技术领域。

背景技术

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起的以高热、出血、血压低、蛋白尿等肾功能损害为特征性临床表现的自然疫源性疾病，以鼠为主要传染源，当吸入病毒污染的气溶胶、皮肤或伤口直接接触宿主动物排泄物和分泌物、误食被宿主动物排泄物污染的食物均可造成感染。HFRS在全世界每年约有6～10万病例,主要分布在欧亚大陆，死亡率为3％～10％。我国是世界范围内HFRS的主要流行地区，病例数每年约5～8万，占全球的80％以上。

汉坦病毒包括汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)等。在我国境内的主要流行型别为汉滩病毒HTNV和汉城病毒SEOV，其中汉滩病毒HTNV引起重型肾综合征出血热HFRS，也是目前生物战/生物恐怖的主要生物战剂之一。

肾综合征出血热HFRS早期常难以鉴别诊断，最终病因确认有赖于病原检测，尽快筛查并明确诊断对控制疫情至关重要。肾综合征出血热HFRS的实验室诊断方法包括用于检测病毒特异性抗体的酶联免疫吸附实验(ELISA)、反向间接血凝抑制实验、免疫荧光实验，以及检测特异性核酸的核酸探针杂交法、RT-PCR、实时定量RT-PCR。但是上述方法存在成本较高、需要特定设备、耗时或样品处理复杂等缺陷，因此实际应用中往往受到环境条件的局限。建立一种简单、快速、适合现场应用的汉滩病毒的检测方法具有实用价值和重要意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(25℃-42℃，6-30min)，作为一种等温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过侧向层析试纸条可视化判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已应用于农业、食品安全、转基因检测等多个领域。

RPA分析技术的关键在于扩增引物和探针的设计。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而长引物和长探针的设计要求必然会增加引物、探针设计的难度，也更易形成引物-引物、引物-探针互相作用造成扩增效率低下或无法扩增检测。更麻烦的是，RPA技术不像聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)或者环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification method,LAMP)那样有专门设计引物的软件，其引物设计需要人工手动设计，进一步在实验中反复验证筛选出最合适的引物对及检测探针，并需要摸索优化反应体系和条件，因此，限制了RPA技术的进一步发展和应用。

经检索发现，申请号CN200580019934.9、授权公告号CN101163498B的中国发明专利，公开了用于检测汉他病毒感染的新方法和免疫诊断测试试剂盒，该方法和试剂盒采用来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的重组N和/或G1抗原的组合；也可存在来自这些和其它汉他病毒类型的其它汉他病毒抗原。然而，该技术方案并没有采用RPA技术，无法适用RPA检测方法。

申请号CN201710020743.9、授权公告号CN106636469A的中国发明专利申请，公开了一种基于RPA技术的马尔堡病毒检测试剂盒及其应用，其马尔堡病毒的RPA引物和探针可有效扩增靶基因，且其RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在37-42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，不仅可用于马尔堡病毒感染核酸的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。

申请号CN201711395767.9、申请公布号CN107937612A的中国发明专利申请，公开了重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ IDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针。然而，上述两技术方案均不是针对汉城病毒SEOV的，无法直接适用。

申请号CN201710891059.8，申请公布号CN107574261A的中国发明专利申请公开了一种用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法，包括用于检测汉滩病毒的检测引物、汉城病毒的检测引物和普马拉病毒的检测引物及试剂盒。虽然该技术方案为汉坦病毒的恒温检测方法，但该技术方案所选LAMP引物需扩增1小时，且主要通过跑胶进行结果判断，易导致气溶胶污染。

申请号CN201811415370.6，申请公布号CN109355433A的中国发明专利申请公开了一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，包括用于检测汉坦病毒的扩增试剂，该扩增试剂包括混合汉坦病毒RT-PCR反应液和16孔微流控芯片的检测试剂。但该技术方案未能进行分型，且不能脱离价格昂贵的自动仪器，难以适用于目前现场检测等场景的现状。

目前，尚未出现利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA技术)快速检测汉滩病毒的方法。

发明内容

本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸，能用于RPA技术以检测汉滩病毒；同时，还提供含有该成套核酸的试剂盒、以及相应的检测方法。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸，其特征是，所述成套核酸包括引物对和探针；所述引物对包括正向引物与反向引物，所述正向引物序列为SEQ ID NO.2，所述反向引物序列为SEQ ID NO.3；所述探针序列为SEQ ID NO.4。

采用该成套核酸后，即能实现以RPA技术检测汉滩病毒。

本发明成套核酸进一步完善的技术方案如下：

优选地，所述反向引物的5’端标记有生物素；所述探针的第31位碱基以四氢呋喃替换，所述探针的5’端标记有荧光素，所述探针的3’端具有延伸阻断基团。

更优选地，所述荧光素为FAM或FITC，所述延伸阻断基团为磷酸基团。

更优选地，所述汉滩病毒具有序列为SEQ ID NO.1的保守基因S。

采用以上优选方案，能更有效地实现以RPA技术检测汉滩病毒。

本发明还提供：

以RPA检测汉滩病毒的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括前文所述的成套核酸。

采用该试剂盒，可顺利实现RPA检测汉滩病毒。

本发明试剂盒进一步完善的技术方案如下：

优选地，所述正向引物、反向引物的浓度分别为10μM，所述探针的浓度为5μM。

更优选地，所述试剂盒还包括TwistAmp nfo试剂盒，所述TwistAmp nfo试剂盒包括无DNase和RNase的水、缓冲液、醋酸镁溶液、以及含有冻干重组酶粉的反应管。

更优选地，所述缓冲液由：60mM pH7.9 Tris，100mM醋酸钾，2mM DTT，20M 5％碳化蜡，200μM dNTPs，3mM ATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μL肌酸激酶，30ng/μL Bsu以及水构成；所述醋酸镁溶液的浓度为280mM；所述冻干重组酶粉由45000ng gp32,7500ng uxsX,1500nguvsY构成。

采用以上优选方案，能更好地实现RPA检测汉滩病毒。

本发明还提供：

非诊断目的以RPA检测汉滩病毒的方法，其特征是，采用前文所述的试剂盒；所述方法包括以下步骤：

第一步、测定目标样品中RNA的浓度后，将目标样品稀释到预设的RNA浓度，然后取预定体积的目标样品进行反转录并获得cDNA，此即待测样品；采用所述试剂盒，加入待测样品以配制成反应体系，然后利用所述成套核酸进行RPA反应；

第二步、采用一次性核酸检测装置对RPA反应产物进行检测，并观察该装置在T位置和C位置是否分别显示有指示条带，若T位置和C位置均显示有指示条带、则目标样品为汉滩病毒阳性，若C位置显示有指示条带且T位置未显示指示条带、则目标样品为汉滩病毒阴性，若C位置未显示指示条带则本次检测无效。

采用该方法即可顺利实现RPA检测汉滩病毒。

本发明检测方法进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步的具体过程如下：

S1.测定目标样品中RNA的浓度后，将目标样品稀释到RNA浓度为10⁵copies/μL，然后取1μL的目标样品进行反转录并获得cDNA，此即待测样品；

S2.将正向引物、反向引物、探针、无DNase和RNase的水、缓冲液组成预混液，将预混液与目标样品混匀后加到含有冻干酶粉的反应管中，然后将醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；

S3.将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后RPA反应扩增；在RPA反应扩增至预设时间点时，将反应管取出再次混匀后继续RPA反应扩增。

优选地，第一步中，所述反应体系为50μL RPA反应体系；S1中，正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，探针0.6μL，无DNase和Rnase的水12.2μL，缓冲液29.5μL，目标样品1μL，醋酸镁溶液2.5μL；S2中，RPA反应的温度为37℃，RPA反应扩增总时间为17.5-20min，预设时间点为RPA反应扩增的第4分钟；第二步中，所述一次性核酸检测装置为通用型核酸扩增快速检测装置，其生产厂家包括杭州优思达生物技术有限公司。

采用以上优选方案，能更好地实现RPA检测汉滩病毒。

本发明将RPA技术应用于汉滩病毒HTNV的检测，可在接近体温条件下实现扩增，扩增产物可通过一次性核酸检测装置实现可视化判别，检测时间短。本发明扩增所需的酶和一些其他必要试剂可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入缓冲液、引物、探针和样品/模板，并加入镁离子起始反应即可，简单且便于携带。本发明具有灵敏性高、特异性强的特点，且对硬件设备的要求很低，反应时间短，无需对样品进行复杂处理、适合现场或床旁检测等优点，适于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中HTNV-RPA检测最优引物组合筛选中不同引物组合的检测结果，图中“质控线”即指C位置，“检测线”即指T位置。

图2为本发明实施例2中HTNV-RPA检测筛选最佳反向引物和探针浓度组合结果。

图3、图4为本发明实施例2中HTNV-RPA检测方法的最佳扩增时间实验结果。

图5为本发明实施例3中HTNV-RPA检测方法的灵敏度实验结果。

图6为本发明实施例4中HTNV-RPA检测方法的特异性实验结果，自左向右依次为：阴性对照、汉城病毒SEOV重组质粒、汉滩病毒HTNV重组质粒、马尔堡病毒重组质粒、克里米亚刚果出血热病毒重组质粒、埃博拉重组质粒、登革病毒重组质粒、Q热立克次体重组质粒。

图7为本发明实施例5中HTNV-RPA检测方法的实用性实验结果，自左到右依次为：阴性对照、汉滩病毒HTNV重组质粒、空军军医大学馈赠汉滩病毒感染样品、唐都医院馈赠汉滩病毒感染样品、空军军医大学馈赠汉城病毒感染样品、空军军医大学馈赠鼠脑培养汉城病毒感染样品。

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用RPA引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、汉滩病毒HTNV引物和探针的设计及筛选

(1)引物和探针的设计

发明人实验室保藏有汉滩病毒HTNV标准株76-118保守区段S基因的阳性质粒标准品(GeneBank：M14626.1)，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将HTNV的S基因重组质粒使用体外转录试剂盒 Systems-T7(Promega，美国)进行体外转录为RNA后，使用NanoDrop测定浓度，按照公式(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度ng/μL×10^-9)/(RNA长度×340)＝copies/μL换算拷贝数，取10⁵copies/μL的RNA 1μL使用PrimeScript^TM 1st StrandcDNA Synthesis Kit(Takara，日本)进行反转录获得cDNA，在实施例1实施例2的后续引物探针筛选、反应体系优化等过程中作为模板使用。

根据RPA引物及探针设计原则，发明人及其课题组设计了多条引物和探针，利用软件并结合研发经验进行筛选比较，选定了6条引物及1条探针，如表1所示。

表1.汉滩病毒RPA扩增引物及探针

注：反向引物的5’端标记有生物素Biotin，这样正向引物和反向引物扩增所得双链DNA将标记有生物素。探针中，第31位碱基(即/idSp/)以四氢呋喃THF替换，5’端标记有荧光素(本实施例为FAM，也可为FITC)，3’端具有延伸阻断基团(本实施例为磷酸基团P)，这样，探针与扩增后标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得荧光素FAM和生物素Biotin双标记的扩增产物。

(2)引物的筛选

将正向引物与反向引物排列组合成9组，组合编号如表2所示。9组分别在37℃条件下进行RPA扩增，以一次性核酸检测装置检测线颜色为指标，筛选出37℃条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续实验。注：一次性核酸检测装置为通用耗材，可替代琼脂糖凝胶电泳，如杭州优思达公司的产品“通用型核酸扩增快速检测装置”等。

使用TwistAmp nfo试剂盒推荐50μL的RPA反应体系进行筛选，具体如下：将10μM正向引物2.1μL、10μM反向引物2.1μL、10μM探针0.6μL、12.2μL无DNase和Rnase的水、29.5μL缓冲液组成预混液，与10⁵copies/μL模板1μL混匀后加到含有冻干酶粉的0.2mL的nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后，放入反应装置中于37℃扩增20min，在反应第4分钟，将反应管取出再次充分混匀后放回反应装置中继续扩增。每一组引物组合均设置了一组阴性对照组，阴性对照组不加模板，模板体积用水补足。扩增完成后，将扩增的PCR管放入一次性核酸检测装置内芯中，检查液泡有无漏液以及位置是否正确；合上手柄，将装置竖立于水平操作台上3-5min内判读结果。

表2.引物探针组合编号

编号	组合	编号	组合
				1	1F+1R	6	2F+3R
2	1F+2R	7	3F+1R
				3	1F+3R	8	3F+2R
4	2F+1R	9	3F+3R
				5	2F+2R

9组引物组合检测结果见图1，每组组合均设置一组阴性对照，实验结果如图所示，9组引物组合的HTNV组代表实验组，Control组代表对应的阴性对照组。从该结果中可以看出，组合2F+1R的HTNV组在T位置和C位置共有两道指示条带，同时其Conrol组仅在C位置有一道指示条带，因此，确定组合2F+1R作为本发明的引物组合，即：正向引物hantaan-F-1401和反向引物hantaan-R-1532，分别具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

注：各图中结果，以2F+1R的HTNV组结果为例，从上往下数第二道线所处位置为C位置、第三道线所处位置为T位置。

实施例2：RPA反应体系、扩增和检测条件的优化

在引物筛选的过程中，一次性核酸检测装置仍存在不稳定的情况，因此需对RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化

(1)引物探针浓度

正向引物浓度保持为10μM不变，设定探针的浓度为10μM、5μM、2.5μM，反向引物的浓度梯度为10μM、5μM、2.5μM，，将三种探针浓度分别与三种浓度反向引物组合成9组，组合编号如表3所示，每组均设置阴性对照。50μL的RPA反应体系和扩增条件同实施例1，使用一次性核酸检测装置判读结果。表3反向引物浓度和探针浓度组合编号。

表3.探针浓度和反向引物浓度组合编号

编号	组合	编号	组合
				1	10μM probe1428+10μM 1R	6	5μM probe1428+2.5μM 1R
2	10μM probe1428+5μM 1R	7	2.5μM probe1428+10μM 1R
				3	10μM probe1428+2.5μM 1R	8	2.5μM probe1428+5μM 1R
4	5μM probe1428+10μM 1R	9	2.5μM probe1428+2.5μM 1R
				5	5μM probe1428+5μM 1R

结果如图2所示，从该结果中可以看出，4号组合在T位置和C位置共有两道指示条带，同时其Conrol组仅在C位置有一道指示条带，由此确定本发明的探针的浓度为5μM、反向引物的浓度为10μM。

(2)扩增反应时间

50μL的RPA反应体系如下：将10μM正向引物2.1μL、10μM反向引物2.1μL、5μM探针0.6μL、12.2μL无DNase和Rnase的水和29.5μL缓冲液组成预混液，与10⁴copies/μL模板1μL混匀后加到含有冻干酶粉的0.2mL的 nfo反应管中；然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后放入反应装置中于37℃分别扩增10min，15min，20min，均在反应第4分钟，将反应管取出再次充分混匀后放回反应装置中继续扩增。每一组均设置了阴性对照组，阴性对照组不加模板，模板体积用水补足。扩增完毕使用一次性核酸检测装置判读结果。

设定扩增时间为10min、15min、20min，且每组均设置阴性对照，实验结果如图3所示，HTNV组代表实验组，Control组代表对应的阴性对照组。

为进一步确定精准反应时间，细化扩增时间为15min、17.5min、20min，且每组均设置阴性对照，实验结果如图4所示，Control代表阴性对照。

根据图3结果可知，10min组未在T位置显示指示条带，15min组则在T位置显示较为明显的指示条带，20min组的T位置指示条带颜色较深。从细化扩增时间的结果来看，结果如图4所示，17.5min组的T位置指示条带颜色已经达到最深，与20min的T位置指示条带颜色相同，且阴性对照未出现假阳性结果，由此确定本发明的扩增时间为17.5-20min。

综上，通过对RPA反应体系、扩增时间进行优化，本发明确定以10μM正向引物、10μM反向引物和5μM探针，RPA反应扩增17.5-20min检测效果最好。

实施例3：RPA检测的灵敏度评价

将实施例1提及的汉滩病毒HTNV重组质粒，先使用体外转录试剂盒Systems-T7(Promega，美国)进行体外转录为RNA后，再使用NanoDrop测定浓度，按照公式(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度ng/μL×10^-9)/(RNA长度×340)＝copies/μL换算拷贝数，十倍比稀释得到10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL的RNA，各取1μL使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara，日本)进行反转录获得梯度cDNA，各使用1μLcDNA作为模板加入实施例2所确定的最优反应体系，利用实施例1筛选出的最优引物组合进行RPA检测，充分混匀后37℃扩增17.5min，反应第4min时将反应管取出再次充分混匀后放回反应装置。扩增完毕使用一次性核酸检测装置判读结果。观察HTNV-RPA检测的灵敏度。

结果如图5所示，10copies/μL以上样品均呈阳性，说明本发明RPA检测方法的灵敏度达到10copies/μL。

实施例4：RPA检测的特异性评价

分别以用汉城病毒SEOV重组质粒、汉滩病毒HTNV重组质粒(同实施例1)、马尔堡病毒(Marburg virus，MBV)重组质粒、克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever virus，CCHFV)重组质粒、埃博拉(Ebola virus，EBV)GP重组质粒、埃博拉(Ebola virus，EBV)VP₄₀重组质粒、登革病毒(Dengue virus，DENV)重组质粒、Q热立克次体(Coxiella burnetii，Q)重组质粒进行体外转录，进行体外转录，所获得RNA经浓度测定后换算拷贝数，均使用1μL 10⁵copies/μL的RNA进行反转录，各使用1μL cDNA作为模板加入实施例2所确定的最优反应体系，利用实施例1筛选出的最优引物组合进行RPA检测，充分混匀后37℃扩增17.5min，反应第4min时将反应管取出再次充分混匀后放回反应装置。扩增完毕使用一次性核酸检测装置判读结果。

结果见图6：阴性对照、汉城病毒SEOV重组质粒、马尔堡病毒(Marburg virus，MBV)重组质粒、克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)重组质粒、埃博拉(Ebola virus，EBV)GP重组质粒、埃博拉(Ebola virus，EBV)VP₄₀重组质粒、登革病毒(Dengue virus，DENV)重组质粒、Q热立克次体(Coxiella burnetii，Q)重组质粒均未出现T位置指示条带，呈阴性；只有汉滩病毒HTNV重组质粒检测出现清晰的T位置指示条带，呈汉滩病毒阳性，说明本发明RPA检测方法对汉滩病毒HTNV有很强的特异性。

实施例5：非诊断目的以RPA检测汉滩病毒HTNV临床样品评价

以非诊断目的评价本发明RPA检测方法对肾综合征出血热临床样品的检测效果。

将汉滩病毒HTNV重组质粒(同实施例1)进行体外转录，所获得RNA经浓度测定后换算拷贝数，使用1μL 10⁵copies/μL的RNA进行逆转录获得cDNA，作为待测样品之一。

将空军军医大学微生物教研室馈赠汉滩病毒感染细胞样品、汉城病毒感染细胞样品、汉城病毒感染鼠脑样品、唐都医院馈赠汉滩病毒感染样品作为目标样品，先进行RNA浓度测定，并稀释到10⁵copies/μL的RNA浓度，再进行反转录获得cDNA，分别为H-sample1、S-sample1、S-sample2、H-sample2，并分别作为待测样品。

采用如下反应体系：将10μM正向引物2.1μL、10μM反向引物2.1μL、5μM探针0.6μL、12.2μL无DNase和Rnase的水和29.5μL缓冲液组成预混液，与1μL目标样品混匀后加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后放入反应装置中于37℃扩增20min，在反应第4分钟，将反应管取出再次充分混匀放回反应装置。扩增完毕使用一次性核酸检测装置判读结果。

结果见图7：空军军医大学微生物教研室馈赠汉滩病毒感染细胞样品及唐都医院馈赠汉滩病毒感染样品(H-sample1和H-sample2)重组质粒均出现清晰的T位置指示条带，汉城病毒感染细胞样品(S-sample1)、汉城病毒感染鼠脑样品(S-sample2)、阴性对照均未出现T位置指示条带，说明本发明RPA检测方法对汉滩病毒HTNV以非诊断目的进行检测时具有较好的检测效果，实用性强。

本发明建立了用于汉滩病毒HTNV快速检测的RPA检测方法，对汉滩病毒HTNV的特异性保守序列S基因进行检测，节约了汉滩病毒HTNV的检测时间，检测可在37℃下20min内完成扩增，与常规PCR和实时荧光定量PCR需要数小时相比极大地缩短了检测时间。同时，降低了反应温度，RPA只需要接近于体温的恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量PCR的60-95℃以及LAMP的63℃。更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要试剂可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入缓冲液、引物、探针和样品/模板，并加入镁离子起始反应即可。具有灵敏性高，特异性强的特点。在现场或床旁检测中具有广阔的应用前景。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心

<120> 一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸、试剂盒以及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1636

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tagtagtaga ctccctaaag agctactaga acaacgatgg caactatgga ggaattacag 60

agggaaatca atgcccatga gggtcaatta gtgatagcca ggcagaaggt gagggatgca 120

gaaaaacagt atgaaaagga tccagatgag ttgaacaaga gaacattaac tgaccgagag 180

ggcgttgcag tatctatcca ggcaaaaatt gatgagttaa aaaggcaact ggcagatagg 240

attgcaactg ggaaaaacct tgggaaggaa caagatccaa caggggtgga gcctggagac 300

catctgaaag agaggtcaat gctcagttat ggtaatgtgc tggatttaaa ccatttggat 360

attgatgaac ctacaggaca gacagcagac tggctgagca tcatcgtcta tcttacatcc 420

tttgtcgtcc cgatacttct gaaagctctg tatatgttga caacaagggg gaggcaaact 480

accaaggata ataaagggac ccggattcga tttaaggatg atagctcgtt cgaggatgtt 540

aacggtatcc ggaaaccaaa acatctttac gtgtccttgc caaatgcaca gtcaagcatg 600

aaggcagaag agattacacc tggtagatat agaacagcag tctgtgggct ctaccctgca 660

cagattaagg cacggcagat gatcagtcca gttatgagtg taattggttt tctagcatta 720

gcaaaggact ggagtgatcg tatcgaacaa tggttaattg aaccttgcaa gcttcttcca 780

gatacagcag cagttagcct ccttggtggt cctgcaacaa acagggacta cttacggcag 840

cggcaagtgg cattaggcaa tatggagaca aaggagtcaa aggctatacg ccagcatgca 900

gaagcagctg gctgtagcat gattgaagat attgagtcac catcatcaat atgggttttt 960

gctggagcac cagaccgttg tccaccaaca tgtttgttta tagcaggtat tgctgagctt 1020

ggggcatttt tttccatcct gcaggacatg cgaaatacaa tcatggcatc taagacagtt 1080

ggaacatctg aggagaagct acggaagaaa tcatcatttt atcagtccta cctcagaagg 1140

acacaatcaa tggggataca actaggccag agaattattg tgctcttcat ggttgcctgg 1200

ggaaaggagg ctgtggacaa cttccactta ggggatgata tggatcctga gctaaggaca 1260

ctggcacaga gcttgattga tgtcaaagtg aaggaaatct ccaaccaaga gcctttgaaa 1320

ctctaattaa tgaatgtatt aatcctttta tgtgattatc atatactact gaatcattat 1380

caatcatatt tgcactatta ttatcagggg aatcagtata tcagggcatg ggaacattta 1440

tgggtgggaa tcattactca ggggtgggtc agttaatccg ttgtgggtgg gtttagctcc 1500

aggctacctt aagtagcctt tttttgtata tatggatgta gatttcattt gatccttaac 1560

ctcaacacaa aactacctca acttaactac ctcatttgat tgctccttga ttgtcttttt 1620

agggagcata ctacta 1690

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttatcagggg aatcagtata tcagggcat 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gttaaggatc aaatgaaatc tacatccat 29

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n为四氢呋喃THF

<400> 4

catgggaaca tttatgggtg ggaatcatta ntcaggggtg ggtcag 46

Claims

1.一种用于以RPA检测汉滩病毒的成套核酸，其特征是，所述成套核酸包括引物对和探针；所述引物对包括正向引物与反向引物，所述正向引物序列为SEQ ID NO.2，所述反向引物序列为SEQ ID NO.3；所述探针序列为SEQ IDNO.4。

2.根据权利要求1所述的成套核酸，其特征是，所述反向引物的5’端标记有生物素；所述探针的第31位碱基以四氢呋喃替换，所述探针的5’端标记有荧光素，所述探针的3’端具有延伸阻断基团。

3.根据权利要求2所述的成套核酸，其特征是，所述荧光素为FAM或FITC，所述延伸阻断基团为磷酸基团；所述汉滩病毒具有序列为SEQ ID NO.1的保守基因S。

4.以RPA检测汉滩病毒的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求1所述的成套核酸。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述正向引物、反向引物的浓度分别为10μM，所述探针的浓度为5μM。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括TwistAmp nfo试剂盒，所述TwistAmp nfo试剂盒包括无DNase和RNase的水、缓冲液、醋酸镁溶液、以及含有冻干酶粉的反应管。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征是，所述缓冲液由：60mM pH7.9Tris，100mM醋酸钾，2mM DTT，20M 5％碳化蜡，200μM dNTPs，3mM ATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μL肌酸激酶，30ng/μL Bsu以及水构成；所述醋酸镁溶液浓度为280mM；所述冻干重组酶粉由45000nggp32,7500ng uxsX,1500nguvsY构成。

8.非诊断目的以RPA检测汉滩病毒的方法，其特征是，采用权利要求4至7任一项所述的试剂盒；所述方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述第一步的具体过程如下：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是，第一步中，所述反应体系为50μL RPA反应体系；S1中，正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，探针0.6μL，无DNase和Rnase的水12.2μL，缓冲液29.5μL，目标样品1μL，醋酸镁溶液2.5μL；S2中，RPA反应的温度为37℃，RPA反应扩增总时间为17.5-20min，预设时间点为RPA反应扩增的第4分钟；第二步中，所述一次性核酸检测装置为通用型核酸扩增快速检测装置，其生产厂家包括杭州优思达生物技术有限公司。