CN103266174B - 二点委夜蛾与其形态相似种的pcr鉴定引物及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定引物及其鉴定方法，步骤如下：（1）提取二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA；（2）以二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA为模板对其线粒体COI基因进行PCR扩增；（3）对步骤（2）制得的PCR产物用限制性内切酶RsaⅠ酶切，得酶切产物；（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选二点委夜蛾与其形态相似种提供了简便稳定的酶切标记，同时探索建立了二点委夜蛾与其形态相似种的鉴别技术，为今后的二点委夜蛾与其形态相似种鉴定、种群动态监测以及综合防控奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定引物及其鉴定方法，特别涉及一种基于PCR-RFLP技术鉴别二点委夜蛾与其形态相似种的引物及鉴别方法，属于农业生物技术领域。
背景技术
二点委夜蛾（Athetis lepigone）属鳞翅目，夜蛾科，委夜蛾属。2005年首先在河北省被发现（姜京宇，李秀芹，许佑辉，等,2008.二点委夜蛾研究初报.植物保护，34（3）：23-26.）。2011年在河南、山东等6省47市302个区（县）暴发危害，危害面积近200万公顷，对夏玉米安全生产造成严重威胁（王振营，石洁，董金皋，2012．2011年黄淮海夏玉米区二点委夜蛾暴发危害的原因与防治对策．玉米科学，20（1）：132-134．）。
二点委夜蛾与其形态相似种在形态上相似，非专业人士不能区分，而测序方法不仅费用高而且费时（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．），不利于二点委夜蛾与其形态相似种的快速鉴定。精确区分二点委夜蛾与其形态相似种是进行有效防控的前提和基础，这对于二点委夜蛾与其形态相似种的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。
PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）技术，又称为CAPS技术（CleavedAmplilfed Polymorphism Sequences），其基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的PCR引物（19～27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大。
PCR-RFLP技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用PCR-RFLP技术构建区分二点委夜蛾与其形态相似种的方法目前还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定引物及其鉴定方法。
一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
正义引物F1：5’-TGAGCWGGATAGTAGGAACTTC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物R1：5’-GTGACCAAAAAATCAAAATAAATG-3’；SEQ ID NO.2
一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定方法，步骤如下：
（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
（3）用限制性内切酶RsaⅠ酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp无条带时，则该被检测样品为二点委夜蛾；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp有条带时，则为形态相似种。
所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：
基因组DNA溶液 2.5μl，20μM引物 0.5μl，5U/μl Taq酶 0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH20补至25μl；
优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
所述步骤（3）中限制内切酶RsaⅠ酶切反应条件如下：37℃酶切2小时。
上述步骤（1）中提取待鉴定样品的基因组DNA和步骤（4）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。
所述步骤（1）中的待鉴定样品为二点委夜蛾或二点委夜蛾形态相似种。
有益效果
1、本发明所述鉴别二点委夜蛾与二点委夜蛾形态相似种的引物能够扩增二点委夜蛾与二点委夜蛾形态相似种基因组DNA中的线粒体COI基因，为鉴定二点委夜蛾与其形态相似种提供了简便稳定的分子标记，解决了区分二点委夜蛾与其形态相似种的难题。
2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选二点委夜蛾与其形态相似种提供了简便稳定的酶切标记。
3、本发明从分子水平探索了二点委夜蛾与其形态相似种线粒体COI基因的不同，探索建立了二点委夜蛾与其形态相似种的鉴别技术，为今后二点委夜蛾的种群动态鉴定、生物学以及综合防治奠定了基础。
附图说明
图1是实施例2中PCR产物经RsaⅠ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：A、代表二点委夜蛾形态相似种，B、二点委夜蛾，M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶RsaⅠ酶切，Uncut、代表未经过限制内切酶RsaⅠ酶切。
图2是实施例3中PCR产物经RsaⅠ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：A、代表二点委夜蛾形态相似种，B、二点委夜蛾，M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶RsaⅠ酶切，Uncut、代表未经过限制内切酶RsaⅠ酶切。
图3是实施例4中PCR产物经RsaⅠ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶RsaⅠ酶切，Uncut、代表未经过限制内切酶RsaⅠ酶切。
A：样品采自山东省聊城市、B：样品采自山东省德州市、C：样品采自山东省枣庄市、D：样品采自山东省临沂市、E：样品采自北京市。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1、2中所述二点委夜蛾与其形态相似种于2012年采集于山东省威海市；按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法对上述二点委夜蛾与其形态相似种进行检测，采集于山东省威海市的样本包括二点委夜蛾与其形态相似种。
实施例3中所述二点委夜蛾与其形态相似种于2012年采集于山东省烟台市；按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法对上述二点委夜蛾与其形态相似种进行检测，采集于山东省威海市的样本包括二点委夜蛾与其形态相似种。
实施例4中所述二点委夜蛾与其形态相似种于2012年采集于山东省多个地区：A：山东省聊城市、B：山东省菏泽市、C：山东省枣庄市、D：山东省临沂市、E：山东省淄博市。按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法对上述二点委夜蛾与其形态相似种进行检测，采集于山东省威海市的样本包括二点委夜蛾与其形态相似种。
实施例所述RsaⅠ内切酶购自TaKaRa公司，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。
实施例1
（1）二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA的提取
将单头二点委夜蛾与其形态相似种分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0）、20mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA溶液。
（2）二点委夜蛾与其形态相似种COI基因的PCR扩增
分别以二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA溶液和形态相似种基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
二点委夜蛾与其形态相似种基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×Taq Buffer：5μl；10mM dNTP：1μl；ddH20补至50μl；
引物序列如下：
正义引物Hap-F：5’-TGAGCWGGATAGTAGGAACTTC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Hap-R：5’-GTGACCAAAAAATCAAAATAAATG-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测，均检测出一长度在650bp左右条带（如图1所示），对该条带进行双向测序，二点委夜蛾与其形态相似种得到的条带序列如SEQ ID NO.3所示，形态相似种得到的条带序列如SEQ ID NO.4所示。
（4）利用限制性内切酶酶切位点分析软件WatCut（该分析软件可登陆如下网址使用http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=restriction_new），分析可得在片段432bp处二点委夜蛾与其形态相似种有碱基差异，且二点委夜蛾与其形态相似种得到的条带在该处可被限制性内切酶RsaⅠ酶切（酶切位点GTAC）。
实施例2
一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定方法，步骤如下：
（1）将采集于山东省威海市的单头二点委夜蛾与采集于山东省威海市的单头二点委夜蛾形态相似种个体分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0）、20mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；
（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH20补至25μl；
引物序列如下：
正义引物Hap-F：5’-TGAGCWGGATAGTAGGAACTTC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Hap-R：5’-GTGACCAAAAAATCAAAATAAATG-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
（3）用限制性内切酶RsaⅠ酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
酶切体系如下：10×NEB缓冲液2μl；PCR扩增产物5μl；RsaⅠ内切酶0.5μl；灭菌双蒸水至15μl。
反应条件如下：37℃水浴2小时。
（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上在650bp左右无条带时，则该被检测样品为二点委夜蛾；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp左右有条带时，则为形态相似种，结果如图1所示，与按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法进行检测的结果一致。
实施例3
如实施例2所述的鉴别二点委夜蛾与其形态相似种的方法，不同之处在于，所述二点委夜蛾与二点委夜蛾形态相似种于2012年采集于山东省烟台市。
结果显示，成像胶片上在650bp左右无条带时，则该被检测样品为二点委夜蛾；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp左右有条带时，则为形态相似种，结果如图1所示，与按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法进行检测的结果一致。
实施例4
如实施例2所述的鉴别二点委夜蛾与其形态相似种的方法，不同之处在于，所述二点委夜蛾与二点委夜蛾形态相似种于2012年采集于山东省5个地区，分别为A：山东省聊城市、B：山东省菏泽市、C：山东省枣庄市、D：山东省临沂市、E：山东省淄博市。
结果显示，成像胶片上在650bp左右无条带时，则该被检测样品为二点委夜蛾；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp左右有条带时，则为形态相似种，结果如图1所示，与按照（朱彦彬，马继芳，董立等，2012．基于线粒体COI基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析．昆虫学报，55（4）：457-465．）中记载的方法进行检测的结果一致。
Claims (2)
1.一种二点委夜蛾与其形态相似种的PCR鉴定方法，其特征在于，步骤如下：
（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
（3）用限制性内切酶RsaⅠ酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp无条带时，则该被检测样品为二点委夜蛾；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在650bp有条带时，则为形态相似种；
所述步骤（2）中的一对引物，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：
基因组DNA溶液 2.5μl，20μM引物 0.5μl，5U/μl Taq酶 0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH20补至25μl。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中限制内切酶RsaⅠ酶切反应条件如下：37℃酶切2小时。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的待鉴定样品为二点委夜蛾或二点委夜蛾形态相似种。
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