CN111690718B

CN111690718B - 一种dna可逆保护和分离的方法

Info

Publication number: CN111690718B
Application number: CN202010528082.2A
Authority: CN
Inventors: 曹博; 张清华; 刘莉莉; 季红
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111690718A; US20210388417A1

Abstract

本发明提供了一种对DNA进行可逆保护和分离的方法，首先将目标DNA分子的5’端进行磷酸化；然后将5’端腺苷化修饰；终止反应后获得的样品中加入对腺苷化修饰DNA敏感的核酸外切酶消化模板；最后将获得的腺苷化修饰DNA，即分离所得目标DNA，进行测序鉴定等技术分析，所得序列的5’端即为腺苷化修饰位点。本发明提供的方法，填补了现有技术无法精确定位基因组DNA上断裂位点的空白，能够实现对不同长度和不同来源的DNA样品进行断裂位点的定量和定位分析，使用简便，易于操作，而且对样品无特殊要求，准确率高、检测背景影响低、分辨率高。

Description

一种DNA可逆保护和分离的方法

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于对DNA大分子进行可逆保护和分离的方法。

背景技术

DNA分子存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA的完整性对细胞至关重要。然而，多种外界环境和生物体内部的因素都会导致DNA分子的损伤或改变，如紫外线、辐射、致癌性化学物质、细胞自身代谢过程中产生的氧化压力等。这些损伤破坏了基因组的完整性，并威胁着基因组的稳定。现在普遍认为DNA损伤是癌症和许多其他与衰老相关疾病的主要原因，因此对人类健康来说这是一个非常重要的问题。

在诸多DNA损伤类型中，链断裂（Strand break）是公认的对细胞危害最大的一种损伤，因为链断裂可以阻断DNA复制、转录等过程，同时还可能导致重组事件发生。因此，DNA链断裂是生命科学领域的一个研究热点。其中，研究基因组DNA上链断裂发生的位置和规律是理解该类损伤的基础。

目前，在全基因组范围内定位DNA断裂位点的技术主要有两种： Baranello课题组开发的DSB-Seq、SSB-Seq技术和 Philipp Kapranov课题组的SSiNGLe技术。前者使用生物素和地高辛分别标记双链断裂位点和单链断裂位点，然后亲和富集标记的DNA片段并结合二代测序进行分析。SSiNGLe技术在DNA片段化过程中，利用微球菌核酸酶（MNase）消化DNA产生3’磷酸末端，然后通过末端转移酶（TDT）添加PolyA尾来对具有3’羟基末端的DNA断裂位点进行标记捕获，并与二代测序相结合。这两种方法虽然实现了全基因组范围内对DNA断裂位点的定位，但是它们在应用过程中均存在局限性。例如，DSB-和SSB-seq对断裂位点定位的分辨率较低，测序过程中背景高等；而SSiNGLe技术无法检测发生在DNA腺嘌呤（Adenine，A）上的断裂。

因此，鉴于DNA断裂的重要性和目前鉴定技术的局限性，本发明开发了一种通过对目标DNA分子进行可逆保护和分离的方式，实现了低成本、高灵敏度、高分辨率定位DNA断裂位点，并且进一步应用于定位DNA多种类型的损伤和修饰的研究。该技术将极大推动DNA损伤－修复过程、癌症发生机理及预防、药物安全性评估、基因治疗、遗传疾病等领域的科学研究和临床应用。

发明内容

针对现有检测DNA损伤方法背景高、分辨率低、准确率低的问题，本发明提供一种可用于检测DNA损伤的DNA可逆保护和分离的方法，能够高精度定位DNA损伤位点，可以应用于不同长度和不同来源的DNA样品，可以对目标DNA进行单分子、单核苷水平的分离和分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种DNA可逆保护和分离的方法，包括以下步骤：

（1）将DNA分子通过酶处理，获得含5’磷酸化DNA的样品；

（2）将含5’磷酸化DNA的样品解旋获得单链DNA；

（3）将单链DNA进行5’腺苷化标记，获得含5’腺苷化DNA的样品；

（4）使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶对步骤（3）获得的样品进行消化，去除未被5’腺苷化修饰的单链DNA，纯化后获得腺苷化修饰的目标DNA分子；

（5）对腺苷化修饰的目标DNA分子进行去腺苷化处理，即可获得目标DNA分子。

步骤（1）中，所述DNA分子的来源不限，可以是人工合成或提取自动物、植物或微生物；可以根据样品的不同而采用本领域内常用的DNA提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法、CTAB法等，也可以使用商业化的试剂盒。

步骤（1）中，所述DNA分子可以是双链也可以是单链。可选地，所述DNA分子为单链时，可省略步骤（2）。

步骤（1）中，所述酶为能够将含有5’羟基的DNA转化为5’磷酸化DNA的酶，如，T4多聚核苷酸激酶；也可以是参与DNA损伤位点的切除修复酶，这些酶能够产生的5’磷酸末端，如，DNA糖基化酶和核酸内切酶，根据具体需要检测的片段选择如尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGGl）、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）、胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）等DNA糖基化酶中的一种或几种和核酸内切酶IV。

优选地，步骤（2）中，所述解旋过程为热变性。具体地，获得单链DNA的步骤为：将DNA热变性后迅速冰上放置，保持单链状态。

步骤（3）中，所述5’腺苷化标记为通过酶修饰DNA的5’末端。所述酶为常用的DNA腺苷化酶，如，Mth RNA Ligase，T4 DNA Ligase等。所述DNA腺苷化酶在ATP存在的基础上对DNA的5’端进行腺苷化修饰。本发明的实施例中用含有Mth RNA Ligase和ATP的试剂盒进行反应。

步骤（4）中，所述腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶，包括但不限于T5核酸外切酶，RecJ核酸外切酶等任何腺苷化敏感的外切酶。

作为优选，步骤（1）（3）（5）还包括对反应后样品的纯化处理。

上述方法可用于检测DNA分子修饰和损伤。

一种采用上述方法检测DNA分子损伤和修饰位点的方法，包括以下步骤：

（i）提取DNA分子、破碎、去磷酸化，获得样品；

（ii）按照上述方法获得目标DNA分子；

（iii）对目标DNA分子进行测序并分析比对，即可获得损伤或修饰位点。

步骤（i）中，所述破碎的步骤为超声破碎；所述破碎的大小优选为200-500bp。

步骤（iii）中，所述测序选自但不限于Sanger测序、Illumina测序；对含有单个位点的样本进行Sanger测序，对含有多个位点的样本进行Illumina测序。优选地，步骤（iii）采用Illumina测序时还包括以下步骤：将去目标DNA分子转化为双链DNA后，再经PCR扩增，产物用于Illumina测序。

本发明的原理如下：

首先将DNA样品热变性后对目标DNA分子进行5’末端磷酸化处理；利用腺苷转移酶对磷酸化的DNA 5’端进行腺苷化可逆修饰，从而保护目标DNA分子；之后通过腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶将样品中未被保护的DNA消化，5’末端腺苷化修饰的DNA可以抵抗核酸酶水解而得以保留，对模板消化后的5’末端腺苷化修饰DNA进行纯化，消除背景影响；然后通过去腺苷化酶消除5’末端腺苷化修饰，使样品恢复5’末端磷酸化修饰，从而实现了目标DNA分子的可逆保护和分离；通过对去除5’端腺苷化修饰的DNA进行测序，测序所得序列的5’端即为原保护位点，即DNA的断裂位点。

本发明具有以下优点：

本发明提供的用于捕获和分离目标DNA片段的方法，利用DNA 5’末端的可逆保护，实现对不同长度和不同来源的目标DNA进行定量和定位分析，使用简便，易于操作，而且对样品无特殊要求，准确率高；检测背景影响低、分辨率高，可广泛应用于分子诊断、化疗药物安全评估、癌症发生及预防、分子生物学研究、基因治疗等诸多领域。

附图说明

图1是DNA可逆保护和分离的流程示意图；

图2是短链DNA样品腺苷化修饰结果图；

图3是腺苷化DNA抗水解结果图；

图4 是腺苷化DNA去腺苷化结果图；

图5是精确定位短链DNA损伤位点检测结果图；

图6是精确定位基因组DNA损伤位点检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 DNA腺苷化修饰及其抗核酸酶活性分析

通过DNA合成公司（IDT, 美国）合成含5’磷酸化修饰的20 nt的DNA单链片段，序列为：/5’Phos/-NNCAC TCG GGC ACC AAG GAC-3’以及不含磷酸修饰的同序列DNA。

将含有磷酸化修饰和不含修饰的DNA短片段等比例混合作为DNA底物。在20 μL反应体系中包含100 pmol Mth RNA Ligase（NEB, 美国），2 μL 1 mM ATP（NEB, 美国），2 μLDNA Adenylation Buffer（NEB, 美国），2 μg DNA底物，用水补足20 μL。65℃反应1.5 h后，85℃灭活5 min。

反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图2所示：反应前，磷酸化修饰的DNA和不含修饰的DNA在Bioanalyzer电泳时无法分离，形成一个峰（对应一条条带）；反应后，含有磷酸化修饰的DNA被腺苷化修饰，并且Bioanalyzer电泳分析时电泳速度变慢，可以和不含腺苷化修饰的DNA分离。

对含有5’腺苷化修饰以及不含修饰的DNA分别进行RecJ和T5外切酶解分析。在20μL反应体系中，含有1 μg的DNA底物中，10单位的核酸外切酶T5（NEB）或30单位的核酸外切酶RecJ_f （NEB），37℃反应1.5h，65℃灭活20min。反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图3所示：含有腺苷化修饰的DNA可以抵抗RecJ和T5核酸外切酶的水解，而不含腺苷化修饰的DNA可以被RecJ核酸外切酶或者T5核酸外切酶水解。

腺苷化修饰的可逆去除。用Deadenylation Kit （NEB）恢复腺苷化的DNA（5’AppDNA）至初始状态（5’磷酸化修饰DNA），20 μL反应体系含有：50单位的去腺苷化酶5’-Deadenylase（NEB, 美国），2 μL 缓冲液（NEB Buffer1），50 ng腺苷化修饰的短链DNA底物，50 ng不含修饰的短链DNA底物，用水补足20 μL。30℃反应1h，70℃反应20 min灭活。反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图4所示：反应前，与磷酸化修饰的DNA等比例混合的腺苷化修饰DNA，在反应后，全部脱腺苷化成为磷酸化修饰DNA，从而实现了DNA腺苷化的可逆反应。

实施例2 腺苷化可逆保护及分离技术在鉴定DNA损伤位点中的应用

1. AP位点

（1）通过DNA合成公司（IDT公司, 美国）合成含有100 bp的DNA双链片段，正义链序列为：

ACTGGGGCCAGATGUGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG，下划线为DNA损伤（Uracil）位点；

（2）酶切DNA损伤位点：50 μL反应体系中含有：10单位的Uracil修复酶UDG和内切酶IV（NEB, 美国），5 μL缓冲液（NEB Cutsmart Buffer)，1 μg DNA底物，用水补足50 μL；37℃反应1 h后，75℃灭活20 min；

（3）DNA变性：将DNA样品置于PCR仪中，95℃热变性3min后迅速将样品放置于冰上；

（4）断点可逆标记：20μL×2体系中包含100 pmol Mth RNA Ligase（NEB,美国），2μL 1 mM ATP（NEB, 美国），2μL DNA Adenylation Buffer（NEB, 美国），2 μg 5’磷酸化DNA底物，用水补足20 μL；65℃反应1.5 h后，85℃灭活5 min；

（5）纯化标记DNA片段：利用Zymo DNA纯化试剂盒，向反应产物中加入100 μL结合液，400 μL无水乙醇，充分混合后过柱，750 μLwash buffer冲洗一次后，用20 μL洗脱液洗脱；

（6）模板消除：向纯化液中加入10单位的核酸外切酶T5 (NEB)或30单位的核酸外切酶RecJ_f (NEB)，37℃反应1.5 h，65℃灭活20 min；反应产物即为分离得到的腺苷化修饰的DNA，利用DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后用于第7步反应。

（7）断点标记去除：利用Deadenylation Kit (NEB)恢复腺苷化的DNA （5’App-DNA）至初始状态（5’p-DNA），20 μL反应体系含有：50单位的去腺苷化酶5’-Deadenylase（NEB,美国），2 μL 缓冲液（NEB Buffer1），步骤6中获得的短链DNA底物，用水补足20 μL；30℃反应1 h，70℃反应20 min灭活；

（8）步骤（7）所得产物送测序公司进行Sanger测序（Genewiz)。结果如图5所示，测序所得的5’端即为原损伤位点。

2. 大肠杆菌氧化损伤位点检测

（1）在10mL LB培养液中37℃培养大肠杆菌DH10B菌株至O.D₆₀₀=0.5,将培养液置于冰上20 min后，加入0.2 mM的过氧化氢处理30 min。收集处理后的1 mL菌体，用OMEGABacterial DNA Kit (OMEGA公司，美国）提取基因组DNA，方法按照产品说明进行；

（2）取5 μg提取的基因组DNA，补充超纯水至100 μL，利用超声破碎仪将DNA片段化为500 bp左右的片段；

（3）取26 μL的步骤（2）所得DNA进行去磷酸化处理：加入3 μL Cutsmart Buffer（NEB）以及1 μL Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP，NEB)，37℃反应30 min后，70℃灭活10 min；

（4）酶切DNA损伤位点：50 μL反应体系中含有：10单位的Uracil修复酶UDG 和内切酶IV（NEB, 美国），5 μL缓冲液（NEB Cutsmart Buffer)，1 μg DNA底物，用水补足50 μL。37℃反应1 h后，75℃灭活20 min；反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit（QIAGEN）纯化；

（5）DNA变性：步骤（4）所得DNA样品置于PCR仪中，95℃热变性3 min后迅速将样品放置于冰上；

（6）断点可逆标记：使用5’ DNA腺苷化试剂盒（NEB，美国）对5’磷酸化修饰的末端转化为腺苷化修饰。反应体系：Mth RNA Ligase 2 μL，1mM ATP 2 μL，DNA AdenylationBuffer 2 μL，步骤（5）所得的DNA底物，用水补足20 μL；65℃反应1.5h后，85℃灭活5min；

（7）模板消除：向纯化液中加入10单位的核酸外切酶T5 (NEB，美国)或30单位的核酸外切酶RecJ_f (NEB，美国)，37℃反应1.5 h，65℃灭活20 min；对照：未腺苷化的DNA以相同体系进行消化；

（8）纯化标记DNA片段：利用Zymo DNA纯化试剂盒，向反应产物中加入100 μL结合液，400 μL无水乙醇，充分混合后过柱，750 μL wash buffer冲洗一次后，用10 μL洗脱液洗脱；

（9）断点标记去除：利用Deadenylation Kit (NEB，美国)去腺苷化。反应体系：50单位的去腺苷化酶（NEB，美国），2 μL缓冲液（NEB Buffer1），步骤6所得的DNA底物，用水补足20 μL。30℃反应1 h，70℃灭活20 min。反应产物按照步骤8进行纯化；

（10）构建Illumina文库：步骤9中洗脱所得DNA，利用Clontech SMART ChIP-seq试剂盒构建DNA文库，按照试剂盒说明书进行：加入1 mM接头DNA和MML病毒逆转录酶，50℃反应2 h，70℃ 10 min终止反应；然后PCR扩增，95℃变性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸30 s；15个循环，产物送测序公司进行Illumina测序；

（11）Illumina测序数据分析：将测序所得的数据，对大肠杆菌基因组进行匹配，reads集中区的5’端如图6所示，即为DNA损伤位点。

序列表

<110> 曲阜师范大学

<120> 一种DNA可逆保护和分离的方法

<130> 20200603

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligo DNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

nncactcggg caccaaggac 20

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> damaged DNA

<400> 2

actggggcca gatgugtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 60

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 100

Claims

1.一种DNA可逆保护和分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将DNA分子通过酶处理，获得含5’磷酸化DNA的样品；

(2)将含5’磷酸化DNA的样品解旋获得单链DNA；

(3)将单链DNA进行5’腺苷化标记，获得含5’腺苷化DNA的样品；

(4)使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶对步骤(3)获得的样品进行消化，去除未被5’腺苷化修饰的单链DNA，纯化后获得腺苷化修饰的目标DNA分子；

(5)对腺苷化修饰的目标DNA分子进行去腺苷化处理，即可获得目标DNA分子；

步骤(1)中，所述酶为能够将含有5’羟基的DNA转化为5’磷酸化DNA的酶；所述酶选自T4多聚核苷酸激酶；

步骤(3)中，所述5’腺苷化标记为通过酶修饰DNA的5’末端；所述酶选自T4 DNALigase；

步骤(4)中，所述腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶选自T5核酸外切酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA分子为双链或单链；所述DNA分子为单链时，省略步骤(2)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述解旋过程为热变性。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)(3)(5)分别还包括对反应后样品的纯化处理过程。

5.一种采用如权利要求1-4任一所述的方法检测DNA分子损伤和修饰位点的非诊断目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(i)提取DNA分子、破碎、去磷酸化，获得样品；

(ii)按照上述方法获得目标DNA分子；

(iii)对目标DNA分子进行测序并分析比对，即可获得损伤或修饰位点。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述破碎的步骤为超声破碎。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述破碎的大小为200-500bp。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，所述测序选自Sanger测序或Illumina测序。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，测序为Illumina测序时还包括以下步骤：将去目标DNA分子转化为双链DNA后，再经PCR扩增，产物用于Illumina测序。