CN108333159B - 一种检测样品菌种相对含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。所述方法步骤如下：引物的设计；基因组的提取；荧光定量PCR；NGS16S测序；NGS分析；预测模型的建立。使用NGS和qPCR两种方法对样品中某种待测细菌的相对含量进行检测，并将NGS的分析结果与qPCR原始实验数据进行拟合和关联以建立一个预测模型，从而使之后qPCR对样品的测试数据可以输入至该预测模型中并直接得出样品中某种待测细菌的相对含量。本方法降低了单独使用qPCR进行细菌相对含量检测实验优化的复杂度和操作的繁琐，提高了样品检测得到最终结果的速度；具有极大市场前景和经济价值。

Description

一种检测样品菌种相对含量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。
背景技术
DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法(一代测序)。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能满足研究的需要。费用更低、通量更高、速度更快的第二代测序技术应运而生。二代测序的基本原理是边合成边测序，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphaTris-EDTA，脱氧核糖核苷三磷酸，PCR反应体系中合成DNA的必要成分)进行PCR(聚合酶链式反应)，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
qPCR(也称RT-PCR，Realtime Fluorescence Quantitative PCR，实时荧光定量PCR)，该技术在1996年由美国Applied BiosysTris-EDTAms公司推出，是一种新型的定量试验技术，它通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，通过建立标准曲线，可计算待测样品模板的初始浓度。单独利用qPCR的方法计算样品中某一特定种类细菌在所有细菌中的含量占比一般可以采用下述两个方法：
1、标准曲线法：通过使用标准品和特异性引物和通用引物分别建立待测种类细菌和细菌门(所有细菌种类合集)的标准曲线，并计算出各自的标准曲线公式。然后对待测样品使用上述两对引物进行qPCR的扩增并得出两个反应各自的Ct值，然后把Ct值代入标准曲线公式，推算出该样品中待测种类细菌和总体细菌的绝对数量，最后用公式“待测种类细菌绝对数量/总体细菌绝对数量”计算出该样品中待测种类细菌所占总细菌数的比值或称相对含量。该方法操作繁琐，为了解决每个批次间反应扩增效率不一致的问题，需要对每批次的扩增样品都重新建立上述两条标准曲线，不仅占用了多个反应位置，降低了反应通量，而且标准曲线的建立需要更精确的操作，增加了额外的操作时间和出错的概率。
2、2-ΔΔCt法：由于只是为了测定待测种类细菌占总体细菌的相对含量，因此可以跳过计算绝对数量这一步骤，直接将样品的Ct值代入公式“2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值]”计算待测种类细菌所占总细菌数的含量。该方法较标准曲线法虽然大大减少了额外的反应占用仪器上反应孔的数量，提高了反应的通量。但是此法不仅需要增加一个内参基因的扩增而且要求样品所有基因的扩增效率相等且需要接近100％，因此反应优化十分复杂，很多靶基因由于需要特定引物或特定的PCR反应条件，其扩增效率往往并不能够达到如此高的要求，而且要使各个反应的扩增效率相等更是难以优化。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于简化现有技术的繁琐，从而提出一种检测样品菌种相对含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种检测样品菌种相对含量的方法，所述方法步骤如下：
1)引物的设计：根据待测菌的16S rRNA或其他靶基因片段设计引物；
2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；
3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；
4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；
5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；
6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。
优选的，所述初步的离心处理步骤为：
将样本预处理后的离心管，进行短暂的离心处理：速度为4000rpm，时间为30s，使样本处于离心管的底部；在离心管中加入1000ul的10×Tris-EDTA；漩涡震荡使样本混匀成悬浮液。
优选的，所述物理破碎的步骤为：
将含有样品的离心管，在12000rpm的速度下进行离心5min，去上清；在每个离心管中加入酸洗玻璃珠；加入900ul的TENS裂解液，震荡混匀；将样品离心管对称放置于组织破碎仪中进行破碎处理，频率为50HZ，时间为10min。
优选的，所述冻融酶解处理的步骤为：
将经破碎处理后的样品离心管，低速离心5s；
将放有样品管的浮漂置65℃的液氮水浴冻融15min；
冻融结束后，低速离心5s，加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h；
取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；
取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min。
优选的，所述萃取处理的步骤为：
将温育完的样品离心管从水浴锅或金属浴中取出，放入已预冷至4℃的离心机中离心，离心速度为14000rpm，时间为5min，离心后将得到的上清液转移至离心管中；
在加入上清液的管中加入浓度为10ng/uL的RNase 10uL，在14000rpm的速度下离心处理5min得到新的离心液；再取得到的上清液至新的离心管中；加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；
然后在4℃的温度下进行离心处理，离心处理的速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；
然后在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间后10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇溶液，漩涡震荡混匀；
最后再在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分两层，将上层液体转移至新的离心管中。
优选的，所述DNA过柱纯化的步骤为：
取离心管进行离心处理，速度为14000rpm，时间为30min；离心后，若沉淀目视可见，则吸走全部的上清液，并丢弃；若未见沉淀，则小心吸取上清液；然后加入100uLElution Buffer，漩涡震荡，直至沉淀溶解，得到DNA溶液；
在DNA溶液中加入500uL Binding Buffer，5uL NaAc，振荡10s，短暂离心5s，使管盖和管内壁处无液体；将离心管中液体全部转移至DNA分离吸附柱中，静置5min；
将DNA分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；然后再次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；
然后第三次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min；
进行第四次将DNA分离吸附柱离心处理，速度为14000rpm，时间为2min；后将DNA吸附柱置于新的离心管中，室温放置5min；
在每个分离吸附柱中加入60uL经预热至55℃的Elution Buffer，室温静置5分钟；离心处理，速度为10000rpm，时间为3min。
优选的，所述DNA质量检测，包括对DNA进行电泳和纯度和电泳检测。
优选的，所述电泳检测的步骤为:使用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2uL样品，取2uL的λDNA/HindⅢ，在电压120V，时间30min的条件下，对提取的DNA和PCR产物进行条带检测；
所述纯度检测的步骤：
使用紫外分光光度计，对提取的DNA进行纯度检测；当A280/A260比值为1.8-2.0，A260/A230大于2.0时，则表明DNA纯度较好。
优选的，所述DNA过柱纯化之前，还需要进行静置过夜处理，具体步骤为：萃取处理后得到的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，加入二倍体积的无水乙醇，混匀，在-20℃静置2h以上或-20℃过夜。
更为优选的，所述预处理的具体步骤为：
在超净工作台台面上铺一层保鲜膜，准备称量纸、一次性刀片、小勺；戴上一次性PE手套，取一份已半解冻样本；将半解冻样本置于称量纸上，趁其未完全解冻前，用一次性刀片切取其内部的部分约200mg，用刀片或勺子将截取部分放入离心管中，完成取样；取样完的样本放入-80℃保存；将使用过的称量纸丢入垃圾桶，更换一次性刀片，将刀片放入锐器盒，用医用酒精擦拭、清洁取样的勺子；完成所有样本预处理后，将台面清洁，取用的物品归放原处。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：通过采用NGS技术，在前期测试多份样本并分析出待测种类细菌在总细菌中的相对含量。之后对这同一批样本进行qPCR实验(该qPCR实验要求仅仅只需保证扩增产物的特异性和扩增效率的回归系数达到R2≥0.98即可，对扩增效率和不同反应之间扩增效率的一致性并无要求)，以此NGS的分析结果为标准，把qPCR实验得出的Ct值与测序分析结果进行拟合，建立一个预测模型。该预测模型便能利用之后样品所测得的Ct值作为输入，直接输出待测种类细菌占总细菌的含量这一结果。克服了目前单独使用qPCR检测技术中标准曲线法的繁琐操作和2-ΔΔCt法的复杂实验优化两个难题。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是实施例所述的引物Bifi-548扩增子的特异性示意图(3个重复)；
图2是实施例所述的引物Lact-230扩增子的特异性示意图(3个重复)；
图3是实施例所述的引物16S-466扩增子的特异性示意图(3个重复)；
图4是实施例所述的引物Bifi-548扩增效率的线性回归方程示意图；
图5是实施例所述的引物Lact-230扩增效率的线性回归方程示意图；
图6是实施例所述的引物16S-466扩增效率的线性回归方程示意图。
具体实施方式
实施例1本实施例公开了一种粪便样品中双歧杆菌属和乳酸杆菌属占总细菌数相对含量的测定的方法，具体步骤如下：
1样本预处理
1.1在超净工作台台面上铺一层保鲜膜，准备称量纸、一次性刀片、小勺.
1.2戴上一次性PE手套，取一份已半解冻样本。将半解冻样本置于称量纸上，趁其未完全解冻前，用一次性刀片切取其内部的部分(没有暴露在空气中的部分)约200mg，用刀片或勺子将截取部分放入离心管中，完成取样。
1.3取样完的样本放入-80℃保存。将使用过的称量纸丢入垃圾桶，更换一次性刀片，将刀片放入锐器盒，用医用酒精擦拭、清洁取样的勺子。
1.4完成所有样本预处理后，将台面清洁，取用的物品归放原处。
2加试剂
2.1先将水浴锅或金属浴的温度设定为65℃、37℃备用。
2.2将样本预处理中的离心管，短暂离心：4000rpm，30s，使样本处于离心管的底部。
2.3依次在离心管中加入1000ul 10×TE。
2.4确保加完试剂的管盖严实，漩涡震荡使样本混匀成悬浮液，无较大固体颗粒。
3物理破碎
3.1将上一步含样品的离心管，即样品离心管，12000rpm离心5min，去上清。
3.2每个离心管中加入适量直径为0.1mm的酸洗玻璃珠。
3.3加入900ul TENS裂解液，震荡混匀。
3.4将样品离心管对称放置于组织破碎仪中，破碎处理：50HZ，10min。
4冻融及酶解
4.1将经破碎处理后的样品离心管，从破碎仪中取出，检查管盖，低速离心5s，使管盖无液体。
4.2选择适当的浮漂，将样品离心管置于浮漂中，取适量液氮至泡沫盒，将放有样品管的浮漂置液氮/65℃水浴中先后分别5min，重复3次，注意观察样品是否完全冻/融。
4.3冻融结束后，低速离心5s，使管盖无液体，每管中加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h，期间颠倒混匀数次，同时将闲置水浴锅调节温度置56℃及65℃。
4.4取出样品管，每个样品中加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，期间颠倒混匀数次，再65℃温育30min，期间颠倒混匀数次。
5萃取
5.1准备5组新的2mL离心管，并按样品顺序写上编号。将离心机预冷至4℃。
5.2将温育完的样品离心管从水浴锅或金属浴中取出，用纸巾擦干管外壁的水，按顺序放入已预冷至4℃的离心机中离心：14000rpm，5min。小心取出离心管，勿使沉淀重悬，将上清液转移至准备好的离心管中。
5.3在上清液的管中加入浓度为10ng/uL的RNase 10uL。
5.414000rpm，5min。取不超过900uL的上清液至新的离心管中，不要吸到底部沉淀。
5.5加入等体积的Tris饱和酚溶液，盖好管盖，漩涡震荡混匀。后4℃离心：12000rpm，10min。
5.6离心后离心管中液体分三层，将上层液体(约800ul)转移至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚溶液，盖好管盖，漩涡震荡混匀。后4℃离心：12000rpm，10min。
5.7离心后离心管中液体分三层，将上层液体(约700ul)转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇＝24：1溶液，盖好管盖，漩涡震荡混匀。后4℃离心：12000rpm，10min。
5.8离心后离心管中液体分两层，将上层液体(约600ul)转移至新的离心管中。
6静置过夜
6.1在上一步(5.7)得到的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，加入二倍体积的无水乙醇，盖好管盖，颠倒混匀，-20℃静置2h以上或-20℃过夜。
7DNA过柱纯化
7.1预冷离心机至4℃。准备一组1.5mL离心管，一组DNA分离吸附柱，将适量Elution Buffer预热至55℃，备用。
7.2从-20℃冰箱取出静置的离心管进行离心：14000rpm，30min。
7.3离心后，若沉淀目视可见，则吸走全部的上清液，并丢弃；若未见沉淀，则小心吸取上清液，并保留200uL于管中。然后加入100uL Elution Buffer，漩涡震荡，直至沉淀溶解，此时得到的为DNA溶液。
7.4在DNA溶液中加入500uL Binding Buffer，5uL NaAc，振荡10s，短暂离心5s，使管盖和管内壁处无液体。
7.5将离心管中液体全部转移至对应编号的DNA分离吸附柱中，静置5min。
7.6将DNA分离吸附柱离心：10000rpm，1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uLWashing Buffer，静置1min。
7.7重复步骤7.6.
7.8将DNA分离吸附柱离心：10000rpm，1min，弃滤液。
7.9将DNA分离吸附柱离心：14000rpm，2min。后将DNA吸附柱置于新的1.5mL离心管中，每个样品之间间隔适当距离，打开管盖，室温放置5min.
7.10在每个分离吸附柱中加入60uL经预热至55℃的Elution Buffer，盖上管盖，室温静置5分钟。离心：10000rpm，3min.
7.11从离心机取出1.5mL管，检查是否有漏加Elution Buffer的样品，并核对吸附柱上的编号是否与1.5mL离心管上的编号一致。若有ElutionBuffer漏加的，重复上一步骤。若无漏加的且编号一致，将吸附柱丢弃。
7.12按样品编号顺序整理好1.5mL离心管，放入96孔冻存盒中。临时存放可放4℃，短期存储放-20℃，长期储存放-80℃。
8DNA质量检测
对于提取的DNA需要进行质量检测。
8.1浓度检测
使用qubit 3.0和相应的DNA检测试剂，对提提取的DNA进行浓度检测。
8.2电泳检测
使用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2uL样品，取2uL的λDNA/HindⅢ，在电压120V，时间30min的条件下，对提取的DNA和PCR产物进行条带检测。
8.3纯度检测
使用NanoDrop 1000紫外分光光度计，对提取的DNA进行纯度检测。当A280/A260比值为1.8-2.0，A260/A230大于2.0时，则表明DNA纯度较好。
Page 2
荧光PCR的设定：
荧光阈值和基线一般使用仪器默认设置，但不同品牌仪器的默认值不同；而且PCR反应条件也随着实验的不同而改变，无法给出通用的量值。
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Ct值原始数值：
Ct值为仪器运行完毕实验后自动给出的数值结果，无需测量。
Page 2
NGS分析流程：
NGS的分析流程是本公司之前开发出来的Linux程序，输入测序数据后可一键输出结果。该程序都是一个个的代码和指令，以下是概括性描述分析流程的各个步骤，如果需要详细的流程方法，还需提供关于此类软件处理的方法是如何撰写以及格式是如何表现的：
1、载入测序数据文件；
2、去除测序和PCR的错误数据；
3、合并同类项；
4、提取数据；
5、对齐数据；
6、预分簇；
7、剔除嵌合体；
8、与数据库对比并聚类；
9、输出分析结果。
本实施例通过查阅相关试剂盒产品和文献，确定了使用染料法检测双歧杆菌属和乳酸杆菌属各两对引物。根据扩增子长度不同，双歧杆菌属的引物记作Bifi-548，548表示这引物扩增出条带的长度为548bp，同上所述，乳酸杆菌属的引物记作Lact-230，检测总细菌数的通用引物记作16S-466。
首先确定了这3对引物的退火温度和反应体系后，使用溶解曲线程序检测这3对引物的特异性情况，如图1-图3所示。对引物的特异性(只有一个波峰)均良好，确定Bifi-548，Lact-230和16S-466作为扩增样品中双歧杆菌属，乳酸杆菌属和总细菌的引物。
下一步则是确认对引物的扩增效率的相关系数R的平方是否≥0.98，如图4-图6所示。实施例所述对引物Bifi-548，Lact-230和16S-466扩增效率的相关系数R平方均满足R2≥0.98的要求。因此接下来使用这3对引物对8个粪便样品提取的DNA进行qPCR实验，并得出每个样品中这3对引物扩增的平均Ct值，如表1所示：
表1 Bifi-548,Lact-230,16S-466三对引物在8份样品进行qPCR测试中的Ct值
Figure BDA0001562989910000111
接下来将表1中qPCR实验数据与表2中该8份样品经过16S测序后分析得到的双歧杆菌属和乳酸杆菌属含量的分析数据进行拟合，建立一个预测模型，得到的模型可对后续样品qPCR的原始数据进行处理，直接输出目标菌含量的结果。
表2 8份样品经过16S二代测序和分析后得出的目标菌含量
Figure BDA0001562989910000112
本实施例所述衍生自2-ΔΔCt法，由于测定总体细菌数量的靶基因为16S基因，其常常作为内参，2-ΔΔCt可以简化为2-ΔCt的计算方式，直接将待测种类细菌组的平均Ct值直接减去总体细菌组的平均Ct值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种检测样品菌种相对含量的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
1)引物的设计：根据待测菌的16S rRNA或其他靶基因片段设计引物；
2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；
所述物理破碎的步骤为：将含有样品的离心管，在12000rpm的速度下进行离心5min，去上清；在每个离心管中加入酸洗玻璃珠；加入900ul的TENS裂解液，震荡混匀；将样品离心管对称放置于组织破碎仪中进行破碎处理，频率为50HZ，时间为10min；
所述冻融酶解处理的步骤为：将经破碎处理后的样品离心管，低速离心5s；将放有样品管的浮漂置65℃的液氮水浴冻融15min；冻融结束后，速离心5s，加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h；取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；
所述DNA过柱纯化的步骤为：
取离心管进行离心处理，速度为14000rpm，时间为30min；离心后，若沉淀目视可见，则吸走全部的上清液，并丢弃；若未见沉淀，则小心吸取上清液；然后加入100uL ElutionBuffer，漩涡震荡，直至沉淀溶解，得到DNA溶液；
在DNA溶液中加入500uL Binding Buffer，5uL NaAc，振荡10s，短暂离心5s，使管盖和管内壁处无液体；将离心管中液体全部转移至DNA分离吸附柱中，静置5min；
将DNA分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；然后再次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；
然后第三次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1m in；
进行第四次将DNA分离吸附柱离心处理，速度为14000rpm，时间为2min；后将DNA吸附柱置于新的离心管中，室温放置5min；
在每个分离吸附柱中加入60uL经预热至55℃的Elution Buffer，室温静置5分钟；离心处理，速度为10000rpm，时间为3min；
所述DNA质量检测包括对DNA进行电泳检测和纯度检测；所述电泳检测的步骤为:使用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2uL样品，取2uL的λDNA/HindⅢ，在电压120V，时间30min的条件下，对提取的DNA和PCR产物进行条带检测；所述纯度检测的步骤：使用紫外分光光度计，对提取的DN A进行纯度检测，当A280/A260比值为1.8-2.0，A260/A230大于2.0时，则表明DNA纯度较好；
3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；
4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；
5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；
6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初步的离心处理步骤为：
将样本预处理后的离心管，进行短暂的离心处理：速度为4000rpm，时间为30s，使样本处于离心管的底部；在离心管中加入1000ul的10×Tris-EDTA；漩涡震荡使样本混匀成悬浮液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述萃取处理的步骤为：
将温育完的样品离心管从水浴锅或金属浴中取出，放入已预冷至4℃的离心机中离心，离心速度为14000rpm，时间为5min，离心后将得到的上清液转移至离心管中；
在加入上清液的管中加入浓度为10ng/uL的RNase 10uL，在14000rpm的速度下离心处理5min得到新的离心液；再取得到的上清液至新的离心管中；加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；
然后在4℃的温度下进行离心处理，离心处理的速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；
然后在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间后10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇溶液，漩涡震荡混匀；
最后再在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分两层，将上层液体转移至新的离心管中。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA过柱纯化之前，还需要进行静置过夜处理，具体步骤为：萃取处理后得到的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，加入二倍体积的无水乙醇，混匀，在-20℃静置2h以上或-20℃过夜。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预处理的具体步骤为：
在超净工作台台面上铺一层保鲜膜，取一份已半解冻样本；将半解冻样本置于称量纸上，趁其未完全解冻前，用一次性刀片切取其内部的部分约200mg，用刀片或勺子将截取部分放入离心管中，完成取样；取样完的样本放入-80℃保存。
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