CN104164493A - 基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药品种鉴定技术领域，提出了一种鉴别赤链蛇的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR-RFLP)。本发明引物序列为：DK1-CO1：5’-CAA CTA ACC ACA AAG ACA TCG G-3’，DK1-CO2：5’-CTT CTG GGT GGC CGA AAA ATC A-3’；赤链蛇的特征DNA碱基序列为：5’-GTGCAC-3’；限制性内切酶APaL I识别并切割该序列。鉴定过程：提取样本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2进行PCR扩增；用限制性内切酶APaL I消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与赤链蛇PCR-RFLP特征结果相比较，判断待测样品是否为赤链蛇。本发明还提出用于所述鉴定方法的试剂盒。本发明鉴别准确、快速、可靠，有效地区分赤链蛇与其它蛇类。
Description
技术领域
本发明属于中药品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。
背景技术
赤链蛇(Dinodon rufozonatum)为游蛇科链蛇属的爬行动物，具有抗炎、镇静催眠、抗惊厥之功效，用于风湿性关节炎、解毒敛疮、全身疼痛、慢性瘘管、溃疡、疥癣等。赤链蛇是一种常见的金钱白花蛇伪品。随着近年金钱白花蛇药材价格的上涨以及资源的逐渐减少，越来越多的赤链蛇被用来充作金钱白花蛇。目前，市场上金钱白花蛇商品的50％为赤链蛇来源的伪品，两者从形态学上的特征进行鉴定较为困难。寻找快速、准确方法鉴别赤链蛇，是金钱白花蛇药材鉴定中的一个重要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确鉴别赤链蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括赤链蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。
本发明基于DNA条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI(线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。
本发明的技术方案如下：首先从各样本中提取总DNA，利用引物DK1-CO1及DK1-CO2，用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到赤链蛇的特征DNA碱基序列：5’-GTGCAC-3’(位于COI序列第362位至367位)，针对赤链蛇与其他蛇类DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶ApaL I，通过分析聚合酶链反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别赤链蛇的目的。
对需要鉴定的赤链蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-CO1、DK1-CO2)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶ApaL I对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，赤链蛇会出现分子量为362bp，296bp的两条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述两条带。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为赤链蛇。
本发明用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
本发明设计的用于鉴别赤链蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，步骤如下：
1)提取待测样品DNA；
2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。所述引物DK1-CO1和DK1-CO2，其序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’(SEQ ID NO.1)
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.2)
3)纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析；
4)PCR扩增产物中加入限制性内切酶APaL I进行酶切，限制性内切酶APaL I酶切位点为：G^TGCAC；
5)琼脂糖凝胶电泳分析；
6)鉴定结果的判断，若出现362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若不出现上述两条片段，则待测样品不为赤链蛇。
本发明方法的步骤1)和3)，采用现有技术的试剂盒提取DNA及纯化PCR产物的方法，不需要配制任何试剂，使得操作时间大大缩短。
本发明还提出了用于鉴定赤链蛇PCR-RFLP方法的试剂盒。所述试剂盒包括：引物DK1-CO1(10μM)；引物DK1-CO2(10μM)；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：TaqDNA聚合酶(0.1U/μL)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM)，Tris-HCl(20μM、pH8.3)，KCl(100μM)，MgCl2(3μM)等；ApaL I酶(10U/μL)；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
综上所述，本发明解决了鉴定赤链蛇与其它品种蛇的难题，提供了鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、赤链蛇特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶、鉴定方法及其试剂盒。本发明利用赤链蛇与其它蛇类药材DNA序列的差异，构建了快速、便捷、准确的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证金钱白花蛇的药材质量，打击金钱白花蛇伪品的市场行为具有重要的价值。
附图说明
图1为各样本PCR扩增电泳图：1.赤链蛇2.金钱白花蛇3.黄斑渔游蛇4.眼镜蛇5.百花锦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图2为各样本COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果：1.赤链蛇2.金钱白花蛇3.黄斑渔游蛇4.眼镜蛇5.百花锦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
1、材料
6份蛇类原动物，主要采自广东省、江西省、广西壮族自治区(表1)。全部样本均由华南濒危动物研究所张亮进行性状鉴定。
表1 6份蛇类原动物样本
2、引物设计
Genbank搜索并下载蛇类全线粒体基因序列(Genbank登录号为EU913476、KF311102、FJ752492及NC011390)，DNAMAN软件对上述全线粒体基因序列和用COI通用引物(LCO1490和HCO2198)扩增出的片段进行对位排列比对，并找出各物种COI序列之间的保守区域。用Primer软件在保守区域设计能从各蛇类物种中扩增出一定长度片段的通用引物对，即上游引物DK1-CO1与下游引物DK1-CO2。引物序列如下：
DK1-CO15’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’(SEQ ID NO.1)
DK1-CO25’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’(SEQIDNO.2)
3、样本DNA提取
取各样本组织，按照TIANGEN公司TIANamp基因组DNA提取试剂盒操作手册进行提取，具体操作如下：
1)切取不多于30mg蛇肌肉组织，用液氮研磨，加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
2)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。在56℃放置，直至组织溶解，简短离心去除管盖内壁的水珠。(组织材料新鲜，则裂解时间短，通常需要1小时即可完成。)
3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心，去除管盖内壁的水珠。(加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般放置70℃时会消失，如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。)
4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心，去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中冷冻保存。
4、PCR扩增
PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，包括以下试剂：
PCR反应液配制完后，4000rpm离心10s，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min，获得扩增产物。PCR扩增所用引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’，
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
取4μL PCR产物点至1.2％琼脂糖电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
扩增成功的PCR产物由上海英潍捷基公司进行序列测定，测序结果利用Chromas软件进行拼接并辅以人工校正，剔除两端引物序列，获得相应的COI序列，并将序列登录到Genbank系统获得登录号(见表1)。
5、酶切位点筛选
Nebcutter V2.0分析各物种COI序列，寻找酶切位点。筛选出赤链蛇的特征DNA碱基序列为：5’-GTGCAC-3’(位于COI序列第362位至367位)；限制性内切酶APaL I能识别并切割该序列。限制性内切酶ApaL I的酶切位点为：G^TGCAC。
6、PCR-RFLP反应
1)参照步骤4重新扩增各样本的COI片段并进行电泳检测。
按本发明所述方法扩增6种蛇类DNA模板电泳结果如图1所示，所有蛇类样本在分子量为700bp处均有清晰单一DNA条带，图1表明本发明所述扩增体系能够成功扩增上述蛇类物种COI基因，可于后续实验。
2)参照TIANGEN公司的PCR产物纯化回收试剂盒操作手册，对步骤1)的PCR产物进行纯化，操作如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(需使用当天处理过的柱子)
②估计PCR反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。
③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
④向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
⑤重复操作步骤④。
⑥将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑦将吸附柱CB2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加适量洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
⑧为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB2中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中冷冻保存。
3)酶切反应，反应液体积为20μL，体系为：
将反应液置37℃水浴1小时，反应结束后加1μL的终止缓冲液终止消化。取5μL酶切产物点至1.2％琼脂糖电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
6种蛇类原动物COI片段酶切电泳图谱如图2所示：赤链蛇COI序列酶切成分子量为362bp和296bp的两条片段；其它样本条带仍在700bp处。由图2可看出PCR-RFLP法对6种蛇类样本的检测结果与性状鉴定结果完全一致，表明依据限制性内切酶ApaL I酶切COI片段电泳检测是否出现分子量为362bp和296bp的两条目标片段，可准确鉴定待测样本是否为赤链蛇。
试剂盒及其应用
本发明鉴定方法中所用的试剂盒，包括：引物DK1-CO1(10μM)；引物DK1-CO2(10μM)；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：Taq DNA聚合酶(0.1U/μL)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM)，Tris-HCl(20μM、pH8.3)，KCl(100μM)，MgCl2(3μM)等；ApaL I酶(10U/μL)；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。使用方法如下：
1)按要求提取待测样本DNA。
2)PCR扩增：PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，包括以下试剂：
PCR反应液配制完后，4000rpm离心10s，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。PCR扩增所用引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’，
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
3)纯化PCR产物：选取各商品试剂盒按说明书进行。
4)酶切反应，反应液参考体积为20μL，体系为：
将反应液置37℃水浴1小时，反应结束后加1μL的终止缓冲液终止消化。取5μL酶切产物，加于1.2％琼脂糖凝胶电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
5)鉴定结果的判断：如果在所述电泳产物中检测到分子量为362bp和296bp的两条片段，则判断待测样品为赤链蛇；如果在所述电泳产物中未检测到分子量为362bp和296bp的两条片段，则判断待测样品非赤链蛇。
Claims (3)
1.用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一种鉴定赤链蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，用能够识别赤链蛇特征DNA碱基序列的限制性内切酶APaL I对纯化后的PCR产物进行消化，形成琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；赤链蛇特征DNA碱基序列为：5’-GTGCAC-3’，其位于COI序列第362位至367位；所述鉴定方法包括以下步骤：
1)样品DNA的提取；
2)扩增DNA片段：利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min；
3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物；
4)所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶APaL I进行酶切，所述限制性内切酶APaL I的酶切位点为：G^TGCAC；
5)琼脂糖凝胶电泳分析；
6)鉴定结果的判断：若在所述电泳产物中检测到分子量为362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若未出现上述两条片段，则待测样本非赤链蛇。
3.一种用于鉴别赤链蛇的PCR-RFLP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10μM引物DK1-CO1；10μM引物DK1-CO2；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：0.1U/μL Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM，20μM Tris-HCl、pH8.3，100μM KCl，3μMMgCl2；10U/μL ApaL I酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141126 |