CN109295060A

CN109295060A - 一种用于基因编辑的配对sgRNA及其应用

Info

Publication number: CN109295060A
Application number: CN201811088469.XA
Authority: CN
Inventors: 谢安勇; 冯依力; 郭涛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明公开了一种用于基因编辑的配对sgRNA及应用，根据靶标基因或靶标基因组位点的特定编辑需求设计多条sgRNA，选择两条特定间距、对应PAM特定位置组合的sgRNA作为配对sgRNA。本发明配对Cas9‑sgRNA可以提高基因编辑效率及精准度，可以用来定量分析细胞和动物体内NHEJ，包括总NHEJ效率(即总编辑效率)、精准型NHEJ和突变型NHEJ的频率及比例、突变型NHEJ接口的增删方向、长度及频率、以及突变型NHEJ接口的微同源序列的利用度等。该技术更灵活、简单、快速，可方便地移植到各种细胞和组织器官中应用，而且准确度也不受影响。

Description

一种用于基因编辑的配对sgRNA及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种基因编辑方法，特别涉及一套操纵高效的精准型非同源末端连接(non-homologous end Joining,NHEJ)修复途径提高基于精准删除特定长度DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑的效率及精准度的方法。

(二)背景技术

成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR(Clustered RegularlyInterspersed Short Palindromic Repeats)是目前应用最为广泛的基因组编辑系统，是从细菌及古细菌中降解入侵病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制改造而来。其中最为常用是CRISPR/Cas9系统，它包含三个元件：Cas9蛋白、crRNA(CRISPR-associated RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)。Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过识别和结合靶DNA的PAM(protospacer adjacent motif)基序(比如化脓链球菌SpCas9对应的PAM主要是5’-NGG-3’)，解旋靶DNA，通过crRNA中的含20碱基的小向导RNA(gRNA)与单链靶DNA碱基配对，形成RNA-DNA复合结构，进而利用Cas9RuvC和HNH核酸酶结构域各自切割靶DNA的一条链，形成带有平末端的DNA双链断裂。在系统优化过程中，crRNA和tracrRNA也可以融合成单一的向导RNA(single guide RNA，sgRNA)。这个sgRNA更简便，介导的Cas9靶点切割也同样有效。

在包括人类细胞在内的真核细胞中，Cas9诱导的DNA双链断裂主要由两条途径修复：同源重组(homologous recombination；HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining；NHEJ)。DNA双链断裂修复是进行基因编辑的理论基础，HR是一种精准修复方式，主要发生于细胞周期G2、S期，利用同源序列进行精准修复；NHEJ贯穿于整个细胞周期，被认为是一种错误倾向性修复方式，修复过程中可发生一定比例的碱基缺失或插入。利用CRISPR-Cas9系统进行快速有效基因编辑的理论基础正是其高效的DNA切割效率所带来的频发的DNA双链断裂修复事件。

一个传统的基因编辑操作是利用非精准NHEJ修复产生插入和删除(indel)进行基因敲除、特定DNA片段删除和基因片段替换。通常，非精准NHEJ效率越高，编辑效率可能越高。但有时也并非如此，比如，如果非精准NHEJ产生的大都是整码indel，即使非精准NHEJ效率高，基于移码突变的基因敲除效率并不一定高。此外，非精准NHEJ的产物异质性高，难以预测和控制，不适合精准编辑的要求。然而，使用配对Cas9-sgRNA在基因组71个位点上同时诱导两个邻近DSB，通过分析其修复，我们的结果显示Cas9诱导的NHEJ近一半是精准连接，同时也揭示NHEJ修复过程中模板化插入(templated insertions)会影响精准型NHEJ的效率。一方面，这纠正了我们过去的错误认识，即Cas9诱导的DSB的NHEJ修复是易错的。事实上，这个结果表明，由于Cas9诱导产生的DSB的平末端是可以直接连接，因此主要依靠精准NHEJ来修复。很显然这种内在的精准NHEJ修复并不利于突变产生，阻碍CRISPR/Cas9介导的基于突变的基因编辑(包括基因敲除)。另一方面，这个特征则提供了一个基因编辑改良的机会。利用配对Cas9-sgRNA诱导临近配对的DSB，通过操纵精准NHEJ修复，我们可以达到高效、可控的精准删除及插入，实现精准高效的基因敲除、整码删除、特定基因组片段删除及基因片段敲入或替换。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种操纵高效的精准型非同源末端连接(non-homologous endJoining,NHEJ)修复途径提高CRISPR/Cas9基因编辑效率及精准度的方法。传统CRISPR/Cas9基因编辑是利用非精准型NHEJ修复产生插入和删除(即增删，indel)进行基因敲除(移码突变)、特定DNA片段删除或基因敲入(基因片段替换)，但效率低、突变多、异质性高。本发明方法通过控制配对Cas9-sgRNA在靶点上的间距与PAM方向，产生两个临近的DNA双链断裂(double strand breaks，DSB)，充分利用高频的精准NHEJ修复，克服模板化插入的影响，高效产生精准基因编辑产物。根据需要，这些产物包括基于移码突变的基因敲除、整码精准删除、其它利用精准长度基因组片段删除的应用及包括基因敲入的精准基因组片段替换。本发明还提供一个可替换NHEJ报告系统的体内体外NHEJ分析方法，灵活、便捷、准确。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种用于基因编辑的配对sgRNA，所述配对sgRNA按如下方法获得：通过控制配对sgRNA在靶点上的间距和/或对应PAM方向来实施，即根据靶标基因或靶标基因组位点设计多条sgRNA，根据基因编辑要求选择两条不同间距的sgRNA作为配对sgRNA；所述基因编辑为整码删除时配对sgRNA介导的切割间距为3n碱基对，所述基因编辑为移码突变或基因敲除时配对sgRNA介导的切割间距为3n+1或3n+2碱基对，其中n为0及0以上的整数。

配对Cas9-sgRNA在靶点上的位置是由PAM决定的，Cas9介导的切割发生在PAM的5’端上游第三个核苷酸位置产生平末端，间距即指靶点上配对Cas9-sgRNA切割点之间的距离，因此根据编辑目的选择配对PAM，从而控制间距。根据我们的测试，这个间距控制在12-148碱基对时不会降低精准型NHEJ的效率，适用于在一个通常的外显子内进行特定长度的精准编辑。而PAM基序既可以在Watson链(即W)上，也可以在Crick链(即C)上，所以配对Cas9-sgRNA在靶点上的位置排列可以根据配对PAM的位置组合出四种形式：W/W、W/C、C/W和C/C。由于PAM的广泛性，加上近年来拓展的PAM相容性(比如从NGG拓展到NG、GAA和GAT等)，需要编辑的靶点通常会包含这四种PAM位置的组合，而且每种组合会有多个选择。因此，我们可以比较容易选择其中一种组合来满足特定的基因组编辑需求，优选W/C。

本发明还提供一种所述配对sgRNA在提高CRISPR/Cas9基因编辑效率及精准度中的应用，所述应用的方法按如下步骤操作：根据靶标基因设计多条sgRNA，并根据基因编辑要求选择间距为3n、3n+1或3n+2碱基对的两条sgRNA作为配对sgRNA，构建sgRNA表达质粒，与Cas9表达质粒共同导入细胞进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，DNA电泳测试配对Cas9-sgRNA的工作效率；所述基因编辑为整码删除时配对sgRNA介导的切割间距为3n碱基对，所述基因编辑为移码突变或基因敲除时配对sgRNA介导的切割间距为3n+1或3n+2碱基对，其中n为0及0以上的整数。

进一步，优选所述配对sgRNA在靶标基因或靶标基因组位点上进行移码突变或基因敲除时，位置组合形式为W/C，配对sgRNA间距为3n+1或3n+2碱基对；位置组合形式为W/W、C/W或C/C中的一种，配对sgRNA间距为3n+2碱基对(避免3n+1碱基对；依据是高频发生的1个核苷酸的模板化插入能将3n+1碱基对删除转变为整码删除，而3n+2碱基对删除即使转变为3n+1碱基对删除也仍然是移码突变)。

进一步，优选所述配对sgRNA在靶标基因或靶标基因组位点上进行整码突变或精准整码删除时，配对sgRNA间距为3n碱基对，位置组合形式为W/C。

本发明还提供一种所述配对sgRNA在定量细胞内或动物体内非同源末端连接中的应用，所述非同源末端连接为精准型非同源末端连接或突变型非同源末端连接，所述应用的方法按如下步骤操作：根据靶标基因设计配对sgRNA，构建sgRNA表达质粒，与Cas9表达质粒共同导入细胞进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，DNA电泳测试配对Cas9-sgRNA的工作效率；选择工作效率良好的配对sgRNA，构建对应的sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒，共同导入细胞或组织器官进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，深度测序PCR扩增子分析NHEJ，包括总NHEJ效率(即总编辑效率)、精准型NHEJ和突变型NHEJ的频率及比例、突变型NHEJ接口的增删方向、长度及频率、以及突变型NHEJ接口的微同源序列的利用度等，继而定量细胞内或动物体内NHEJ。

本发明所述基因编辑方法中配对sgRNA的工作效率可以预先测试，帮助选择最适合的配对sgRNA用于基因组编辑。测试方式按如下步骤操作：根据靶标基因设计多条sgRNA，并根据编辑要求选择间距为3n、3n+1或3n+2碱基对、PAM位置组合为W/C或其它组合的两条sgRNA作为配对sgRNA，构建sgRNA表达质粒，与Cas9表达质粒共同导入细胞进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，DNA电泳测试配对Cas9-sgRNA的工作效率。

基因片段删除，包括基因敲除、整码删除(比如编码功能结构域的基因片段整码删除)和删除后的基因片段替换，是CRISPR基因编辑的重要应用。但提高这些应用的效率及精准度面临一些技术问题。目前，CRISPR基因敲除技术主要是利用非精准NHEJ修复产生碱基增删，引起移码突变。但是，我们发现Cas9诱导产生的DSB的NHEJ修复途径主要是精准NHEJ，很显然这种内在的精准NHEJ修复并不利于突变产生，阻碍CRISPR/Cas9介导的基于移码突变的基因敲除。而且，非精准NHEJ修复时理论上有三分之一的概率会产生整码突变，而整码突变可能只影响基因的部分功能，不是完全的基因敲除。在整码删除应用中，不仅精准型NHEJ不利于整码突变，而且非精准NHEJ的整码增删概率理论上只占三分之一，即33.3％的频率，效率低。此外，在基因敲除、整码删除和基因片段替换中由于非精准NHEJ修复产生的碱基增删长短不一，基因编辑产物异质性高，且难以预测和控制，难以满足精准编辑的要求。

因此，为了提高基因片段删除应用的效率及精准度，我们发明了通过操纵配对Cas9-sgRNA在靶点上的间距与方向，高效产生两个临近的DSB，利用高频的精准NHEJ修复，克服模板化插入的干扰，高效产生精准基因编辑产物，实现高效精准的基因编辑，包括基因敲除和整码删除(比如编码功能结构域的基因片段整码删除)。该发明需要解决的具体问题包括：(1)配对sgRNA在靶点上的间距和方向的选择；(2)配对sgRNA引导切割效率的预测；(3)基因敲除效率的提高及敲除产物异质性的降低；(4)内源基因特定片段整码删除(应用包括编码特定结构域基因片段或特定功能基序的精准删除)效率及同质性的提高。由于高效的精准NHEJ修复，我们推测也可以通过驾驭准确NHEJ修复提高精准基因组片段替换(包括基因敲入)的效率。

NHEJ报告系统是定量分析体内体外NHEJ的一个主要方式，但利用报告系统有太多局限，比如测量限制于报告系统位点，难以整合到异染色质上，在动物体中建立NHEJ报告系统的耗时耗力等。而该发明提供一个可替换NHEJ报告系统的体内体外NHEJ分析技术，通过靶点的PCR扩增子二代测序及生信分析，可以区分和定量体内或体外精准型和突变型NHEJ，确定NHEJ修复效率及图谱，更灵活便捷，也很准确，不仅可以用于分析细胞组织器官常染色质NHEJ，也可以分析细胞组织器官异染色质NHEJ。因此，本发明方法还是一种灵活、快速、准确的检测和定量细胞内和动物体内非同源末端连接的方法，所述方法不依赖于传统的报告系统，能区分精准型非同源末端连接和突变型非同源末端连接。

与现有技术相比，本发明配对Cas9-sgRNA基因编辑技术有以下优势：

(1)更高的基因敲除效率及更精准的基因敲除

单个Cas9-sgRNA或传统的多个Cas9-sgRNA诱导的DSB修复要么会使得大部分切割产物恢复到原来状态，要么理论上单等位基因有三分之二的概率读码框被移码破坏。而且，非精准NHEJ连接接口处增删长短不一，增删长度不同，频率也不同，编辑产物异质性高。但是，如果利用本发明配对Cas9-sgRNA编辑技术，可以通过预先设定其在靶点上的间距为非3n碱基对，结合特定的PAM方向(优先选择W/C位置组合)，可以利用高频的精准型NHEJ提高基于移码突变的基因敲除的效率。同时，高频的精准型NHEJ修复提高了特定长度精准删除的编辑产物，同质性提高，便于获得所需基因编辑产物。

(2)高效精准的整码删除编辑

由于技术限制，精准的整码删除编辑应用非常有限，也难以通过传统型的CRISPR基因编辑来实现。然而，利用本发明的基于高频精准型NHEJ的配对Cas9-sgRNA策略，可以精准、有效删除3n碱基对的间距，因此可以用于整码删除特定基因片段的基因编辑，而且编辑同质性高。

(3)高效精准的特定长度基因组片段删除

除了基因敲除和特定基因片段整码删除外，有时也需要精准删除基因组中特定DNA片段，实现特定基因组编辑的目的，而目前的技术难以满足这种编辑对效率及精准度的要求。而通过本发明设定靶点的配对Cas9-sgRNA，配对Cas9-sgRNA技术可以精准、有效删除特定长度的基因组片段，效率高且同质性好。

(4)潜在的精准基因敲入及替换技术

传统基因敲入主要是利用同源序列介导的修复(HDR)方式，以外源同源序列作为模板，将外源信息整合到需要插入或替换的靶点上。但相比于NHEJ，HDR事件在细胞内发生的几率非常低，导致基因敲入或替换的应用受限。而NHEJ途径易错的认识也阻碍利用NHEJ将外源DNA敲入到靶点或替换靶点的尝试及努力。因此，当认识到Cas9诱导的DSB主要是由精准型NHEJ修复时，我们可以利用配对Cas9-sgRNA删除特定序列，然后提供外源DNA片段，通过精准型NHEJ整合到靶点，有效实现基因敲入或替换基因片段的编辑目的。

(5)灵活、简捷、准确的无报告系统的NHEJ分析技术

本发明配对Cas9-sgRNA技术可以用来定量分析细胞和动物体内NHEJ，包括总NHEJ效率(即总编辑效率)、精准型NHEJ和突变型NHEJ的频率及比例、突变型NHEJ接口的增删方向、长度及频率、以及突变型NHEJ接口的微同源序列的利用度等。由于不受报告系统的限制和整合到基因组位点的需求，该技术更灵活、简单、快速，可方便地移植到各种细胞和组织器官中应用，而且准确度也不受影响。还可在临床病人分离的原代细胞中测量分析NHEJ，这对于未来临床评估病人NHEJ修复能力，指导医生放化疗剂量选择具有重大价值。

(四)附图说明

图1：配对Cas9-sgRNA NHEJ分析技术与I-SceI诱导的NHEJ的比较。a.I-SceI和配对Cas9-sgRNA在NHEJ报告系统(sGEJ)上的工作模式图。b.I-SceI和配对Cas9-sgRNA诱导的NHEJ效率比较图。c.I-SceI和配对Cas9-sgRNA诱导的NHEJ四个组类的比例分布图。d.I-SceI和配对Cas9-sgRNA诱导的Group I NHEJ中精准型NHEJ与突变型NHEJ的分布图。

图2：配对Cas9-sgRNA技术在71个内源基因组位点的NHEJ分析。a.配对Cas9-sgRNA诱导的NHEJ产物(基因组编辑)示意图。b.71个位点的总编辑效率、Group I NHEJ效率及精准型NHEJ效率。c.精准型NHEJ效率低的位点常伴随着高频的碱基插入。

图3：71个基因组位点模板化插入对精准型NHEJ效率的影响。a.插入效率与模板化插入效率的关系图。该图显示几乎所有的插入都是模板化插入。b.NHEJ产物中高频的精准型NHEJ及1个核苷酸和2个核苷酸的模板化插入效率图。c.1个核苷酸和2个核苷酸模板化插入效率与精准型NHEJ效率负相关示意图。

图4：配对Cas9-sgRNA的PAM组合对模板化插入产生的影响预测示意图。由此图推测，配对Cas9-sgRNA的W/C PAM组合不会产生模板化插入。

图5：配对Cas9-sgRNA的PAM组合对模板化插入产生的影响。a.配对Cas9-sgRNA的四种PAM组合对模板化插入效率的影响示意图。该图显示W/C组合不产生模板化插入。b.模板化插入对W/W、W/C、C/W和C/C中的精准型NHEJ频率的干扰示意图。该图显示模板化插入的干扰导致W/W、C/W和C/C中的精准型NHEJ频率低于W/C中的精准型NHEJ频率。

图6：配对Cas9-sgRNA间距对精准型NHEJ的影响。a.配对Cas9-sgRNA间距对精准型NHEJ效率的影响示意图。该图显示配对Cas9-sgRNA间距对精准型NHEJ无影响。b.W/W组合的配对Cas9-sgRNA间距对精准型NHEJ效率的影响示意图。该图显示W/W组合的配对Cas9-sgRNA间距对精准型NHEJ无影响。

图7：配对Cas9-sgRNA切割效率测试及高效配对sgRNA的筛选编辑。a.人源AAVS1配对sgRNA设计及靶向示意图。b.人源HBB配对sgRNA设计及靶向示意图。c.人源AAVS1及HBB配对sgRNA效率测试与筛选的DNA电泳分析图。

图8：配对Cas9-sgRNA技术可以提高基于移码突变的基因敲除编辑。a.配对Cas9-sgRNA编辑产物分组示意图。配对Cas9-sgRNA编辑产物可分成“Ideal”理想最佳、“Common”传统策略和“Paired”配对策略三组。GI、GII、GIII和GIV分别代表Group I、II、III及IV。b.精准型NHEJ频率与移码突变效率的相关性分析示意图。改图显示精准型NHEJ频率与移码突变效率正相关。c.1nt模板化插入与移码突变效率的相关性示意图。该图显示1nt模板化插入与“3n+1”碱基对删除而不是“3n+2”碱基对删除的移码突变频率负相关。d.“3n+1”和“3n+2”碱基对删除与移码突变效率的关系图。该图显示基于精准型NHEJ的“3n+2”碱基对删除，而不是“3n+1”碱基对删除，在平均水平上都可提高移码突变频率。

图9：配对Cas9-sgRNA技术可以提高整码突变编辑。a.整码突变策略中配对策略与其它策略的比较图。该图显示配对策略比传统策略更利于提高整码突变效率。b.整码突变效率与精准性NHEJ效率呈正相关的示意图。

图10：配对Cas9-sgRNA NHEJ分析技术的测试。a.XRCC4缺失对总NHEJ效率(基因编辑效率)的影响示意图。LDHA和ROSA26是两个测试靶点。b.XRCC4缺失对NHEJ产物的4组类别的影响示意图。c.XRCC4缺失对精准型NHEJ与突变型NHEJ效率的影响示意图。

图11：XRCC4缺失对NHEJ接口删除长度(a)和微同源序列利用度的(b)的影响示意图。MH：微同源序列(microhomology)。

图12：配对Cas9-sgRNA NHEJ分析技术在小鼠体肝脏上的测试。a、利用流体动力尾静脉注射注入小鼠表达靶向LDHA靶点的配对Cas9-sgRNA的质粒流程图。注射30天后收集肝脏组织，纯化基因组DNA，PCR扩增靶点，深度测序分析同一LDHA靶点的总编辑效率、GroupI-IV NHEJ效率分布和精准型NHEJ和突变型NHEJ(Del、Ins和InDel)的分布。b、编辑效率示意图。c、Group I-IV NHEJ效率分布图。d、精准型NHEJ和突变型NHEJ(Del、Ins和InDel)的分布图。H211、H221、H521和H531分别为四个肝脏组织样本，n指二代测序序列数。N.S：notsignificant。

图13：小鼠体肝脏NHEJ分析。a、小鼠体肝脏NHEJ删除长度图谱示意图。b、NHEJ微同源序列利用度及长度关系图。H211、H221、H521和H531分别为四个肝脏组织样本，n指二代测序序列数。

图14：配对Cas9-sgRNA基因编辑流程图。

图15：配对Cas9-sgRNA技术敲除MDC1基因。a.筛选靶向MDC1的二号外显子上高效配对sgRNA的DNA电泳分析图。b.配对Cas9-sgRNA的精准型NHEJ效率及突变效率分布示意图。c.单克隆筛选结果表。d.验证MDC1敲除结果的Western blotting图。

图16：配对Cas9-sgRNA技术整码精准删除53BP1的编码Tudor和OD结构域的基因片段。

a.验证OD和Tudor结构域的整码精准删除的Sanger测序图。b.验证53BP1蛋白表达未受影响的Western blotting图。c.显示OD和Tudor突变体破坏53BP1招募至DSB位点的焦点形成免疫荧光图。

图17：基于配对Cas9-gRNA NHEJ分析技术的异染色质NHEJ分析。通过测试，选定靶向组成性异染色质靶点Misat和TRPC21的各一对配对sgRNA，将Cas9及配对sgRNA表达质粒转染小鼠胚胎干细胞，在靶点上产生配对DSB，72小时后，收集基因组DNA，PCR扩增含NHEJ修复疤痕的靶点序列，深度测序和分析出各个靶点的NHEJ修复及编辑。a、总编辑效率示意图。b、Group I–IV NHEJ效率分布图。c、精准型NHEJ和突变型NHEJ(Del、Ins和InDel)的分布图。

图18：组成性异染色质靶点Misat和TRPC21的突变型NHEJ接口删除长度图谱示意图(a)及微同源序列利用度与长度的关系示意图(b)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1改良的配对Cas9-sgRNA基因编辑方法

1、基于精准型NHEJ的配对Cas9-sgRNA基因编辑方法的理论体系的建立

近几年利用单个sgRNA引导Cas9的基因编辑技术已经得到广泛应用，特别是基于移码突变的基因敲除。该技术利用非精准NHEJ修复产生增删，其中只有一部分增删(理论上三分之二)会导致单等位基因的移码突变从而敲除其中一个等位基因，但由于增删碱基序列混杂，长短不一，NHEJ产物异质性高，双等位基因同时敲除的效率低下。同时，这一应用还忽略了一个重要问题，即由于Cas9切割产生的DSB的末端是可以直接相连的，NHEJ修复可能主要是精准的，基于移码突变的基因敲除效率会因此降低。单个sgRNA引导Cas9的基因编辑难以区别精准型NHEJ和未遭受断裂的靶点。

为了明确Cas9诱导的NHEJ是否主要是精准型的，我们利用先前构建的基于配对I-SceI切割的NHEJ报告系统(Xie et al，Nature Structural&Molecular Biology，2009，16：814-818)，在报告系统I-SceI的识别位点(见对应71个基因组位点中第56号核苷酸序列)附近根据靶点序列设计配对sgRNA(gsGEJ 2+gsGEJ2a)，该报告系统包含一个GFP基因，在正常的GFP基因的ATG翻译起始位点之前额外添加了一个强翻译起始点“Kozak-ATG”(简称Koz-ATG)，Koz-ATG两边分别带有两个I-SceI的酶切位点(如图1中a)。由于有强翻译起始点“Koz-ATG”，GFP由Koz-ATG启动翻译，此时GFP是移码的，因此细胞为GFP阴性。当细胞内表达外源罕有I-SceI内切酶时，Koz-ATG会被切下，并产生DSB。此时，如果细胞选择NHEJ方式修复DSB，修复好的细胞的GFP将缺失Koz-ATG，翻译将以正常的ATG为起始点，从而合成产生正常的GFP蛋白，细胞变为GFP阳性。相似于I-SceI的切割，由配对sgRNA(gsGEJ 2+gsGEJ2a)引导Cas9在报告系统靶点上造成切口，产生DSB，NHEJ修复将产生四组不同的产物，这些产物在NHEJ修复接口处有下列特征(图1中a)：(1)第一组(Group I)中两个位点同时被切割，导致中间DNA片段被删除，剩余的两个末端通过NHEJ相连。如果相连时两个末端未有额外的碱基增删，即是精准型NHEJ；反之，即是突变型NHEJ。(2)第二组(Group II)中上游切割位点处被编辑而下游靶点未见编辑“痕迹”。(3)第三组(Group III)指下游切割位点处被编辑而上游靶点未见编辑“痕迹”。(4)第四组(Group IV)中两个切割位点都独自被编辑，中间DNA片段没有完全丢失。通过靶点的PCR，扩增子的深度测序及生信分析，可以通过NHEJ接口处DNA序列的特征，不仅可以定量反映总NHEJ效率的总编辑效率(图1中b)，也可以鉴别这四组不同的产物(图1中c)，并测量出第一组中的精准型NHEJ和突变型NHEJ的比例以及突变型NHEJ中的删除(Del)、插入(Ins)及增删(InDel)(图1中d)。

我们将I-SceI表达质粒或是配对sgRNA联合Cas9质粒转染小鼠胚胎干细胞。转染3天后提取细胞的基因组DNA，利用PCR扩增编辑靶位点，并进行深度测序，分析靶点NHEJ接口DNA序列特征。我们发现，I-SceI在报告系统上造成DSB并通过NHEJ进行修复的比例大约在10％，而配对Cas9-sgRNA在报告系统上进行编辑的比例远远高于I-SceI，能达到80％(图1中b)。在报告系统上，配对Cas9同时切割报告系统并将两个DSB直接连接的产物能占所有编辑产物的70％以上(图1中c)。Cas9造成的DSB能通过精准型NHEJ进行修复，其效率占第一组NHEJ的70％以上(图1中d)。

为了进一步确证Cas9-sgRNA诱导的NHEJ主要是精准型的，我们根据通用的sgRNA设计方法(即sgRNA表达质粒构建)，设计任意配对的sgRNA，靶向包括人源和鼠源基因组在内的71个内源性基因组位点，这些配对sgRNA介导的Cas9切割点间距保持在12-148碱基对。联合Cas9质粒，利用通用转染方法转染小鼠胚胎干细胞和人源细胞，配对sgRNA引导Cas9诱导DSB，细胞将启动修复机器将对应的DSB进行NHEJ修复。转染3天后，收集细胞并提取基因组DNA，在靶向编辑位点设计引物，并通过PCR进行扩增。将PCR扩增子深度测序，并分析每个基因组位点NHEJ接口处DNA序列特征，利用每个特征对应的深度测序DNA序列读数计算总编辑效率、Group I、II、III和IV的NHEJ效率、以及Group I中精准型NHEJ和非精准型NHEJ的频率(图2中a)。在71个基因组位点的NHEJ产物中，平均的基因编辑效率约在35.8％，约60％以上产物为Group I NHEJ产物，其中，精准的NHEJ比例约占50％(图2中b)。这个结果表明细胞倾向于利用精准型NHEJ修复Cas9诱导的DSB，而且其效率还相当可观。但是，不同位点的精准型NHEJ效率变化也很大，高的能达到90％以上，而低的位点只有10％左右(图2中b)。通过对这71个内源基因组位点(位点信息具体参见图2中c)各接口处的分析，我们发现，精准型NHEJ效率低的位点通常会在NHEJ接口处出现大量的插入(图2中c)。分析这些插入的序列发现它们大都是1个核苷酸(1nt)的插入，且不是随机的，而是与模板序列一致的，我们称之为模板化插入(templated insertion，TI)(图3中a)。模板化插入的原因是Cas9的RuvC结构域不仅能切割PAM基序前的第三位碱基，产生平末端，也能在第四位甚至是第五位碱基切割，从而产生1-nt或2-nt外伸端的5’粘性末端。这个粘性末端能在聚合酶的作用下被补为平末端，在连接时就会产生碱基插入，而且序列与模板完全一致。我们发现在配对Cas9-sgRNA诱导的NHEJ中1-nt和2-nt的模板化插入的比例还是比较高的(图3中b)。可以推测，模板化插入会降低精准型NHEJ的效率。结果表明，1-nt和2-nt的模板化插入的比例与精准型NHEJ效率呈负相关，模板化插入比例越高，精准型NHEJ效率越低(图3中c)。但是，即使单Cas9-sgRNA产生的单切口可能是5’粘性末端，由于末端是互补的，精准型NHEJ更易发生而防止模板化插入。相反，配对Cas9-sgRNA产生的带5’粘性末端的双切口，两切口的末端通常不互补，因此精准型NHEJ难以进行而模板化插入更易发生。因此，利用配对Cas9-sgRNA策略测出的精准型NHEJ效率低估了真正用于修复Cas9切割产生的DSB的精准型NHEJ效率。

71个基因组位点配对Cas9-sgRNA编辑靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线标记；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)：

(1)人第11条染色体ATM第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ggatcttccagagataggctacagattgcaacccaattaatatcaaagtatcctgcaagtttaCCTaa ctgtgagctgtctccattactgatgatactatctcagcttctaccccaacagcgacatggggaacgtacaccatatgtgttacgatgCCTtacggaagttgcattgtgtcaagacaagaggtcaaacctagaaagctcacaaaagtcagatttattaaaactctggaataaaatttggtgtattacctttcgtggtataagttctgagcaaatacaagctgaaaactttggcttacttggagccataattcagggtagtttagttgaggttgacagagaattctggatcgtcgaacggcag。

(2)人第11条染色体ATM第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gaaataagtgtgattagtaacccattattatttcctttttattttcagaaagaagttgagaaatttaagcgCCTgattcgagatcctgaaacaattaaacatctagatcggcattcagattCCAaacaaggaaaatatttgaattgggatgctgtttttaggtattctattcaaatttattttactgtctttatttttctctttcatatttatttctgttg。

(3)人第11条染色体ATM第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gaaataagtgtgattagtaacccattattatttcctttttattttcagaaagaagttgagaaatttaagcgCCTgattcgagatcctgaaacaattaaacatctagatcggcattcagattccaaacaaggaaaatatttgaat TGGgatgctgtttttaggtattctattcaaatttattttactgtctttatttttctctttcatatttatttctgttg。

(4)人X染色体HPRT第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

atccgcagtgcgggctcgggcggccgggcccagggaaccccgcaggcgggggcggccagtttcccggg ttCGGctttacgtcacgcgagggcggcagggaggaCGGaatggcggggtttggggtgggtccctcctcgggggagccctgggaaaagaggactgcgtgtgggaagagaaggtggaaatggcgttttggttgacatgtgccgcctgcgagcgtgctgcggggaggggccgagggcagattcgggaatgatggcgcggggt。

(5)人X染色体HPRT第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(6)人X染色体HPRT第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(7)人X染色体HPRT第4个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

atccgcagtgcgggctcgggcggccgggcccagggaaccccgcaggcgggggcggccagtttcccggg ttCGGctttacgtcacgcgagggcggcagggaggacggaatggcggggtttggggtgggtccctcctcgggggagc cctgggaaaagAGGactgcgtgtgggaagagaaggtggaaatggcgttttggttgacatgtgccgcctgcgagcgtgctgcggggaggggccgagggcagattcgggaatgatggcgcggggt。

(8)人X染色体HPRT第5个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(9)人X染色体HPRT第6个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

atccgcagtgcgggctcgggcggccgggcccagggaaccccgcaggcgggggcggccagtttcccgggttcggctttacgtcacgcgagggCGGcagggaggacggaatggcggggttTGGggtgggtccctcctcgggggagccctgggaaaagaggactgcgtgtgggaagagaaggtggaaatggcgttttggttgacatgtgccgcctgcgagcgtgctgcggggaggggccgagggcagattcgggaatgatggcgcggggt。

(10)人X染色体HPRT第7个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(11)人X染色体HPRT第8个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

atccgcagtgcgggctcgggcggccgggcccagggaaccccgcaggcgggggcggccagtttcccgggttcggctttacgtcacgcgagggCGGcagggaggacggaatggcggggtttggggtgggtccctcctcgggggagc cctgggaaaagAGGactgcgtgtgggaagagaaggtggaaatggcgttttggttgacatgtgccgcctgcgagcgtgctgcggggaggggccgagggcagattcgggaatgatggcgcggggt。

(12)人X染色体HPRT第9个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(13)人X染色体HPRT第10个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(14)人X染色体HPRT第11个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

actttctattaaattcctgattttatttctgtaggactgaacgtcttgctcgagatgtgatgaAGGagatgggaggccatcacattgtagcCCTctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgacctgctggattacatcaaagcactgaatagaaatagtgatagatccattcctatgactgtagattttatcagactgaagagctattgtgtgagtatatttaatatatgattctttttagtggca。

(15)人X染色体HPRT第12个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

actttctattaaattcctgattttatttctgtaggactgaacgtcttgctcgagatgtgatgaaggagatgggaggccatcacattgtagccctctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgaCCTgctggattaca tcaaagcactgaatagaaatagtgatagatCCAttcctatgactgtagattttatcagactgaagagctattgtgtgagtatatttaatatatgattctttttagtggca。

(16)人第17条染色体p53第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

cacccatctacagtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccCCGgacgatattg aacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgTGGcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagct。

(17)人第17条染色体p53第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)cacccatctacagtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccAGGtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgTGGcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagct。

(18)人第17条染色体p53第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

cacccatctacagtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccAGGtccagatgaagctcccagaatgCCAgaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagct。

(19)鼠源第2条染色体53BP1配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)ttccattccaggggagcagatggaccctactggaagtcaattggattcagatttctctcagcaagacactccttgcctgataatagaagattctcagcctgaaagcc aggttctggaagaagatgcAGGctctcacttcagcgtgctatctcgacaCCTtcctaatctgcagatgcacaaagagaaccccgtgttggtgagtgagtgatgatgccctgttcaag。

(20)鼠源第2条染色体Artemis配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)tgtgcttctgtttccgaggtgggctttgggtctagtgttcccgggtgcgatgagctccttccagggacagatggCGGagtatccaaccatctccattgaccgctt cgacAGGgagaacctgaaagcccgtgcctacttcctttcgca。

(21)鼠源第9条染色体ATM配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

taggttgatcccacaggagagtatgaaaatctggtgactataaaatcatttaaaacagaatttcgctt agctggAGGcttaaatttacccaaaataatagattgtgtgggttctgatggcaAGGaaaggagacagcttgtgaaggtaagacttcctgtttctggtatagtcttcagaggattaatgccatcaacatcaacagcaggatatttaattcttacctcatttggttgtctggat。

(22)鼠源第9条染色体ATR配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gcaagaatcctgctatttttggggtactcacaagagaattactttatctttttgaagacttaatttacctccacaaaagaaatgcagtgggtgaggttatggaaTGGccagtggttgttagtcggtttttaagccgattggatg aacataTGGgatgtttacagccagctcctttgcagttcatgaacgtgcaaa。

(23)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggaCCTggcattaccctgttatccctagaattctgcagtcgacggtaCCGcgggcccgggatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg。

(24)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggaCCTggcattaccctgttatccctagaattct gcagtcgacggtaccgcGGGcccgggatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg。

(25)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(26)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第4个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcat ccTGGgatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggacctggcattaccctgttatccctagaattctgcagtcgaCGGtaccgcgggcccgggatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttca。

(27)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第5个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcat ccTGGgatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggacctggcattaccctgttatccctagaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccGG Gatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttca。

(28)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第6个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(29)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第7个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(30)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第8个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(31)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第9个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(32)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第10个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(33)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第11个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagtT GGgattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggacctggcattaccctgttatccctagaattct gcagtcgaCGGtaccgcgggcccgggatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg。

(34)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的BGN报告系统上第12个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagtT GGgattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcggacctggcattaccctgttatccctagaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccGGGatccatcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg。

(35)鼠源第11条染色体Cola1第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccactgattgacacgttgattgggtaaaacctttcttcccaggcatcaCCAgtcttgggactcttcct ggctagaccctatctcctcccatcctcacagggtccatccttctgaactcagcatCCGagctgtacctggccactg ctcgcttgtctgaacttactgtctcctccacgagcccccatctgtcataccagacaaagggtgtgact。

(36)鼠源第11条染色体Cola1第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(37)鼠源第11条染色体Cola1第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccactgattgacacgttgattgggtaaaacctttcttcccaggcatcaccagtcttgggactcttccT GGctagaccctatctcctcccatcctcacagggtccatccttctgaactcagcatCCGagctgtacctggccactg ctcgcttgtctgaacttactgtctcctccacgagcccccatctgtcataccagacaaagggtgtgac。

(38)鼠源第11条染色体Cola1第4个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccactgattgacacgttgattgggtaaaacctttcttcccaggcatcaccagtctTGGgactcttcctggctagaccctatctcctcccatcctcacagggtccatccttctgaactcagcatCCGagctgtacctggccactg ctcgcttgtctgaacttactgtctcctccacgagcccccatctgtcataccagacaaagggtgtgact。

(39)鼠源第11条染色体Cola1第5个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(40)鼠源第11条染色体Cola1第6个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccactgattgacacgttgattgggtaaaacctttcttcccaggcatcaCCAgtcttgggactcttcct ggctagaccctatctcctcccatcctcacagggtccatccttctgaactcagcatccgagctgtaccTGGccactgctcgcttgtctgaacttactgtctcctccacgagcccccatctgtcataccagacaaagggtgtgact。

(41)鼠源第1条染色体Ku80配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

acaccgtcttaaacatgttctctccctttatcctttttacgtagcaggacagggacccacttcagaaactttgctaatagcgtcttttttcttgtgtacttttggggcctttgtttctaggcagctgttgtgctgtgtgtggat gtgggggttgccaTGGgtaactcctttCCTggtgaagaatctccaattgaacaagcaaagaaagtgatgactatgtttgtccaacgacaggtaagtttcagattaaccttgagcttgtgacacacac。

(42)鼠源第4条染色体LDHA配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccactgagccatctatctctccaccccaattttgtttttcttaagctttgttaatcttcacactataaacagaaggctaagatgaaagcatcaccaagtgcaggcaAGGttgttgccagtggcttcttagactctgccctttgt aatatgctaacaccttggtGGGggcagaaggtggtacctcctccttggaaaatggcttacagctgaaaactgccacatgggtgttct。

(43)鼠源第2条染色体MCM8配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

aggagtgctcttgacttgtggaagacatgagtggtgcttatagaggcagaggttttggacgAGGaagattccaaagctggaaaagaggaagaggtggtgggaacttctcaggaaggTGGagagaaagagaaaacagagttgacctgaatgaagcttcaggaaagcacgcttctggtacgtgcacgcagggatcgatatgttttctctcgggaaagagacaattcaagggccggtagatgccagagtag。

(44)鼠源第17条染色体MDC1上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

cacttgggaagcagaggcaaggggatctctgagtttgaggccagcctggtctgattatgtgtttcctttacagatcatggaaagcaCCCaggtgattgactgggatgctgaagaagaggaagagacagaactatccagtggctccttggggtatagtgtggagCCTatagggcagctacgtctcttcagtggaactcatggaccagaaagaggtcaggagatattgggaactaaagtatgattgtgggtctttcttagaagaagttggaagttggaggg。

(45)鼠源第17条染色体MDC1上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ggaaatcatcacctcatggttgttcacatctttaatcccagcacttgggaagcagaggcaaggggatctctgagtttgaggccagcctggtctgattatgtgtttcctttacagatcatggaaagcaCCCaggtgattgactgg gatgctgaagaagaggaagagacagaactatccagtggctccttGGGgtatagtgtggagcctatagggcagctacgtctcttcagtggaactcatggaccagaaagaggtcaggagatattgggaactaaagtatgattgtgggtctttcttagaagaagttggaagttggagggttggtagaaccatttat。

(46)鼠源第17条染色体MDC1上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

cacttgggaagcagaggcaaggggatctctgagtttgaggccagcctggtctgattatgtgtttcctttacagatcatggaaagcaCCCaggtgattgactgggatgctgaagaagaggaagagacagaactatccagtggctc cttggggtatagtgTGGagcctatagggcagctacgtctcttcagtggaactcatggaccagaaagaggtcaggagatattgggaactaaagtatgattgtgggtctttcttagaagaagttggaagttggaggg。

(47)鼠源第17条染色体MDC1上第4个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(48)鼠源第17条染色体MDC1上第5个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(49)鼠源第4条染色体NBS1上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gagaatgtgctcagaaccctcactgcagctggcgcttcgctttttaaagtgcttcctcccatttccagcacaagaaactcagctcggcagttgctttcggaggtggagaagCCAggctgatggcagaagacgacgaagaggaacagagcttcttttcagctcccggaaCCTgcgttgttgatgtaggaataacgaatacacagctcataatttcacactcccagaaaaaatggattcatttgataatggatacacttcaaaggtacataattctttcttcacaaattaaaaatgcaagtagcttttacatgcaactcagttaataccaaagagtctacaagggcttgtca。

(50)鼠源第4条染色体NBS1上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gtcctgtatcatgaatgcgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaccttacattcatttacttctgttttccctcaggagaaccataccgacttttggccggcgtggagtacgttgtTGGgaggaaaaactgtggcattctgattgaaaatgatcagtcaatcagtcgaaaCCAtgctgtcttaacagtaaacttccctgtaaccagtttggtatgctgctaactttattttactatctctttttgtttgctttaagatttatttatttattttatgcatatgagtgttgtatctgcatggacacc。

(51)鼠源第9条染色体PIF1配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

caccggagatgccttctagcacagaggcggcgaccgatgaatgtgacgatgcggagctccggtgccgggtagccgtggaggagctgagtCCTggagggcaacctcgcaagcgccaggccctgcgcgCCGcagagctgagcctag gtcgaaacgaacgacgtgagttaatgctgcgactgcaggcaccgttt。

(52)鼠源第16条染色体POLQ上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

actgtgtcgtgtcctgaacagtcgagaggagcttgtttgcaatgagtcttccgcgccggagtaggaaacggcggcgttcatcgtccggctCCGacacgttctcgggagatggtgatagctttgttagccctcagctccggtgtggaCCGgtgctgagtccacctccggggctgggacgcggccggaggctcacagggacaggtactcgacccgcggggccgacgcggccgagggcagcaggggttgagatgggctgcgagagt。

(53)鼠源第6条染色体Rosa26上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgggcgaaaaatgagttgctggtgaagacgttacacaagtaacatgagaaagcagaaaatgcaggtca tccacgcacccctgacccAGGccagcagggcgggctgcagcatcagtacacAGGagaaagatccttattcctaagaatgagaaaggcaaaggcgcccgatagaataaattagcatagaaggggctttcccaggagttaaaactttccttctgagcgattacctactaaaaccag。

(54)鼠源第6条染色体Rosa26上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

AaagagcccagtacttcatatccatttctcccgctccttctgcagccttatcaaaaggtattttagaacactcattttagccccattttcatttattatactggcttatccaacccctagacagagcatTGG………..agca ctctggaggcagagacAGGcagatctctgagtttgagcccagcctggtctacacatcaagttctatctaggatagccaggaatacacacagaaaccctgttggggaggggggctctgagatttcataaaattataattgaagcattccctaatgagcc。

(55)鼠源第6条染色体Rosa26上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

atgagttgctggtgaagacgttacacaagtaacatgagaaagcagaaaatgcaggtcatccacgcacccctgacccaggCCAgcagggcgggctgcagcatcagtacacaggagaaagatccttattcctaagaatgagaaagg caaAGGcgcccgatagaataaattagcatagaaggggctttcccaggagttaaaactttccttctgagcgattacctactaaaaccagggcttttgcccactaccatttacctaggatcttggcttgcacggattc。

(56)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的sGEJ报告系统上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctg cagcccaagctctagcCGGactcagatctcgagctcaagcttcgaattcattaccctgttatccctaaccgccgccaccatggattaccctgttatccctAGGatccatccttcacatgatcagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccacccttacgtacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggag。

(57)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的sGEJ报告系统上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(58)小鼠胚胎干细胞中单一拷贝的sGEJ报告系统上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

caccgcatctccgggcctttcgacctgcagcccaagctctagCCGgactcagatctcgagctcaagcttcgaattcattaccctgttatccctaaccgccgccaccatggattaccctgttatccctAGGatccatccttcacatgatcagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgttt。

(59)鼠源第6条染色体Rad52上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgggaagagatgctggatctgggagctcagagacggcttcactgtgcaaaaatggcatacataccaatttgagttccttctgcattatagagccagtatacagcggatgaataccaggCCAtccagaaagctctgagacagagactgggtccagagtacattagcagccgcatggcTGGaggaggtcagaaggtaagcctccggagtcgtgggcatgtatctagttgttgacagaagatcctgc。

(60)鼠源第6条染色体Rad52上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(61)鼠源第6条染色体Rad52上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(62)鼠源第16条染色体POLQ上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(63)鼠源第16条染色体POLQ上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(64)人源第19条染色体AAVS1上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccct ccaccccacagtGGGgccactagggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttCCTagtc tcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatg。

(65)人源第19条染色体AAVS1上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

tgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacaggatTGGtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttCCTagtc tcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatg。

(66)人源第11条染色体HBB上第1个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gggtgggaaaatagaccaataggcagagagagtcagtgcctatcagaaacccaagagtcttctctgtctccacatgcccagtttctattggtctccttaaaCCTgtcttgtaaccttgataccaacctgcccagggcctcaccaccaacttcatccacgttcaccttgccccacaGGGcagtaacggcagacttctcctcaggagtcagatgcaccatggtgtctgtttgaggttgctagtgaacacagttgtgtcagaagcaaatgtaagcaatagatggctctg。

(67)人源第11条染色体HBB上第2个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

gggtgggaaaatagaccaataggcagagagagtcagtgcctatcagaaacccaagagtcttctctgtctccacatgcccagtttctattggtctccttaaaCCTgtcttgtaaccttgataccaacctgcccagggcctcaccaccaacttcatccacgttcaccttgccccacagggcagtaacggcagacttctCCTcaggagtcagatgcaccatggtgtctgtttgaggttgctagtgaacacagttgtgtcagaagcaaatgtaagcaatagatggctctt。

(68)人源第11条染色体HBB上第3个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(69)人源第11条染色体HBB上第4个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(70)人源第11条染色体HBB上第5个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

(71)人源第11条染色体HBB上第6个位点配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

sgRNA表达质粒构建：

1)sgRNA序列设计与合成：在靶点基因序列中寻找到目标PAM结构(5’-NGG-3’)后，设计19bp或20bp长度的sgRNA，按照以下示例进行单链合成并经退火体系形成双链结构备用。如果sgRNA起始第一个碱基为A、C、T，那么除去与BbsI切口末端互补的结构外总体sgRNA长度为20bp，适用如下示例(N代表靶点基因组DNA的碱基组成)：

5’-CACCG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’oligo1

3’-C NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5’oligo2

如果sgRNA起始第一个碱基为G，那么除去与BbsI切口末端互补的结构外总体sgRNA长度为19bp，适用如下示例(N代表靶点基因组DNA的碱基组成)：

5’-CACCG NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’oligo1

3’-C NNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5’oligo2

2)用BbsI酶将px330-U6-gRNA质粒进行酶切，通过DNA胶鉴定后割胶回收线性DNA备用，体外酶切体系如下：质粒DNA0.5μg、核酸内切酶BbsI 1μL、10X缓冲液2μL、双蒸水补充至总体积20μL。

37℃酶切过夜。

3)将步骤1)退火产物和步骤2)线性DNA进行连接构成重组质粒，重组质粒连接体系如下：线性DNA 20nM、插入片段(即退火产物)<100nM、10X缓冲液2μL、T4连接酶1μL、双蒸水补充至总体积20μL。

4℃过夜。连接产物进行转化，挑取单克隆，进行Sanger测序，确定sgRNA已经成功装进表达载体中。

细胞株转染实验：

生长良好的小鼠胚胎干细胞通过悬浮转染，孔板需要预先用明胶处理，在5分钟内将A液与B液充分混合，室温孵育20分钟，即为转染液。之后先将转染液(体积见下)加入到细胞培养皿中，然后再加入200μL细胞悬液；室温放置6小时后添加小鼠胚胎干细胞培养基至1mL；37℃培养24小时后更换新鲜培养基。在本实验中，sgRNA文库细胞水平编辑效率验证在6孔板中进行，转染方案如下：

NIH-3T3细胞和U2OS细胞进行贴壁转染，转染前一天，将细胞按照1*10⁵个/孔进行铺板，第二天再进行转染，方案如下(以24孔板一个孔为例)：

总DNA量 0.8μg

A液Opti-MEM 50μL+Lipofectamine 2000 1.5μL

B液Opti-MEM 50μL+DNA 0.8μg

在5分钟内将A液与B液充分混合，室温孵育20分钟，即为转染液；转染前，更换新鲜的小鼠胚胎干细胞培养基，300μL/孔，之后将102.3μL转染液加入到细胞培养皿中，37℃培养24小时后更换新鲜培养基。

2、配对sgRNA在靶点上的方向和间距的选择及设计

模板化插入会降低精准型NHEJ的效率，我们需要优化配对Cas9-sgRNA系统来减少模板化插入的发生。根据领域中已报道的工作，模板化插入是由Cas9诱导的5’-粘性末端补平后产生(图4)，我们推测可以通过控制配对Cas9-sgRNA的位置来降低模板化插入。由于配对Cas9-sgRNA在靶点上的位置是由PAM决定的，而DNA双链靶点上的这些PAM结构(比如对应化脓链球菌SpCas9的PAM 5’-NGG-3’)既可以在Watson链(即W)上，也可以在Crick链(即C)上，所以配对Cas9-sgRNA在靶点上的位置排列可以组合出四种形式：W/W、W/C、C/W和C/C。Cas9蛋白既产生平末端，但也可以产生5’外伸端。如果两个平末端进行连接时，这就是预想中的精准型NHEJ。但是如果有5’外伸端，在修复过程中可能会被DNA聚合酶补平，这时，根据分析、推断，只有W/C组合不产生额外的模板化插入，而其它三种组合都会(图4)。71个靶点的数据分析验证了这个推测(图5中a)。同时，由于W/C基本不产生模板化插入，精准型NHEJ效率也高于W/W、C/W和C/C组合(图5中b)。这一结果提示在使用配对Cas9-sgRNA技术时，尽可能选择“W/C”型的PAM组合以期获得更高比例的精准型NHEJ修复事件。但需要注意的是，有的位点即使利用非“W/C”组合，但由于Cas9在该位点可能不常产生5’粘性末端，模板化插入频率低，并不太影响精准型NHEJ效率(图5)，因此可以选择用于后续的基于精准型NHEJ的基因编辑。

配对Cas9-sgRNA基因编辑，特别是特定基因组片段的精准删除，需要考虑配对Cas9-sgRNA在靶点上的间距。配对Cas9-sgRNA介导的基因组长片段(大于1Kb)删除先前已有应用，比如删除编码LncRNA的基因及某些基因的整个外显子。这些应用中精准型NHEJ也有发生，但频率不清楚。不过，有研究表明两个DSB之间的间距越长，Group I NHEJ的修复效率及精准型NHEJ修复效率越差。为了在CRISPR/Cas9基因编辑中充分利用精准型NHEJ，我们在71个基因组位点上设计配对Cas9-sgRNA的间距在12-148碱基对之间(除了第54位点的大于1000碱基对)，分析这71个位点的间距改变发现与精准型NHEJ效率的变化无相关性(图6中a)，表明配对Cas9-sgRNA的间距并不影响精准型NHEJ效率。为了排除配对Cas9-sgRNA的PAM位置组合的干扰，我们又分析了在相同的W/W组合下靶点NHEJ变化的测序数据，也没有发现配对Cas9-sgRNA的间距对精准型NHEJ效率有明显的影响(图6中b)。而且，这个短的间距适合在绝大部分外显子内操作，可以克服外显子长度限制。

3、配对Cas9-sgRNA基因编辑效率的测试

根据编辑目的，按照上述2中配对sgRNA在靶点上的方向和间距的选择及设计原则，设计配对sgRNA。以人源AAVS1(腺相关病毒整合位点1)所示位点(图7中a)和HBB(β-珠蛋白基因)所示位点(图7中b)为例，我们首先利用通用的sgRNA设计方法，设计了各5个sgRNA(针对AAVS1的ghAAVS1-1、ghAAVS1-2、ghAAVS1-3、ghAAVS1-4和ghAAVS1-5；针对HBB的ghHBB-1、ghHBB-2、ghHBB-3、ghHBB-4和ghHBB-5)，配成6对，针对AAVS1或HBB的是1-3(即ghAAVS1-1配对ghAAVS1-3或ghHBB-1配对ghHBB-3，下同)、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5，构建sgRNA的表达载体。为了测试配对sgRNA的基因编辑效率(仍以人源AAVS1位点和HBB位点为例)，我们利用通用的转染方法，联合Cas9表达质粒，将配对sgRNA表达质粒转染HEK293细胞(或靶细胞，或以小鼠胚胎干细胞代表鼠源细胞、HEK293细胞代表人源细胞)，转染72-96小时后，收集基因组DNA，PCR扩增靶序列，DNA胶电泳分析PCR产物。作为空白对照的WT组转染的是Cas9表达质粒及配对sgRNA的空载对照，因此靶点上应该无编辑发生。配对Cas9-sgRNA基因编辑效率主要取决于配对Cas9-sgRNA在靶点的切割效率。如果Cas9-sgRNA切割效率高，间隔序列会被删除，在DNA电泳胶中产生明显的两条带，一条主要是相似于WT的未编辑的，另一条主要是间隔序列被删除的低于WT的DNA带(图7中c)。很明显，最有效的AAVS1配对sgRNA是ghAAVS1/ghAAVS4(W/C,66bp)和ghAAVS2/ghAAVS4(W/C,46bp)，其次是ghAAVS1/ghAAVS5(W/W,113bp)和ghAAVS2/ghAAVS5(W/W,93bp)，而基本无效的是ghAAVS1/ghAAVS3(W/W,74bp)和ghAAVS2/ghAAVS3(W/W,54bp)。HBB配对sgRNA基本都有效，但无W/C组合。我们可以在有效的配对sgRNA中按需求选择一对进行后续的靶点基因编辑，比如，我们可以选择配对ghAAVS1/ghAAVS4对内源AAVS1进行整码精准删除，选择配对ghAAVS2/ghAAVS4对AAVS1进行删除3n+1-bp的移码突变。

4、基因敲除效率及精准删除同质性的提高

为了明确配对Cas9-sgRNA技术在基因敲除中是否比常用的CRISPR/Cas9方案更有效，利用我们开发的生信分析软件(Feng et al，Nucleic Acids Research，2017，45：10614-10633)重新分析配对Cas9-sgRNA在上述71个基因组位点产生的四种NHEJ产物(即Group I、II、III和IV产物)深度测序数据，比较这些产物对移码突变效率的影响。在配对Cas9-sgRNA策略(“Paired”)中可以分成理想最佳化的配对Cas9-sgRNA技术(“Ideal”)和传统型的基因编辑技术(“Common”)。理想最佳“Ideal”技术就只产生Group I修复，而“Common”传统策略没有Group I事件，只包括Group II、III和IV NHEJ事件的总和(图8中a)。利用配对Cas9-sgRNA技术(即“Paired”策略)，通过设定配对Cas9-sgRNA间隔序列的长度，精准型NHEJ可以精准删除3n(整码)、3n+1(移码)和3n+2(移码)的碱基对(图8中a)，n代表0或大于0的整数。之前71个基因组位点上，有50个位点设计为移码突变(3n+1或3n+2移码)，因此我们对这50个位点的深度测序结果进行分析，将每个位点的NHEJ产物进行“Paired”配对策略、“Ideal”理想最佳策略和“Common”传统策略分类，计算出每一类中3n+1和3n+2产物的比例。我们发现，相比“Common”传统策略而言，一旦精准型NHEJ频率超过29.8％，“Paired”配对策略可以提高基因敲除(移码突变)效率，精准型NHEJ频率越高，移码突变频率提高的越高，但会低于“Ideal”(图8中b)。不过，由于高频的+1nt模板化插入，间隔序列3n+1的碱基对会因为+1nt模板化插入而转变成3n碱基对的整码删除，影响基因敲除(移码)效率，甚至当+1nt模板化插入超过20.5％时，间隔3n+1碱基对反而降低了移码突变效率(与“Common”传统策略比较)，而间隔3n+2碱基对的影响不大(图8中c)。总体而言，间隔3n+2碱基对改良基因移码突变的基因敲除效率，而间隔3n+1碱基对的效果较差(图8中d)。因此，间隔序列最好设计为3n+2的碱基对。可以预见，因为配对Cas9-sgRNA策略中总体精准NHEJ可以达到50％，特定长度删除的基因敲除产物将增加，基因敲除的同质性于是也将提高。

5、内源基因特定片段整码删除(应用包括编码特定结构域基因片段或特定功能基序的精准删除)效率及同质性的提高

CRISPR基因编辑应用中有时需要整码删除特定基因片段而不影响基因其他片段的功能，比如，为研究特定结构域的功能而整码删除该结构域的编码区。但是，由于技术限制，这个应用非常有限，也难以通过传统型基因编辑来实现。然而，由于配对Cas9-sgRNA策略可以有效删除3n碱基对的间距，可以用来整码删除特定基因片段。在上述测试的71个基因组位点上，有20个位点设计为整码删除(3n)。我们在配对Cas9-sgRNA表达质粒转染细胞、编辑靶点及PCR扩增子深度测序后，在分析50个移码突变的同时，对这20个整码删除突变位点的深度测序结果利用前述生信软件(Feng et al，Nucleic Acids Research，2017，45：10614-10633)重新进行分析，将每个位点的NHEJ产物进行“Paired”配对策略、“Ideal”理想最佳策略和“Common”传统策略分类，计算出3n产物的比例。我们的数据显示，与“Common”传统策略相比，“Paired”配对策略是可以提高整码基因组片段删除效率，平均可以从30％提高到约50％(图9中a)。精准型NHEJ频率越高，“Paired”配对策略提高的整码突变的水平越高，最高可提高2倍，从约33％提高到66％，但总体而言低于“Ideal”(图9中b)。特别是，“Common”传统策略的整码删除的长短不一，异质性强，而“Paired”配对策略由于精准型NHEJ修复会有效整码删除特定长度的DNA片段，因此同质性高。因此，配对Cas9-sgRNA策略提供了一个高效的整码删除特定基因片段的基因编辑技术。

6、细胞水平和动物水平上基于配对Cas9-sgRNA技术的NHEJ的定量分析

为了在细胞中直接、快速、准确地定量NHEJ，通常需要NHEJ报告系统。这个研究方法已帮助我们揭示了诸多NHEJ的机制和调节。但是，报告系统毕竟是一个人为的系统，有固定的DNA序列，需要整合到基因组(而且最好是单备份整合以防止多备份DNA断裂的干扰)，这限定了报告系统的应用。而配对Cas9-sgRNA技术可以克服报告系统的限制，在任意选定的染色体区域，比如小鼠细胞中乳酸脱氢酶A LDHA内含子5位点(AGCATCACCAAGTGCAGGCA和TAATATGCTAACACCTTGGT)和ROSA26位点(CATCCACGCACCCCTGACCC和GGGCTGCAGCATCAGTACAC)，设计Cas9对应的配对sgRNA(sgRNA靶点间隔23-148碱基对)，将配对sgRNA联合Cas9表达质粒转染小鼠胚胎干细胞，3天后收集细胞基因组DNA，利用PCR扩增NHEJ修复位点，对PCR扩增产物进行深度测序，利用前述的生信分析方法定量分析NHEJ，基于分析结果构建这两个靶点的NHEJ修复图谱，包括总NHEJ效率(即总编辑效率)、精准型NHEJ和突变型NHEJ的频率及比例、突变型NHEJ接口的增删方向、长度及频率、以及突变型NHEJ接口的微同源序列的利用度等。为了验证这个无报告系统的NHEJ分析方式，我们通过这个方法比较了XRCC4^+/+小鼠胚胎干细胞和XRCC4^–/–小鼠胚胎干细胞的NHEJ。结果显示，与已知的XRCC4的NHEJ功能一致，在LDHA和ROSA26两个位点上，XRCC4缺失导致总NHEJ效率明显下降(图10中a)。XRCC4的缺失也引起Group I NHEJ修复频率降低(图10中b)，这可能是因为精准NHEJ效率降低而导致配对Cas9-sgRNA的“再切割-再修复”循环停止，同时删除间隔序列的概率下降。残留的Group I NHEJ中突变型NHEJ比例大大提高而精准型NHEJ比例低(图10中c)。在有XRCC4时，LDHA位点NHEJ接口处58-63bp删除频率(30.05％)明显高于XRCC4缺失时(6.62％)(χ²test:P<0.0001)，但删除长度大于63bp时，XRCC4野生型细胞中的发生频率(69.95％)要低于XRCC4缺失细胞(93.38％)(χ²test:P<0.0001)。在ROSA26位点上，有XRCC4时，接口处34-39bp删除频率(41.45％)明显高于XRCC4缺失时(11.31％)(χ²test:P<0.0001)，但删除长度大于39bp时，XRCC4野生型细胞中的发生频率(58.55％)要低于XRCC4缺失细胞(88.69％)(χ²test:P<0.0001)(图11中a)。在XRCC4缺失时，在NHEJ接口处删除长度明显加长(图11中a)。这提示XRCC4推动精准型NHEJ。此外，XRCC4^–/–小鼠胚胎干细胞中微同源序列利用度提高(图11中b)，而且XRCC4缺失后，细胞更倾向于使用较长的微同源序列片段。这些结果显示XRCC4抑制NHEJ中的末端加工的发生及微同源序列的依赖性，这与XRCC4已知的NHEJ功能一致。因此，可以利用配对Cas9-sgRNA技术替代报告系统定量分析细胞内NHEJ。

由于配对Cas9-sgRNA技术不受限于报告系统及报告系统整合的基因组位点，可以用于定量分析活体器官特异性的NHEJ。为了评估这种可能性，我们利用流体动力尾静脉注射。注射的条件为200μg的Cas9表达质粒，各150μg的配对sgRNA(小鼠LDHA位点的配对sgRNA)表达质粒，溶解在1.8mL的生理盐水中，注射时间控制在10秒钟以内。将靶向LDHA第5内含子位点的配对Cas9-sgRNA表达质粒注入6-8周龄C57BL/6小鼠(上海南模)肝脏(图12中a)，进入肝脏细胞的质粒表达针对LDHA内含子位点的配对Cas9-sgRNA，在小鼠肝脏细胞中定点诱导DSB，30天后处死小鼠，从两只小鼠肝脏中各收集两块肝脏组织，从中分离纯化基因组DNA，PCR扩增NHEJ修复靶点，二代测序，生信分析靶点DSB的NHEJ修复。测量的NHEJ包括配对Cas9-sgRNA靶点总编辑效率(图12中b)、Group I-IV在编辑效率中的分布(图12中c)、精准型NHEJ和突变型NHEJ(即Del、Ins和InDel)的频率(图12中d)、Group I突变型NHEJ接口的删除长度及频率(图13中a)以及Group I NHEJ接口的微同源序列利用度(图13中b)。在小鼠肝脏中，总编辑效率大约在1％-4％，相比于细胞水平编辑效率要低很多(图12中b)。Group I的产生频率在4块肝脏组织中比例非常接近，大约在80％左右，而精准NHEJ的比例在50％左右(图12中c和12中d)。在肝脏组织中，接口位点处的碱基删除图谱非常一致(图13中a)，而且利用微同源序列的特性也几乎相同(图13中b)。这些结果显示可以利用配对Cas9-sgRNA技术定量分析动物活体内组织器官特异性的NHEJ。

基于实施例1中的结果、描述与说明，我们将该发明的实验流程总结于图14，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例2：敲除MDC1基因

为了利用配对Cas9-sgRNA技术敲除小鼠MDC1(基因ID:240087)基因，我们在MDC1基因的第2号外显子上设计了三对sgRNA(mMDC1-1：ACAGATCATGGAAAGCACCC；mMDC1-2：AGCATCCCAGTCAATCACCT；mMDC1-3：AACTATCCAGTGGCTCCTT)，将单个sgRNA和配对sgRNA分别转染小鼠胚胎干细胞，3天后利用PCR扩增和DNA电泳分析发现配对sgRNA2/sgRNA3(C/W，52bp)的编辑效率高(图15中a)，深度测序也显示精准连接的效率约50％，模板化插入频率约5％(图15中b)。因此，我们选择该对sgRNA引导Cas9进行MDC1基因敲除，从配对Cas9-sgRNA编辑的细胞中挑选单克隆细胞株。具体地，将选定的配对Cas9-sgRNA表达质粒转染小鼠胚胎干细胞，转染的细胞24小时后稀释，接种到MEF(mouse embryonic fibroblast)滋养层上，5-6天后形成单克隆细胞。挑取单克隆细胞，消化后接种至事先铺有MEF的96孔板，待细胞增殖到足够量后，传代至24孔板。将长满的24孔板中细胞收集，留下一小部分继续培养。收集细胞提取基因组DNA，并进行PCR初筛。经一代测序检测，发现35个单克隆中有18个克隆只编辑了1个等位基因，8个克隆中两个等位基因通过精准型NHEJ连接而被敲除，4个克隆中两个等位基因都被敲除，但至少有一个等位基因是通过非精准型NHEJ连接实现的，5个克隆含整码突变(图15中c)。这说明配对Cas9-sgRNA编辑策略能够高效地产生同质的敲除产物(即35个克隆中有8个精准敲除纯合子)。通过Western blotting技术确定MDC1基因的确被敲除了(图15中d)。

小鼠第2条染色体minor satellite(Misat)配对Cas9-sgRNA编辑靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

cttaccatattcctcaaggtttccggggctagagaaagtttgctggtggtagacgaagccgactgcatggtagctgggtctcagttgtttgtggcctccttagtagacagatggacaTGGtttgaattttttatattaagaaaaggattgggctacaaatagagctcagtcaatagactgcttgcccagCCTgtgtgcagccctgggtcaagcatatgcatcccattatcctggcctcgtggctcttcttatagacccagcactgaataggtagaagctgtatattac。

小鼠第3条染色体TRPC21A配对Cas9-sgRNA靶点核苷酸序列及配对sgRNA靶点位置(下划线；–NGG PAM或其互补序列以大写字母标记)

ccacagtgcagcacagttatagtaaagtggaacacttggacagcaaaatggagcactgtgacatcacaatggagcactgtgacaccatagtgcagcacagtggcagcacaGGGgactagtgtgacattacaatggagcactgtg agaccttagTGGagcaaatgacaccacagtgagcactatgacacaaaatttgagccctgagacactttagtggagcactgtgatatcacattg。

实施例3：精准整码删除编码53BP1结构域基因片段

配对sgRNA技术可以控制切除片段长度，可以用于精准整码切除，这样可以在不产生移码突变的前提下实现对特定基因片段进行功能研究，特别是针对一些编码致死基因结构域片段的研究。为了验证这一应用，我们选择53BP1基因(基因ID:27223)作为研究对象，针对53BP1关键的结构域Tudor和OD，这两个区域是53BP1蛋白招募至DSB损伤位点必需的(图16中a)。我们针对这两个结构域分别设计了配对sgRNA(Tudor结构域：GGGAAGATCACCCGAGATGT和GGGTACGAATGTGACGTGCT；OD结构域：GAGTGTACGGACTTCTCGAA和TTATGTGGATGGGACAGAAG)，而这两组配对sgRNA间被切除的DNA片段长度均为3n个碱基，这样在基因编辑中两个断端经精准型NHEJ连接后既可以实现Tudor或OD结构域的功能破坏又不会影响到53BP1的其他部分。按照实施例2中所述方法，将配对Cas9-sgRNA转染小鼠胚胎干细胞后，挑取Tudor或OD结构域被切除的单克隆细胞株，经一代测序技术证实挑选到的克隆基因序列被精准编辑(图16中a)。Western blotting技术检测表明虽然Tudor或OD结构被切除，但53BP1蛋白质表达未受明显影响(图16中b)利用电离辐射照射细胞产生DSB，结合免疫荧光实验，我们发现，野生型53BP1能够招募到受损位置形成焦点(foci)，并与γH2AX焦点共定位，而Tudor或OD缺失的53BP1突变体不能形成焦点(图16中c)。这表明失去Tudor或OD结构域的53BP1蛋白已经不能被募集到DNA双链断裂的位点，与先前的发现是一致的。产生的Tudor或OD缺失的53BP1突变细胞可以用于后续的功能研究。

实施例4：利用配对Cas9-sgRNA技术测量细胞常异染色质NHEJ

因为DNA是包装在染色质结构中，因此DSB的产生和修复受染色质结构及组蛋白修饰的影响。考虑到常染色质和异染色质结构的不同，常异染色质的NHEJ修复与调节会有所不同。因此，除了可以分析常染色质NHEJ(图10和图11)，我们也可以利用配对Cas9-sgRNA技术分析异染色质NHEJ。我们选择两个鼠源组成性异染色质基因组位点Misat和TRPC21位点，设计配对sgRNA(Misat位点：CCTTAGTAGACAGATGGACA和CTTGACCCAGGGCTGCACAC；TRPC21位点：TGCAGCACAGTGGCAGCACA和GGAGCACTGTGAGACCTTAG)，联合Cas9，我们测试分析了这些位点的NHEJ(方法同实施例1)，包括特定靶点的总编辑效率(图17中a)、Group I-IV在编辑效率中的分布(图17中b)、精准型NHEJ和突变型NHEJ(即Del、Ins和InDel)的频率(图17中c)、Group I突变型NHEJ接口的删除长度及频率(图18中a)、以及Group I突变型NHEJ接口的微同源序列利用度(图18中b)。这些结果显示，配对Cas9-sgRNA技术可以定量分析细胞及器官常异染色质NHEJ，研究常异染色质NHEJ的分子机制。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于基因编辑的配对sgRNA及其应用

<160> 73

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ggatcttcca gagataggct acagattgca acccaattaa tatcaaagta tcctgcaagt 60

ttacctaact gtgagctgtc tccattactg atgatactat ctcagcttct accccaacag 120

cgacatgggg aacgtacacc atatgtgtta cgatgcctta cggaagttgc attgtgtcaa 180

gacaagaggt caaacctaga aagctcacaa aagtcagatt tattaaaact ctggaataaa 240

atttggtgta ttacctttcg tggtataagt tctgagcaaa tacaagctga aaactttggc 300

ttacttggag ccataattca gggtagttta gttgaggttg acagagaatt ctggatcgtc 360

gaacggcag 369

<210> 2

<211> 221

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gaaataagtg tgattagtaa cccattatta tttccttttt attttcagaa agaagttgag 60

aaatttaagc gcctgattcg agatcctgaa acaattaaac atctagatcg gcattcagat 120

tccaaacaag gaaaatattt gaattgggat gctgttttta ggtattctat tcaaatttat 180

tttactgtct ttatttttct ctttcatatt tatttctgtt g 221

<210> 3

<211> 221

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gaaataagtg tgattagtaa cccattatta tttccttttt attttcagaa agaagttgag 60

aaatttaagc gcctgattcg agatcctgaa acaattaaac atctagatcg gcattcagat 120

tccaaacaag gaaaatattt gaattgggat gctgttttta ggtattctat tcaaatttat 180

tttactgtct ttatttttct ctttcatatt tatttctgtt g 221

<210> 4

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 5

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 6

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 7

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 8

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 9

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 10

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 11

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 12

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 13

<211> 267

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

atccgcagtg cgggctcggg cggccgggcc cagggaaccc cgcaggcggg ggcggccagt 60

ttcccgggtt cggctttacg tcacgcgagg gcggcaggga ggacggaatg gcggggtttg 120

gggtgggtcc ctcctcgggg gagccctggg aaaagaggac tgcgtgtggg aagagaaggt 180

ggaaatggcg ttttggttga catgtgccgc ctgcgagcgt gctgcgggga ggggccgagg 240

gcagattcgg gaatgatggc gcggggt 267

<210> 14

<211> 254

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

actttctatt aaattcctga ttttatttct gtaggactga acgtcttgct cgagatgtga 60

tgaaggagat gggaggccat cacattgtag ccctctgtgt gctcaagggg ggctataaat 120

tctttgctga cctgctggat tacatcaaag cactgaatag aaatagtgat agatccattc 180

ctatgactgt agattttatc agactgaaga gctattgtgt gagtatattt aatatatgat 240

tctttttagt ggca 254

<210> 15

<211> 254

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

actttctatt aaattcctga ttttatttct gtaggactga acgtcttgct cgagatgtga 60

tgaaggagat gggaggccat cacattgtag ccctctgtgt gctcaagggg ggctataaat 120

tctttgctga cctgctggat tacatcaaag cactgaatag aaatagtgat agatccattc 180

ctatgactgt agattttatc agactgaaga gctattgtgt gagtatattt aatatatgat 240

tctttttagt ggca 254

<210> 16

<211> 236

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

cacccatcta cagtccccct tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga 60

cgatattgaa caatggttca ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga 120

ggctgctccc cccgtggccc ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc 180

cccctcctgg cccctgtcat cttctgtccc ttcccagaaa acctaccagg gcagct 236

<210> 17

<211> 236

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

cacccatcta cagtccccct tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga 60

cgatattgaa caatggttca ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga 120

ggctgctccc cccgtggccc ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc 180

cccctcctgg cccctgtcat cttctgtccc ttcccagaaa acctaccagg gcagct 236

<210> 18

<211> 236

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

cacccatcta cagtccccct tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga 60

cgatattgaa caatggttca ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga 120

ggctgctccc cccgtggccc ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc 180

cccctcctgg cccctgtcat cttctgtccc ttcccagaaa acctaccagg gcagct 236

<210> 19

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

ttccattcca ggggagcaga tggaccctac tggaagtcaa ttggattcag atttctctca 60

gcaagacact ccttgcctga taatagaaga ttctcagcct gaaagccagg ttctggaaga 120

agatgcaggc tctcacttca gcgtgctatc tcgacacctt cctaatctgc agatgcacaa 180

agagaacccc gtgttggtga gtgagtgatg atgccctgtt caag 224

<210> 20

<211> 147

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

tgtgcttctg tttccgaggt gggctttggg tctagtgttc ccgggtgcga tgagctcctt 60

ccagggacag atggcggagt atccaaccat ctccattgac cgcttcgaca gggagaacct 120

gaaagcccgt gcctacttcc tttcgca 147

<210> 21

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

taggttgatc ccacaggaga gtatgaaaat ctggtgacta taaaatcatt taaaacagaa 60

tttcgcttag ctggaggctt aaatttaccc aaaataatag attgtgtggg ttctgatggc 120

aaggaaagga gacagcttgt gaaggtaaga cttcctgttt ctggtatagt cttcagagga 180

ttaatgccat caacatcaac agcaggatat ttaattctta cctcatttgg ttgtctggat 240

<210> 22

<211> 195

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 22

gcaagaatcc tgctattttt ggggtactca caagagaatt actttatctt tttgaagact 60

taatttacct ccacaaaaga aatgcagtgg gtgaggttat ggaatggcca gtggttgtta 120

gtcggttttt aagccgattg gatgaacata tgggatgttt acagccagct cctttgcagt 180

tcatgaacgt gcaaa 195

<210> 23

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 23

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 24

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 24

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 25

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 25

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 26

<211> 262

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 26

tcggaaatga gaacaggggc atcttgagcc cctgcggacg gtgccgacag gtgcttctcg 60

atctgcatcc tgggatcaaa gccatagtga aggacagtga tggacagccg acggcagttg 120

ggattcgtga attgctgccc tctggttatg tgtgggaggg cggacctggc attaccctgt 180

tatccctaga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg gatccatcgc caccatggtg 240

agcaagggcg aggagctgtt ca 262

<210> 27

<211> 262

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 27

tcggaaatga gaacaggggc atcttgagcc cctgcggacg gtgccgacag gtgcttctcg 60

atctgcatcc tgggatcaaa gccatagtga aggacagtga tggacagccg acggcagttg 120

ggattcgtga attgctgccc tctggttatg tgtgggaggg cggacctggc attaccctgt 180

tatccctaga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg gatccatcgc caccatggtg 240

agcaagggcg aggagctgtt ca 262

<210> 28

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 28

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 29

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 29

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 30

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 30

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 31

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 31

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 32

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 32

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 33

<211> 239

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 33

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggaccgc gggcccggga tccatcgcca 180

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctg 239

<210> 34

<211> 240

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 34

tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga 60

cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc ggacctggca 120

ttaccctgtt atccctagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccatcgcc 180

accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 240

<210> 35

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 35

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 36

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 36

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 37

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 37

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 38

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 38

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 39

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 39

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 40

<211> 212

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 40

ccactgattg acacgttgat tgggtaaaac ctttcttccc aggcatcacc agtcttggga 60

ctcttcctgg ctagacccta tctcctccca tcctcacagg gtccatcctt ctgaactcag 120

catccgagct gtacctggcc actgctcgct tgtctgaact tactgtctcc tccacgagcc 180

cccatctgtc ataccagaca aagggtgtga ct 212

<210> 41

<211> 271

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 41

acaccgtctt aaacatgttc tctcccttta tcctttttac gtagcaggac agggacccac 60

ttcagaaact ttgctaatag cgtctttttt cttgtgtact tttggggcct ttgtttctag 120

gcagctgttg tgctgtgtgt ggatgtgggg gttgccatgg gtaactcctt tcctggtgaa 180

gaatctccaa ttgaacaagc aaagaaagtg atgactatgt ttgtccaacg acaggtaagt 240

ttcagattaa ccttgagctt gtgacacaca c 271

<210> 42

<211> 231

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 42

ccactgagcc atctatctct ccaccccaat tttgtttttc ttaagctttg ttaatcttca 60

cactataaac agaaggctaa gatgaaagca tcaccaagtg caggcaaggt tgttgccagt 120

ggcttcttag actctgccct ttgtaatatg ctaacacctt ggtgggggca gaaggtggta 180

cctcctcctt ggaaaatggc ttacagctga aaactgccac atgggtgttc t 231

<210> 43

<211> 248

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 43

aggagtgctc ttgacttgtg gaagacatga gtggtgctta tagaggcaga ggttttggac 60

gaggaagatt ccaaagctgg aaaagaggaa gaggtggtgg gaacttctca ggaaggtgga 120

gagaaagaga aaacagagtt gacctgaatg aagcttcagg aaagcacgct tctggtacgt 180

gcacgcaggg atcgatatgt tttctctcgg gaaagagaca attcaagggc cggtagatgc 240

cagagtag 248

<210> 44

<211> 279

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 44

cacttgggaa gcagaggcaa ggggatctct gagtttgagg ccagcctggt ctgattatgt 60

gtttccttta cagatcatgg aaagcaccca ggtgattgac tgggatgctg aagaagagga 120

agagacagaa ctatccagtg gctccttggg gtatagtgtg gagcctatag ggcagctacg 180

tctcttcagt ggaactcatg gaccagaaag aggtcaggag atattgggaa ctaaagtatg 240

attgtgggtc tttcttagaa gaagttggaa gttggaggg 279

<210> 45

<211> 337

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 45

ggaaatcatc acctcatggt tgttcacatc tttaatccca gcacttggga agcagaggca 60

aggggatctc tgagtttgag gccagcctgg tctgattatg tgtttccttt acagatcatg 120

gaaagcaccc aggtgattga ctgggatgct gaagaagagg aagagacaga actatccagt 180

ggctccttgg ggtatagtgt ggagcctata gggcagctac gtctcttcag tggaactcat 240

ggaccagaaa gaggtcagga gatattggga actaaagtat gattgtgggt ctttcttaga 300

agaagttgga agttggaggg ttggtagaac catttat 337

<210> 46

<211> 279

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 46

cacttgggaa gcagaggcaa ggggatctct gagtttgagg ccagcctggt ctgattatgt 60

gtttccttta cagatcatgg aaagcaccca ggtgattgac tgggatgctg aagaagagga 120

agagacagaa ctatccagtg gctccttggg gtatagtgtg gagcctatag ggcagctacg 180

tctcttcagt ggaactcatg gaccagaaag aggtcaggag atattgggaa ctaaagtatg 240

attgtgggtc tttcttagaa gaagttggaa gttggaggg 279

<210> 47

<211> 279

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 47

cacttgggaa gcagaggcaa ggggatctct gagtttgagg ccagcctggt ctgattatgt 60

gtttccttta cagatcatgg aaagcaccca ggtgattgac tgggatgctg aagaagagga 120

agagacagaa ctatccagtg gctccttggg gtatagtgtg gagcctatag ggcagctacg 180

tctcttcagt ggaactcatg gaccagaaag aggtcaggag atattgggaa ctaaagtatg 240

attgtgggtc tttcttagaa gaagttggaa gttggaggg 279

<210> 48

<211> 279

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 48

cacttgggaa gcagaggcaa ggggatctct gagtttgagg ccagcctggt ctgattatgt 60

gtttccttta cagatcatgg aaagcaccca ggtgattgac tgggatgctg aagaagagga 120

agagacagaa ctatccagtg gctccttggg gtatagtgtg gagcctatag ggcagctacg 180

tctcttcagt ggaactcatg gaccagaaag aggtcaggag atattgggaa ctaaagtatg 240

attgtgggtc tttcttagaa gaagttggaa gttggaggg 279

<210> 49

<211> 350

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 49

gagaatgtgc tcagaaccct cactgcagct ggcgcttcgc tttttaaagt gcttcctccc 60

atttccagca caagaaactc agctcggcag ttgctttcgg aggtggagaa gccaggctga 120

tggcagaaga cgacgaagag gaacagagct tcttttcagc tcccggaacc tgcgttgttg 180

atgtaggaat aacgaataca cagctcataa tttcacactc ccagaaaaaa tggattcatt 240

tgataatgga tacacttcaa aggtacataa ttctttcttc acaaattaaa aatgcaagta 300

gcttttacat gcaactcagt taataccaaa gagtctacaa gggcttgtca 350

<210> 50

<211> 320

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 50

gtcctgtatc atgaatgcgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtac 60

cttacattca tttacttctg ttttccctca ggagaaccat accgactttt ggccggcgtg 120

gagtacgttg ttgggaggaa aaactgtggc attctgattg aaaatgatca gtcaatcagt 180

cgaaaccatg ctgtcttaac agtaaacttc cctgtaacca gtttggtatg ctgctaactt 240

tattttacta tctctttttg tttgctttaa gatttattta tttattttat gcatatgagt 300

gttgtatctg catggacacc 320

<210> 51

<211> 191

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 51

caccggagat gccttctagc acagaggcgg cgaccgatga atgtgacgat gcggagctcc 60

ggtgccgggt agccgtggag gagctgagtc ctggagggca acctcgcaag cgccaggccc 120

tgcgcgccgc agagctgagc ctaggtcgaa acgaacgacg tgagttaatg ctgcgactgc 180

aggcaccgtt t 191

<210> 52

<211> 263

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 52

actgtgtcgt gtcctgaaca gtcgagagga gcttgtttgc aatgagtctt ccgcgccgga 60

gtaggaaacg gcggcgttca tcgtccggct ccgacacgtt ctcgggagat ggtgatagct 120

ttgttagccc tcagctccgg tgtggaccgg tgctgagtcc acctccgggg ctgggacgcg 180

gccggaggct cacagggaca ggtactcgac ccgcggggcc gacgcggccg agggcagcag 240

gggttgagat gggctgcgag agt 263

<210> 53

<211> 242

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 53

tgggcgaaaa atgagttgct ggtgaagacg ttacacaagt aacatgagaa agcagaaaat 60

gcaggtcatc cacgcacccc tgacccaggc cagcagggcg ggctgcagca tcagtacaca 120

ggagaaagat ccttattcct aagaatgaga aaggcaaagg cgcccgatag aataaattag 180

catagaaggg gctttcccag gagttaaaac tttccttctg agcgattacc tactaaaacc 240

ag 242

<210> 54

<211> 294

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 54

aaagagccca gtacttcata tccatttctc ccgctccttc tgcagcctta tcaaaaggta 60

ttttagaaca ctcattttag ccccattttc atttattata ctggcttatc caacccctag 120

acagagcatt ggagcactct ggaggcagag acaggcagat ctctgagttt gagcccagcc 180

tggtctacac atcaagttct atctaggata gccaggaata cacacagaaa ccctgttggg 240

gaggggggct ctgagatttc ataaaattat aattgaagca ttccctaatg agcc 294

<210> 55

<211> 280

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 55

atgagttgct ggtgaagacg ttacacaagt aacatgagaa agcagaaaat gcaggtcatc 60

cacgcacccc tgacccaggc cagcagggcg ggctgcagca tcagtacaca ggagaaagat 120

ccttattcct aagaatgaga aaggcaaagg cgcccgatag aataaattag catagaaggg 180

gctttcccag gagttaaaac tttccttctg agcgattacc tactaaaacc agggcttttg 240

cccactacca tttacctagg atcttggctt gcacggattc 280

<210> 56

<211> 472

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 56

tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt 60

tcgacctgca gcccaagctc tagccggact cagatctcga gctcaagctt cgaattcatt 120

accctgttat ccctaaccgc cgccaccatg gattaccctg ttatccctag gatccatcct 180

tcacatgatc agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 240

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 300

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 360

caccctcgtg accaccctta cgtacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 420

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg ag 472

<210> 57

<211> 472

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 57

tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt 60

tcgacctgca gcccaagctc tagccggact cagatctcga gctcaagctt cgaattcatt 120

accctgttat ccctaaccgc cgccaccatg gattaccctg ttatccctag gatccatcct 180

tcacatgatc agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 240

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 300

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 360

caccctcgtg accaccctta cgtacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 420

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg ag 472

<210> 58

<211> 258

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 58

caccgcatct ccgggccttt cgacctgcag cccaagctct agccggactc agatctcgag 60

ctcaagcttc gaattcatta ccctgttatc cctaaccgcc gccaccatgg attaccctgt 120

tatccctagg atccatcctt cacatgatca gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 180

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 240

agggcgaggg cgatgttt 258

<210> 59

<211> 244

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 59

tgggaagaga tgctggatct gggagctcag agacggcttc actgtgcaaa aatggcatac 60

ataccaattt gagttccttc tgcattatag agccagtata cagcggatga ataccaggcc 120

atccagaaag ctctgagaca gagactgggt ccagagtaca ttagcagccg catggctgga 180

ggaggtcaga aggtaagcct ccggagtcgt gggcatgtat ctagttgttg acagaagatc 240

ctgc 244

<210> 60

<211> 244

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 60

tgggaagaga tgctggatct gggagctcag agacggcttc actgtgcaaa aatggcatac 60

ataccaattt gagttccttc tgcattatag agccagtata cagcggatga ataccaggcc 120

atccagaaag ctctgagaca gagactgggt ccagagtaca ttagcagccg catggctgga 180

ggaggtcaga aggtaagcct ccggagtcgt gggcatgtat ctagttgttg acagaagatc 240

ctgc 244

<210> 61

<211> 244

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 61

tgggaagaga tgctggatct gggagctcag agacggcttc actgtgcaaa aatggcatac 60

ataccaattt gagttccttc tgcattatag agccagtata cagcggatga ataccaggcc 120

atccagaaag ctctgagaca gagactgggt ccagagtaca ttagcagccg catggctgga 180

ggaggtcaga aggtaagcct ccggagtcgt gggcatgtat ctagttgttg acagaagatc 240

ctgc 244

<210> 62

<211> 263

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 62

actgtgtcgt gtcctgaaca gtcgagagga gcttgtttgc aatgagtctt ccgcgccgga 60

gtaggaaacg gcggcgttca tcgtccggct ccgacacgtt ctcgggagat ggtgatagct 120

ttgttagccc tcagctccgg tgtggaccgg tgctgagtcc acctccgggg ctgggacgcg 180

gccggaggct cacagggaca ggtactcgac ccgcggggcc gacgcggccg agggcagcag 240

gggttgagat gggctgcgag agt 263

<210> 63

<211> 263

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 63

actgtgtcgt gtcctgaaca gtcgagagga gcttgtttgc aatgagtctt ccgcgccgga 60

gtaggaaacg gcggcgttca tcgtccggct ccgacacgtt ctcgggagat ggtgatagct 120

ttgttagccc tcagctccgg tgtggaccgg tgctgagtcc acctccgggg ctgggacgcg 180

gccggaggct cacagggaca ggtactcgac ccgcggggcc gacgcggccg agggcagcag 240

gggttgagat gggctgcgag agt 263

<210> 64

<211> 262

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 64

tgggaccacc ttatattccc agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc 60

tgtcccctcc accccacagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aaagccccat 120

ccttaggcct cctccttcct agtctcctga tattgggtct aacccccacc tcctgttagg 180

cagattcctt atctggtgac acacccccat ttcctggagc catctctctc cttgccagaa 240

cctctaaggt ttgcttacga tg 262

<210> 65

<211> 262

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 65

tgggaccacc ttatattccc agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc 60

tgtcccctcc accccacagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aaagccccat 120

ccttaggcct cctccttcct agtctcctga tattgggtct aacccccacc tcctgttagg 180

cagattcctt atctggtgac acacccccat ttcctggagc catctctctc cttgccagaa 240

cctctaaggt ttgcttacga tg 262

<210> 66

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 66

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctg 286

<210> 67

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 67

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctt 286

<210> 68

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 68

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctg 286

<210> 69

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 69

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctg 286

<210> 70

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 70

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctg 286

<210> 71

<211> 286

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 71

gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct 60

tctctgtctc cacatgccca gtttctattg gtctccttaa acctgtcttg taaccttgat 120

accaacctgc ccagggcctc accaccaact tcatccacgt tcaccttgcc ccacagggca 180

gtaacggcag acttctcctc aggagtcaga tgcaccatgg tgtctgtttg aggttgctag 240

tgaacacagt tgtgtcagaa gcaaatgtaa gcaatagatg gctctg 286

<210> 72

<211> 288

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 72

cttaccatat tcctcaaggt ttccggggct agagaaagtt tgctggtggt agacgaagcc 60

gactgcatgg tagctgggtc tcagttgttt gtggcctcct tagtagacag atggacatgg 120

tttgaatttt ttatattaag aaaaggattg ggctacaaat agagctcagt caatagactg 180

cttgcccagc ctgtgtgcag ccctgggtca agcatatgca tcccattatc ctggcctcgt 240

ggctcttctt atagacccag cactgaatag gtagaagctg tatattac 288

<210> 73

<211> 237

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 73

ccacagtgca gcacagttat agtaaagtgg aacacttgga cagcaaaatg gagcactgtg 60

acatcacaat ggagcactgt gacaccatag tgcagcacag tggcagcaca ggggactagt 120

gtgacattac aatggagcac tgtgagacct tagtggagca aatgacacca cagtgagcac 180

tatgacacaa aatttgagcc ctgagacact ttagtggagc actgtgatat cacattg 237

Claims

1.一种用于基因编辑的配对sgRNA，其特征在于所述配对sgRNA按如下方法获得：根据靶标基因或靶标基因组位点设计多条sgRNA，根据基因编辑要求选择两条不同间距sgRNA作为配对sgRNA；所述基因编辑为整码删除时配对sgRNA介导的切割间距为3n碱基对，所述基因编辑为移码突变或基因敲除时配对sgRNA介导的切割间距为3n+1或3n+2碱基对，其中n为0及0以上的整数。

2.如权利要求1所述的配对sgRNA，其特征在于所述配对sgRNA对应的两个PAM在靶标基因或基因组位点上的位置组合形式为：W/W、W/C、C/W或C/C中的一种；W为PAM在Watson链上，C为PAM在Crick链上。

3.如权利要求2所述的配对sgRNA，其特征在于所述配对sgRNA在靶标基因或靶标基因组位点上的位置组合形式为：W/C。

4.一种权利要求1所述配对sgRNA在提高CRISPR/Cas9基因编辑效率及精准度中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法按如下步骤操作：根据靶标基因设计多条sgRNA，并根据基因编辑要求选择间距为3n、3n+1或3n+2碱基对的两条sgRNA作为配对sgRNA，构建sgRNA表达质粒，与Cas9表达质粒共同导入细胞进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，DNA电泳测试配对Cas9-sgRNA的工作效率；所述基因编辑为整码删除时配对sgRNA介导的切割间距为3n碱基对，所述基因编辑为移码突变或基因敲除时配对sgRNA介导的切割间距为3n+1或3n+2碱基对，其中n为0及0以上的整数。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述配对sgRNA在靶标基因或靶标基因组位点上进行移码突变或基因敲除时，位置组合形式为W/C，配对sgRNA间距为3n+1或3n+2碱基对；位置组合形式为W/W、C/W或C/C中的一种，配对sgRNA间距为3n+2碱基对。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述配对sgRNA在靶标基因或靶标基因组位点上进行整码突变或精准整码删除时，配对sgRNA间距为3n碱基对，位置组合形式为W/C。

8.一种权利要求1所述配对sgRNA在定量细胞内或动物体内非同源末端连接中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述非同源末端连接为精准型非同源末端连接或突变型非同源末端连接。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用的方法按如下步骤操作：根据靶标基因设计配对sgRNA，构建sgRNA表达质粒，与Cas9表达质粒共同导入细胞进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，DNA电泳测试配对Cas9-sgRNA的工作效率；选择工作效率良好的配对sgRNA，构建对应的sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒，共同导入细胞或组织器官进行表达，通过PCR扩增靶点DNA，深度测序PCR扩增子分析非同源末端连接，进而定量细胞内或动物体内非同源末端连接。