CN104164492A - 基于dna条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 - Google Patents

基于dna条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 Download PDF

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李晓蕾
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Abstract

本发明属于中药品种鉴定技术领域，提出一种鉴别金钱白花蛇及其伪品的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法，用限制性内切酶Spe I和BstE II分别识别并切割金钱白花蛇的特征DNA碱基序列，将金钱白花蛇DNA条形码COI片段酶切成三条片段。本发明鉴定过程：样品DNA提取；引物DK1-CO1、DK1-CO2进行PCR扩增；纯化PCR产物；限制性内切酶Spe I和BstE II消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与金钱白花蛇PCR-RFLP特征结果比较，判断供试品是否为金钱白花蛇。本发明还提出用于所述鉴别方法的试剂盒。本发明方法准确、快速、可靠，可广泛应用于中药材鉴定。

Description

基于DNA条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及中药的品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别金钱白花蛇及其伪品的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。
背景技术
金钱白花蛇为眼镜蛇科动物银环蛇(Bungarus multicinctus)的幼蛇干燥体。气微腥，味微咸。具有祛风、通络、止痉的功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼斜、半身不遂、抽搐、破伤风、麻风、疥癣等。金钱白花蛇市场称作小白花蛇，是一味常用名贵中药材，但随着生态环境的恶化及金钱白花蛇产量较低，导致其药材资源急剧减少。由于疗效显著、药源紧张，金钱白花蛇价格节节攀升，并使得金钱白花蛇市场充斥各种伪品，常见伪品有赤链蛇、金环蛇、铅色水蛇等。并难以根据形态学上的特征进行单一鉴别，使得品种的鉴定越来越困难。因此寻找快速、准确的方法鉴别金钱白花蛇是药材鉴定中的一个重要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括金钱白花蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。
本发明基于DNA条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI(线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。
本发明的技术方案如下：首先从各样本中提取总DNA，利用引物DK1-CO1及DK1-CO2，用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到金钱白花蛇的特征DNA碱基序列：5’-ACTAGT-3’(位于COI序列第121位至126位)，该序列可被限制性内切酶Spe I识别并切割；然而该特征DNA序列并非金钱白花蛇所特有，在乌梢蛇的COI序列中也存在该特征序列，为了有效区分金钱白花蛇与乌梢蛇，本发明增加选定金钱白花蛇的另一特征DNA序列5’-GGTAACC-3’(位于COI序列第353位至359位)，在乌梢蛇的相同位点出现的是5’-GGAAACC-3’，仅有金钱白花蛇的特征序列可被限制性内切酶BstE II识别并切割；序列5’-ACTAGT-3’与序列5’-GGTAACC-3’共同组成金钱白花蛇的特征DNA序列，利用能够识别并切割金钱白花蛇特征DNA序列的限制性内切酶Spe I和BstE II共同对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱，通过分析上述双酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别金钱白花蛇的目的。
对需要鉴定的金钱白花蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-CO1、DK1-CO2)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Spe I及BstE II对供试品的PCR扩增产物进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，金钱白花蛇会出现分子量为121bp、232bp和305bp的三条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述三条片段或少于三条片段。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为金钱白花蛇。
本发明提出的用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
本发明用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，利用能够分别识别金钱白花蛇特征DNA碱基序列5’-ACTAGT-3’和5’-GGTAACC-3’的限制性内切酶Spe I和BstE II，对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；具体步骤如下：
1)提取待测样品DNA；
2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。所述引物DK1-CO1和DK1-CO2，其序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’(SEQ ID NO.1)
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.2)
3)纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析；
4)纯化产物中加入限制性内切酶Spe I和BstE II进行双酶切，限制性内切酶Spe I酶切位点为：A^CTAGT；限制性内切酶BstE II的酶切位点为：G^GTNACC；
5)琼脂糖凝胶电泳分析；
6)鉴定结果的判断，若在所述电泳产物中检测到分子量为121bp、232bp和305bp的三个条带，则判断待测样品为金钱白花蛇；若在所述电泳产物中未出现上述三条片段或少于三条片段，则判断待测样品非金钱白花蛇。
本发明方法中，步骤1)和3)中，采用现有技术的试剂盒提取DNA及纯化PCR产物的方法，不需要配制任何试剂，使得操作时间大大缩短。
本发明还提出了一种用于金钱白花蛇PCR-RFLP鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括：引物DK1-CO1(10μM)；引物DK1-CO2(10μM)；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：TaqDNA聚合酶(0.1U/μL)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM)，Tris-HCl(20μM、pH8.3)，KCl(100μM)，MgCl2(3μM)等；Spe I酶(10U/μL)；BstE II酶(10U/μL)；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
综上所述，本发明解决了鉴定金钱白花蛇与其它品种蛇的难题，提供了鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、金钱白花蛇特征DNA碱基序列、两种限制性内切酶，鉴定方法及其试剂盒，构建了快速、便捷、准确鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP方法，对于保证金钱白花蛇的药材质量，打击金钱白花蛇伪品的市场行为具有重要的价值。
附图说明
图1为金钱白花蛇及其混伪品扩增COI条形码序列PCR产物电泳结果：1.银环蛇2.银环蛇3.银环蛇4.银环蛇5.金环蛇6.眼镜蛇7.赤链蛇8.赤链蛇9.百花锦蛇10.铅色水蛇11.赤链华游蛇12.尖吻蝮蛇13.黄链蛇14.乌梢蛇15.黄斑渔游蛇16.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA)；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图2为金钱白花蛇及其混伪品COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果：1.银环蛇2.银环蛇3.银环蛇4.银环蛇5.金环蛇6.眼镜蛇7.赤链蛇8.赤链蛇9.百花锦蛇10.铅色水蛇11.赤链华游蛇12.尖吻蝮蛇13.黄链蛇14.乌梢蛇15.黄斑渔游蛇16.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA)；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图3为11份市售金钱白花蛇扩增COI条形码序列PCR产物电泳结果：D1-D11为市售药材1号到11号，12.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA)；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图4为11份市售金钱白花蛇COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果：D1-D11为市售药材1号到11号；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
1、材料
15份金钱白花蛇及其混伪品原动物，主要采自广东省、江西省、湖南省、广西壮族自治区(表1)。商品金钱白花蛇购自广东省广州市各大药房及清平市场(表2)。全部样本均由华南濒危动物研究张亮所进行性状鉴定。
表1 金钱白花蛇及其混伪品原动物样本
表2 市售金钱白花蛇样本
2、引物设计
Genbank搜索并下载蛇类全线粒体基因序列(Genbank登录号为EU913476、KF311102、FJ752492及NC011390)，DNAMAN软件对上述全线粒体基因序列和用COI通用引物(LCO1490和HCO2198)扩增出的片段进行对位排列比对，并找出各物种COI序列之间的保守区域。用Primer软件在保守区域设计能从各蛇类物种中扩增一定长度片段的通用引物对，即上游引物DK1-CO1与下游引物DK1-CO2。引物序列如下：
DK1-CO15’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’(SEQ ID NO.1)
DK1-CO25’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.2)
3、样本DNA提取
取各样本组织，按照TIANGEN公司TIANamp基因组DNA提取试剂盒操作手册提取，具体操作如下：
1)切取不多于30mg蛇肌肉组织，用液氮研磨，加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
2)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。在56℃放置，直至组织溶解，简短离心去除管盖内壁的水珠。(组织材料新鲜，则裂解时间短，通常需要1小时即可完成。)
3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心去除管盖内壁的水珠。(加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般放置70℃时会消失，如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。)
4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中冷冻保存。
4、PCR扩增
PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，包括以下试剂：
为防止实验出现假阳性结果，实验设置阴性对照，用无菌双蒸水替代模板DNA，按样品同样的方法进行DNA提取和PCR扩增。
PCR反应液配制完后，4000rpm离心10s，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min，获得扩增产物。PCR扩增所用引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’，
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
取4μL PCR产物点至1.2％琼脂糖电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
扩增成功的PCR产物由上海英潍捷基公司进行序列测定，测序结果利用Chromas软件进行拼接并辅以人工校正，剔除两端引物序列，获得相应的COI序列，并将序列登录到Genbank系统获得登录号(见表1)。
5、酶切位点筛选
NebcutterV2.0分析各物种COI序列，寻找酶切位点。筛选出金钱白花蛇的特征DNA碱基序列为：5’-ACTAGT-3’(位于COI序列第121位至126位)和5’-GGTAACC-3’(位于COI序列第353位至359位)。限制性内切酶Spe I和BstE II能分别识别并切割上述序列。限制性内切酶Spe I酶切位点为：A^CTAGT；限制性内切酶BstE II的酶切位点为：G^GTNACC。
6、PCR-RFLP反应
1)参照步骤4重新扩增各样本的COI片段并进行电泳检测。
按本发明所述方法扩增15种蛇类DNA模板电泳结果如图1所示，所有蛇类样本在700bp处均有清晰单一DNA条带，阴性对照未出现目标条带，图1表明本发明所述扩增体系能够成功扩增上述蛇类物种COI基因，可于后续实验。
2)参照TIANGEN公司的PCR产物纯化回收试剂盒操作手册进行PCR产物纯化，操作如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(需使用当天处理过的柱子)
②估计PCR反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。
③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
④向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
⑤重复操作步骤④。
⑥将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，以彻底琼干吸附材料中残余的漂洗液。
⑦将吸附柱CB2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加适量洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
⑧为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB2中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中冷冻保存。
3)双酶切反应，反应液体积为20μL，体系为：
将反应液置37℃水浴1小时，反应结束后加1μL的终止缓冲液终止消化。取5μL酶切产物点至1.2％琼脂糖电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
金钱白花蛇及其混伪品原动物COI片段酶切电泳图谱如图2所示：金钱白花蛇原动物银环蛇COI序列双酶切成分子量为121bp、232bp和305bp的三条片段；乌梢蛇COI序列双酶切成580bp和120bp长度的两条片段；其它样本条带仍在700bp处；阴性空白对照无条带显示。由图2可看出PCR-RFLP法对15种样本的检测结果与性状鉴定结果完全一致，表明依据Spe I和BstE II双酶切COI片段电泳检测是否出现分子量为121bp、232bp和305bp的三条目标片段，可准确区分金钱白花蛇及其混伪品。
按上述方法对11份市售金钱白花蛇药材进行鉴定，如图3所示11份市售金钱白花蛇样本在700bp处均出现单一清晰条带，阴性对照未出现目标条带，证明本专利所述体系能成功用于商品药材COI条形码的扩增；如图4所示D1-D5PCR产物酶切成分子量为121bp、232bp和305bp的三条片段，D6-D11PCR产物酶切后分子量仍为700bp，证明药材D1-D5的原动物为银环蛇，其它均为伪品，该结果与性状鉴定相一致。图3与图4表明本专利所述的方法能成功用于金钱白花蛇的鉴定。
试剂盒及其应用
本发明鉴定方法中所用的试剂盒，包括：引物DK1-CO1(10μM)；引物DK1-CO2(10μM)；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：Taq DNA聚合酶(0.1U/μL)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM)，Tris-HCl(20μM、pH8.3)，KCl(100μM)，MgCl2(3μM)等；Spe I酶(10U/μL)；BstE II酶(10U/μL)；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。试剂盒使用方法如下：
1)按要求提取待测样本DNA。
2)PCR扩增：PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，包括以下试剂：
PCR反应液配制完后，4000rpm离心10s，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’，
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’’。
3)纯化PCR产物：选取各商品试剂盒按说明书进行。
4)酶切反应，反应液参考体积为20μL，体系为：
将反应液置37℃水浴1小时，反应结束后加1μL的终止缓冲液终止消化。取5μL酶切产物点至1.2％琼脂糖电泳孔中，100V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。
5)鉴定结果的判断：若在所述电泳产物中检测到分子量为121bp、232bp和305bp的三个条带，则判断待测样品为金钱白花蛇；若在所述电泳产物中未出现上述三条片段或少于三条片段，则判断待测样品非金钱白花蛇。

Claims (3)

1.用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为：
DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；
DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一种鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，利用能够分别识别金钱白花蛇特征DNA碱基序列5’-ACTAGT-3’和5’-GGTAACC-3’的限制性内切酶Spe I和BstE II，对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；所述鉴定方法包括如下步骤：
1)样品DNA的提取；
2)扩增DNA片段：利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min；
3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物；
4)在所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶Spe I和BstE II进行双酶切，所述限制性内切酶Spe I的酶切位点为A^CTAGT；所述限制性内切酶BstE II的酶切位点为G^GTNACC；
5)琼脂糖凝胶电泳分析；
6)鉴定结果的判断：如果在所述电泳产物中检测到分子量为121bp、232bp和305bp的三条片段，则待测样品为金钱白花蛇；如果不出现上述三条片段或少于上述三条片段，则待测样本不为金钱白花蛇。
3.一种用于金钱白花蛇PCR-RFLP鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10μM引物DK1-CO1；10μM引物DK1-CO2；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：0.1U/μL Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM，20μMTris-HCl，pH8.3，100μM KCl，3μMMgCl2；10U/μL Spe I酶；10U/μL BstE II酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104962656A (zh) * 2015-07-30 2015-10-07 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法
CN109486965A (zh) * 2018-12-20 2019-03-19 公安部物证鉴定中心 用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的dna微型条形码引物
CN111206105A (zh) * 2020-02-28 2020-05-29 南方医科大学 一种鲜、干金钱白花蛇的分子鉴别方法
CN114657256A (zh) * 2020-12-23 2022-06-24 广东一方制药有限公司 用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法

Non-Patent Citations (3)

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Title
崔丽娜: ""基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定"", 《世界科学技术(中医药现代化)》 *
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