CN102417903A

CN102417903A - 一种人类线粒体dna纯化方法

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Publication number: CN102417903A
Application number: CN2011103156658A
Authority: CN
Inventors: 管敏鑫; 龚莎莎; 郑静; 张婷; 方芳; 郑斌娇; 梁敏; 吕建新
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2011-10-09
Filing date: 2011-10-09
Publication date: 2012-04-18

Abstract

一种纯化人类线粒体DNA的方法。本方法通过限制性内切酶Bgl II和Dra III、核糖核酸酶A和核酸外切酶III的联合作用，降解基因组DNA或线粒体DNA粗提取液中的核DNA和RNA残余，从而获得高纯度的线粒体DNA。该方法普遍适用于人类线粒体DNA样本的纯化，纯度高、操作简便、用时短，能够满足线粒体研究领域各项技术对线粒体DNA高纯度的要求。

Description

一种人类线粒体DNA纯化方法

技术领域

本发明属于分子生物学核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种人类线粒体DNA纯化方法及其应用。

背景技术

线粒体被誉为“生命的发动机”，它在生命的发生、发展和延续过程中发挥着重要作用。线粒体具有相对独立的遗传物质，与细胞核DNA(nuclear DNA，nDNA)相比，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有不同的分子结构和遗传密码。人类mtDNA呈共价闭合、环状、双链结构，由16569个碱基对(base pair，bp)组成，编码了37个与电子传递链和线粒体蛋白合成相关的基因。围绕线粒体开展的疾病发生、细胞凋亡及生物进化研究已成为当今生命科学领域的热点。

从细胞中获取高纯度的mtDNA是一项基础性的工作。传统的细胞mtDNA制备方法大致分为两种：一是先提取基因组DNA，再通过氯化铯密度梯度离心或柱层析法分离mtDNA；二是先将细胞充分匀浆，经差速离心分离出线粒体，再用DNA酶降解nDNA，然后用蛋白酶或碱裂解线粒体而提取mtDNA。在国内，为了克服传统方法设备和试剂昂贵，操作程序繁锁等缺点，胡义德等通过改进碱变性法提取了人外周血白细胞中的mtDNA(公开号：101338310)；戴纪刚等建立了Triton法，先除去细胞核，再分离提取细胞浆中的mtDNA(戴纪刚等.第三军医大学学报.Vol.22，No.4：391-392)；韩东一等通过添加蛋白质变性剂，改进了高盐法(公开号：101250522)。以上方法尽管能获得较高浓度的mtDNA，但仍存在一定缺陷，以nDNA残余最为突出，严重的nDNA残余阻碍了相关技术在mtDNA研究领域的应用，例如：nDNA中存在大量的mtDNA假基因，若无法去除这些假基因的干扰，则会严重影响微量细胞mtDNA的分析。本发明将对以往的mtDNA提取方法进行改进，旨在减少mtDNA溶液中的nDNA残余。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类mtDNA纯化方法。

本发明利用人类mtDNA和nDNA在核苷酸序列和分子构型上的差异，通过限制性内切酶Bgl II和Dra III特异性切割nDNA，核糖核酸酶A(RibonucleaseA，RNase A)和核酸外切酶III(ExonucleaseIII，ExoIII)进一步消化核酸片段，降解人类基因组DNA或粗提取mtDNA溶液中的nDNA和RNA残余，从而获得高纯度的mtDNA。

一种人类mtDNA纯化方法，包括以下步骤：

(1)人类基因组DNA提取或mtDNA粗提取：可根据样本来源不同，选择不同的常规mtDNA提取方法。

(2)构建酶切反应体系，酶切nDNA、去除RNA残余：向约含有4μg DNA的全基因组DNA溶液或mtDNA粗提取中加入20μg RNase A、20U Bgl II、40UDra III、10μL 10×缓冲液I、0.4μL 100×BSA，ddH₂O定容至100μL，用移液器温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时。反应体系可视底物浓度作适当调整，为保证酶切效果，可适当延长反应时间。

(3)消化nDNA：向上述反应液中加入200U Exo III，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时(可适当延长反应时间)，65℃温浴10min终止反应。

(4)酚-氯仿-异戊醇抽提mtDNA：在上述反应液中加入等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用100μL EB溶液溶解DNA沉淀，-20℃保存。

本发明一种人类mtDNA纯化方法，其中所述步骤(2)和步骤(3)之间还可插入酚-氯仿-异戊醇抽提步骤以提高步骤(3)中Exo III的反应活性：在步骤(2)的反应产物中加入等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用80μL ddH₂O溶液溶解DNA沉淀。

本发明一种人类mtDNA纯化方法，在步骤(2)和步骤(3)之间插入酚-氯仿-异戊醇抽提步骤后，步骤(3)需为另外一个步骤所代替：在上述80μL DNA溶液中加入200U Exo III、10μL 10×缓冲液II，ddH₂O补充体积至100μL，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时，65℃温浴10min终止反应。

本发明一种人类mtDNA纯化方法操作简便、用时短、对仪器耗材没有特殊要求，经PCR、琼脂糖凝胶电泳等检测，提取的mtDNA基本无nDNA残余，纯度较高，能够全面满足各种研究对高纯度mtDNA的需求。

附图说明

图1为Hela细胞基因组DNA经不同酶处理后的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

R.E.：Bgl II+Dra III限制性内切酶，Exo III：核酸外切酶III，M：λ-Hind III digestDNA marker，琼脂糖浓度为0.7％(W/V)；“+”表示此酶参与反应，“-”表示此酶未参与反应。

图2为传统方法提取的Hela细胞mtDNA纯化前后的琼脂糖凝胶电泳检测结果；1：碱变性法提取的mtDNA，2：经本发明纯化的mtDNA，M：λ-Hind IIIdigest DNA marker，琼脂糖浓度为0.7％(W/V)。

图3为mtDNA纯化前后，线粒体片段和核基因的PCR扩增检测结果；A：模板为碱变性法提取的mtDNA，B：模板为经本发明纯化的mtDNA，M：DNAmarker，琼脂糖浓度为0.7％(W/V)。

图4为mtDNA纯化前后，线粒体片段和核基因的PCR扩增电泳检测结果的量化图；MIT-6、MIT-22：线粒体片段，β-actin、GJB3：核基因。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂材料，如无特殊说明，均可在常规生化试剂商处购买。

实验用人宫颈癌细胞HeLa购自中科院上海细胞库；限制性内切酶Bgl II和Dra III，Exo III购自NEB公司；全基因组提取试剂盒、PCR试剂盒、λ-Hind IIIdigest DNA marker购自TaKaRa公司；RNase A购自Sigma公司；琼脂糖购自BIOWEST公司。

实施例中涉及的溶液组分及浓度如下：

PBS溶液：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/LKH₂PO₄。

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，30mmol/L EDTANa₂2H₂O，pH8.0。

溶液II：0.2mol/L NaOH和1％ SDS(临用前用5mol/L NaOH和10％ SDS贮存液配制)。

溶液III：3mol/L醋酸钾溶液，5mol/L醋酸根离子，pH 5.4。

10×缓冲液I：100mmol/LNaCl，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/LDTT，25℃，pH 7.9。

10×缓冲液II：10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT，25℃，pH7.0。

EB溶液：10mol/L Tris·HCl，pH8.0。

实施例1：不同酶处理对全基因组DNA的影响

实施步骤：

1.全基因组DNA提取

(1)细胞系和细胞培养：实验选用人宫颈癌细胞HeLa，将其培养在添加有10％胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂的培养箱。

(2)细胞的洗涤及收集：用PBS溶液洗涤培养的单细胞层，直接刮取细胞，并用PBS溶液悬浮，调节细胞浓度。

(3)依照全基因组提取试剂盒说明书从培养的HeLa细胞(～1.5×10⁷个/皿)中提取全基因组DNA。

2.mtDNA提取及纯化

(1)从全基因组DNA溶液中吸取4μg DNA，构建100μL的酶切反应体系，编号为2，体系中包含20μg RNase A、20U Bgl II、40U Dra III、10μL 10×缓冲液I和0.4μL 100×BSA，反应液经移液器温和吹吸混匀，37℃温浴2小时后，65℃温浴10min终止反应。

(2)从同一全基因组DNA溶液中吸取与上一步骤等量的DNA，并进行相同的酶切处理，编号为3，待反应终止后，向反应产物中加入200U Exo III，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时，65℃温浴10min终止反应。

(3)在上述2和3反应液中加入100μL等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用30μL EB溶液溶解DNA沉淀。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

从上述全基因组DNA溶液中吸取4μg DNA，EB溶液稀释至30μL，编号为1。取相同体积的三种DNA溶液，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(10mA/cm，1h)，上样顺序与编号一致。检测结果(图1)显示，全基因组DNA经RNase A、限制性内切酶Bgl II和Dra III处理后，呈涂抹带。再经Exo III消化，涂抹带基本消失。

实施例2：mtDNA纯化前后浓度及纯度变化

实施步骤：

1.碱裂解法提取mtDNA

(1)细胞的培养和收集(同实施例1)

(2)以每10⁷细胞数为例，加入150μL溶液I，冰浴中吹吸混匀，依次加入300μL溶液II，冰浴变性8min，再加入225μL溶液III，冰浴复性25min。

(3)裂解产物以10,000×g离心6min，取上清，加入半体积Tris饱和酚(pH＞7.6)，温和振荡10min，再加半体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡5min，10,000×g离心10min，取水相，加2倍体积无水乙醇冰浴30min，15,000×g离心10min，用70％乙醇洗涤，15,000×g离心2min，彻底去上清，自然干燥，适量EB液溶解获得mtDNA粗提液。

2.本发明纯化mtDNA

(1)向约含有4μg DNA的mtDNA粗提取中加入20μg RNase A、20U Bgl II、40U Dra III、10μL 10×缓冲液I、0.4μL 100×BSA，ddH2O定容至100μL，用移液器温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时。

(2)向上述反应液中加入200U Exo III，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时，65℃温浴10min终止反应。

(3)在上述反应液中加入100μL等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用100μL EB溶液溶解DNA沉淀。

3.纯化前后mtDNA溶液的浓度及纯度比较

(1)琼脂糖凝胶电泳检测纯化前后mtDNA的变化，取等量的mtDNA粗提液及对应的纯化产物分别上样，琼脂糖浓度为0.7％(W/V)，电泳(10mA/cm，1h)，凝胶成像仪成像记录。

(2)核酸蛋白分析仪测定纯化前后mtDNA溶液的浓度及纯度。

4.纯化前后nDNA残余检测

分别以纯化前后的mtDNA溶液为模板，扩增定位于mtDNA nt3796-nt4654和nt14856-nt15978的两个基因片段MIT-6和MIT-22，长度分别为898bp和1162bp；同时，扩增核基因β-actin和GJB3，长度分别为571bp和1209bp。引物相关信息见表1。通过比较纯化前后mtDNA片段和核基因PCR产物量的变化，分析nDNA残余情况。

表1PCR扩增mtDNA片段和核基因的引物序列

5.结果

琼脂糖凝胶电泳检测纯化前后mtDNA的变化(图2)，未经纯化的mtDNA产量较高，但存在严重的RNA残余，经纯化的mtDNA无法被检测到。

核酸蛋白分析仪直接测定mtDNA粗提液纯化前后的浓度及纯度变化(表2)。测定结果表明，mtDNA粗提液存在RNA残余，而纯化后，产物浓度下降、纯度提高。

表2mtDNA溶液纯化前后的浓度及纯度测定

以纯化前后等量的mtDNA溶液为模板，PCR扩增mtDNA片段和核基因。电泳结果显示，以mtDNA粗提液为模板时，四个检测片段均能得到有效扩增(图3A)；而当以纯化后的mtDNA溶液为模板进行扩增时，核基因的扩增结果无法被检测到(图3B)。量化结果表明，mtDNA在纯化前后相对浓度有所提高，而nDNA浓度大幅下降(图4)。因此，本发明对减少nDNA残余，提高mtDNA纯度是有效的。

Claims

1.一种人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)人类基因组DNA提取或线粒体DNA粗提取。

(2)构建酶切反应体系，酶切细胞核DNA，去除RNA残余：向全基因组DNA溶液或线粒体DNA粗提取液(约含有4μg DNA)中加入20μg RNase A、20U Bgl II、40U Dra III、10μL 10×缓冲液I、0.4μL 100×BSA，ddH₂O定容至100μL，用移液器温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时。

(3)消化细胞核DNA：向上述反应液中加入200U Exo III，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时，65℃温浴10min终止反应。

(4)酚-氯仿-异戊醇抽提线粒体DNA：在上述反应液中加入等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用100μL EB溶液溶解DNA沉淀，-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的人类基因组DNA提取或线粒体DNA粗提取，可根据样本来源不同，选择不同的常规mtDNA提取方法。

3.根据权利要求1所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Bgl II和Dra III是两种限制性内切酶，它们特异性作用于细胞核DNA，而不会对线粒体DNA产生影响。

4.根据权利要求1所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的10×缓冲液I的配方为：100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/LDTT，25℃ pH 7.9。

5.根据权利要求1所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：在步骤(2)和步骤(3)之间还可插入另外一个步骤，以提高步骤(3)中Exo III的反应活性。

6.根据权利要求1和5所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：所述另外一个步骤是在步骤(2)的反应产物中加入等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃、5,000×g转速下离心15min，将水相转移至新离心管并加入2倍于其体积的无水乙醇，-20℃冰浴20min，4℃、13,000×g转速下离心30min，弃上清，用70％乙醇洗涤，4℃、13,000×g转速下离心5min，弃上清，室温干燥沉淀20min，用80μL ddH₂O溶液溶解DNA沉淀。

7.根据权利要求1、5和6所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：在步骤(2)和步骤(3)中插入权利要求5所述的步骤后，步骤(3)需为另外一个步骤所代替。

8.根据权利要求1、5、6和7所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：所述另外一个步骤是在权利要求6所述的80μL反应液中加入200U Exo III、10μL 10×缓冲液II，ddH₂O补充体积至100μL，温和吹吸混匀，37℃温浴2个小时，65℃温浴10min终止反应。

9.根据权利要求8所述的人类线粒体DNA纯化方法，其特征在于：所述10×缓冲液II的配方为：10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT，25℃pH 7.0。

10.一种在权利要求1-9中任一项所述的人类线粒体DNA纯化方法中使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-7中任一项所述的方法中使用的全部试剂，且按照使用的顺序排列。

11.权利要求1-9任一项所述的人类线粒体DNA纯化方法在人类线粒体DNA提取中的应用。

12.权利要求10所述的试剂盒在人类线粒体DNA提取中的应用。