CN107267516A - 双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用 - Google Patents

双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用，本发明同时使用了2条sgRNA，以CF细胞为模型，针对编码CFTR基因的第508位氨基酸的核苷酸进行定向缺失，获得CFTR第508位氨基酸缺失病人一样的致病基因型，并发现本发明双sgRNA较单sgRNA进行编辑具有更高的效率，本发明为基因疾病的细胞模型构建和基因编辑提供了更为有效的方法。

Description

双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用
技术领域
本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用，特别涉及一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化细胞模型的方法及应用。
背景技术
基因编辑技术在农业和医学领域均具有广阔的应用前景,技术方法正在不断改进和创新，主要的改良方向是提高基因编辑的精准程度。目前基因编辑主要依靠锌指核酸酶(ZFN)，TALEN与CRISPR/Cas9三大技术，应用最广泛的是CRISPR/Cas9，它使用1条sgRNA，效率和精度仍需提高。囊肿性纤维化(Cystic fibrosis，CF)是一种遗传疾病，其可能会影响身体多处，其中以肺部和消化系统所受的影响最为严重，白种人最常患上囊肿性纤维化。但是目前针对该疾病仍未有治疗的方法。该疾病的发生主要是由于CFTR基因的突变造成的，其中大约70％的病人是由于CFTR基因编码的第508位氨基酸的核苷酸(CTT)的缺失引起的。随着基因编辑技术的发展，基因编辑技术为这一疾病的治疗提供了新的治疗思路，我们可以通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术对突变的CFTR基因进行修复，从而达到从根本上治疗疾病的目的。目前针对人CFTR突变位点的修复虽然有一些研究，然而效率却并不高或者需要使用筛选标记基因。
发明内容
本发明同时使用了2条sgRNA，以CF细胞为模型，针对编码CFTR基因的第508位氨基酸的核苷酸进行定向缺失，获得CFTR第508位氨基酸缺失病人一样的致病基因型，并发现本发明双sgRNA较单sgRNA进行编辑具有更高的效率，本发明为基因疾病的细胞模型构建和基因编辑提供了更为有效的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于构建囊肿性纤维化模型的双sgRNA，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
双sgRNA在制备构建囊肿性纤维化模型的试剂中的应用，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
进一步的，所述囊肿性纤维化模型为囊肿性纤维化的细胞模型、囊肿性纤维化的动物模型。
一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化模型的方法，该方法为：将上述所述的双sgRNA同时转染目标细胞或动物，培养30～60h后，即得囊肿性纤维化细胞或动物模型。
进一步的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染体系为：106～107个细胞，1～2μgsg1，1～2μg sg508-W，8～12μg Cas9蛋白，8～12μg Oligo，100～150μl电转液。
进一步的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染条件为在620V，30ms的条件下进行电转。
一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的双sgRNA或/和该双sgRNA的转录模板。
引物组在制备上述所述双sgRNA中的应用，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：4)；
sg-R：AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，该试剂盒中含有用于制备上述所述的双sgRNA的引物组，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：4)；
sg-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
进一步的，该试剂盒中还含有质粒px330。
本发明的有益效果是：
本发明在针对CFTR 508位点的定点修饰中使用了双sgRNA，相比于单个sgRNA，其基因编辑效率得到了提高。
附图说明
图1为各组细胞突变的精确修饰效率比较。
具体实施方式
一种用于构建囊肿性纤维化模型的双sgRNA，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
双sgRNA在制备构建囊肿性纤维化模型的试剂中的应用，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
优选的，所述囊肿性纤维化模型为囊肿性纤维化的细胞模型、囊肿性纤维化的动物模型。
一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化模型的方法，该方法为：将上述所述的双sgRNA同时转染目标细胞或动物，培养30～60h后，即得囊肿性纤维化细胞或动物模型。
优选的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染体系为：106～107个细胞，1～2μg sg1，1～2μg sg508-W，8～12μg Cas9蛋白，8～12μg Oligo，100～150μl电转液。
优选的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染条件为在620V，30ms的条件下进行电转。
一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的双sgRNA或/和该双sgRNA的转录模板。
引物组在制备上述所述双sgRNA中的应用，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：4)；
sg-R：AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，该试剂盒中含有用于制备上述所述的双sgRNA的引物组，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：4)；
sg-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
优选的，上述试剂盒中还含有质粒px330。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1用于构建囊肿性纤维化模型的双sgRNA
HEK293细胞系购自ATCC公司( CRL-1573TM)，培养液成分：10％胎牛血清(10438026，Gibco)+89％DMEM(11965，Gibco)+1％双抗(15140122，Gibco)，培养条件为5％CO2，37℃细胞培养箱。
囊肿性纤维化(Cystic fibrosis，CF)是一种遗传疾病，70％的病人是由于CFTR基因编码的第508位氨基酸的核苷酸(CTT)的缺失引起的。为了有效构建囊肿性纤维化模型，本发明通过大量的研究实验，最终发现以下2条sgRNA能够显著提高囊肿性纤维化模型建立的准确率。所述2条sgRNA序列其分别为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
实施例2双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化细胞模型的方法
(1)双sgRNA的制备
1.1合成引物sg1-F，sg508-W-F与sg-R：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：4)
sg-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
1.2双sgRNA的转录模板的制备
以px330质粒为模板(购自addgene，货号：Plasmid#42230)，进行PCR扩增，分别获得双sgRNA(sg1和sg508-W)的转录模板，各反应体系如表1和表2所示。
表1sg1的转录模板的PCR扩增体系
试剂 体积
Taq酶 0.4μl
10×Buffer 5μl
dNTP 8μl
10nM sg1-F 5μl
10nM sg-R 5μl
Px330 反应终浓度至4ng/μl
水 加至50μl
总体系 50μl
表2sg508-W的转录模板的PCR扩增体系
试剂 体积
Taq酶 0.4μl
10×Buffer 5μl
dNTP 8μl
10nM sg508-W-F 5μl
10nM sg-R 5μl
Px330 反应终浓度至4ng/μl
水 加至50μl
总体系 50μl
PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s、52℃30s、72℃30s，38个循环；72℃5min；16℃2min。
PCR结束后利用PCR产物纯化试剂盒(A9281，Promega)分别对产物进行纯化，分别获得大小约为100bp的DNA片段DNA-sg1和DNA-sg508-W，即为双sgRNA的转录模板。
1.3双sgRNA的体外转录
分别以上述所得的DNA片段DNA-sg1、DNA-sg508-W为模板，利用Cellscript公司的T7体外转录试剂盒(CAS3107,Cellscript)获得两种sgRNA，即sg1与sg508-W，具体步骤参见试剂盒说明书。
(2)转染细胞
2.1在金唯智公司合成寡聚核苷酸(Oligo)序列：TGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATTGGTGTTTTCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAGCATGCCAACTAGAAGAG(SEQ ID NO：6)。
2.2细胞转染：
1)细胞准备，准备HEK293细胞用于转染；
2)Cas9核蛋白(Ribonucleoproteins，RNP)准备，Cas9蛋白购自唯尚立德公司(E025S)，将双sgRNA(sg1和sg508-W)与Cas9蛋白于室温中孵育10分钟；
3)按照表3中配方，配制各组电转液体系，电转液、电转杯与电转仪(CTX-1500A)及相关电转耗材均购自Celetrix公司。
表3各组电转液体系
组别 sgRNA Cas9蛋白 Oligo 电转液
第一组 1.6μg Sg1+1.6μg sg508-W 10μg 10μg 120μl
第二组 3.3μg Sg1 10μg 10μg 120μl
第三组 3.3μg sg508-W 10μg 10μg 120μl
4)将各组电转液体系分别对3×106个细胞HEK293进行重悬，混合均匀后转入电转杯中，用电转仪在620V，30ms的条件下，进行电转，其后将电转细胞取出分别培养于60cm细胞培养皿中。
5)48小时后收集细胞，通过挑克隆筛选出囊肿性纤维化细胞模型。
下面对实施例2中转染后所得的细胞作一步的效果检测。
一、细胞基因组DNA基因突变情况检测
方法：
1)利用酚氯仿法分别提取实施例2中三组实验所得细胞的基因组DNA。
2)PCR扩增
在天一辉远公司合成上游扩增引物(CF-test-F)与下游扩增引物(CF-test-R)，其序列为：
CF-test-F：5’ATTAAGCACAGTGGAAGAA 3’(SEQ ID NO：7)；
CF-test-R：5’TAACCGATTGAATATGGAG 3’(SEQ ID NO：8)。
利用此对引物分别以上述提取的三组基因组DNA为模板，对其CFTR基因突变位点进行扩增，扩增体系与条件如表4所示。
表4PCR扩增体系
试剂 体积
Taq酶 0.4μl
10×Buffer 5μl
dNTP 8μl
CF-test-F(10nM) 5μl
CF-test-R(10nM) 5μl
细胞基因组DNA 反应终浓度至50ng/μl
水 加至50μl
总体系 50μl
PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，38个循环；72℃5min；16℃2min。
PCR结束后利用PCR产物纯化试剂盒(A9281，Promega)分别对产物进行纯化，获得230bp大小的片段。
3)高通量测序检测
将纯化的PCR产物送往麻省综合医院(MGH)(https://dnacore.mgh.harvard.edu/new-cgi-bin/site/pages/admin_pages/login.jsp)进行高通量检测与分析，得到发生精确修饰的DNA比例。
结果：
高通量测序结果如表5和图1所示，从中可以看出，分别单独使用sg1、sg508-W进行细胞的基因突变，细胞基因组中发生碱基敲除的细胞数分别为24.71％、2.1％，但其中发生靶点敲除的细胞数分别为2.86％、0％，故这两组的突变准确率分别为11.57％、0％。而当同时使用sg1与sg508-W这两条sgRNA进行细胞的基因突变时，虽然细胞基因组中发生碱基敲除的细胞数为17.21％，比sg1单独使用时的数量要少，但其中发生靶点敲除的细胞数并没降低(2.8％)，细胞的突变准确率达16.26％，显著高于sg1、sg508-W单独使用时的突变准确率。这说明本发明sg1与sg508-W这两条sgRNA同时使用时，更有利于细胞发生靶点碱基敲除，有效降低非靶点的碱基敲除，从而有效提高了细胞基因突变的精确修饰效率,可以提高基因编辑(基因敲入)效率，更有利于囊肿性纤维化细胞模型的成功构建。其中的原理可能是：一条有效的sgRNA(sg1)可能会让另外一条低效的sgRNA(sg508-W)具有较高的切割功能，其他研究发现，突变位点距离切割位点越近，其精确突变效率则越高，然而往往突变位点附近的sgRNA效率可能并不高，本发明中的切割位点正好位于突变位点上，距离为0，在其远端再寻找一条高效的sgRNA，该sgRNA可提高突变位点附近的sgRNA的效率，从而提高定点敲入的效率。本发明中当sg508-W被sg1激活活，会带来更高的精确突变效率。我们在其他位点上检测的数据比表5中的会更好，但是不方便在本专利文件中公开。
表5高通量测序结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccuaugauga auauagauac aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaagauga uauuuucuuu aau 23
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaatacga ctcactatag gtctgtatct atattcatca tgttttagag ctagaaatag 60
c 61
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtaatacga ctcactatag gattaaagaa aatatcatct tgttttagag ctagaaatag 60
c 61
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 6
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgttctcagt tttcctggat tatgcctggc accattaaag aaaatatcat tggtgttttc 60
tatgatgaat atagatacag aagcgtcatc aaagcatgcc aactagaaga g 111
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attaagcaca gtggaagaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taaccgattg aatatggag 19

Claims (10)

1.一种用于构建囊肿性纤维化模型的双sgRNA，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
2.双sgRNA在制备构建囊肿性纤维化模型的试剂中的应用，该双sgRNA的序列为：
sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；
sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述囊肿性纤维化模型为囊肿性纤维化的细胞模型、囊肿性纤维化的动物模型。
4.一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化模型的方法，其特征在于，该方法为：将权利要求1所述的双sgRNA同时转染目标细胞，培养30～60h后，即得囊肿性纤维化细胞模型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，双sgRNA同时转染目标细胞的转染体系为：106～107个细胞，1～2μg sg1，1～2μg sg508-W，8～12μg Cas9蛋白，8～12μg Oligo，100～150μl电转液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，双sgRNA同时转染目标细胞的转染条件为在620V，30ms的条件下进行电转。
7.一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的双sgRNA或/和该双sgRNA的转录模板。
8.引物组在制备权利要求1所述双sgRNA中的应用，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaata gc(SEQ ID NO：4)；
sg-R：AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
9.一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有用于制备权利要求1所述的双sgRNA的引物组，所述引物组的序列为：
sg1-F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCTGTATCTATATTCATCATgttttagagctagaaatagc(SEQID NO：3)；
sg508-W-F：TGTAATACGACTCACTATAGGATTAAAGAAAATATCATcttgttttagagctagaaata gc(SEQ ID NO：4)；
sg-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：5)。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，该试剂盒中还含有质粒px330。
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