CN105483118A - 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 - Google Patents
以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105483118A CN105483118A CN201510971234.5A CN201510971234A CN105483118A CN 105483118 A CN105483118 A CN 105483118A CN 201510971234 A CN201510971234 A CN 201510971234A CN 105483118 A CN105483118 A CN 105483118A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- target
- argonaute
- argonaute nuclease
- nuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 claims description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 11
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 10
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 claims description 10
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 abstract 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 22
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 16
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 9
- 241000488294 Microcystis aeruginosa NIES-843 Species 0.000 description 8
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 7
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241001417623 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Species 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000192589 Synechococcus elongatus PCC 7942 Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000078952 Halogeometricum pallidum JCM 14848 Species 0.000 description 3
- 241001148517 Natrialba asiatica DSM 12278 Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 101150086683 DYRK1A gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028554 Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A Human genes 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101150116759 HBA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000838016 Homo sapiens Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A Proteins 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术。在向导DNA存在下,Argonaute核酸内切酶能够对靶向DNA序列包括哺乳动物的基因组的任意位点进行切割,造成DNA双链断链从而达到编辑目的。编辑手段包括内切、删除、引入突变、外源序列插入、片段置换等。编辑效果包括基因灭活、基因突变、导入外源基因等。该蛋白可作为基因组编辑的重要工具。以该蛋白为核心的基因编辑工具具有操作简单、效率高、低脱靶高保真的特点。并且,几乎任何基因组位点都能被Argonaute核酸酶有效靶向和切割。利用本技术,有望实现高特异性和高效率的基因组靶向编辑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种以Argonaute内切核酸酶为核心的简单的高效的精确的靶向基因编辑技术。
背景技术
深入了解遗传信息以及进行基因治疗需要精确和有效的基因组编辑工具。基因或基因组编辑是一种基因工程技术。该技术通过核酸酶对基因组的特定位点进行突变、插入、置换等改造。基因编辑的过程包括三步:首先,经过特别设计的向导DNA或RNA(基因导向元件)与核酸内切酶(基因切割元件)结合,前者引导后者到靶向基因的特定区域;其次,核酸内切酶对靶向基因的特定区域进行切割,在两条DNA上各形成一个缺口,造成双链断裂(DSB);最后,利用DSB激活细胞内固有的修复机制这一现象,在修复缺口的同时可以进行突变、插入、置换等改造。大部分物种细胞对DSB有两种修复机制:
nonhomologousend-joining(NHEJ)和homologousdirectedrepair(HDR)。NHEJ利用一系列酶反应将DNA断裂端直接重新连接;HDR需要一段同源序列作为修复模板对DSB后失去的DNA序列进行复原。NHEJ是一种带有错误倾向性的低保真修复途径,它在修复过程中往往带入突变。而HDR需要同源模板进行修复,于是可利用这一性质将外源的编码序列插入基因组的靶向位点。HDR机制类似于同源重组,但因为HDR是基于DSB的修复,其引入外源序列的成功率较同源重组高三个数量级。因此,这两种修复途径的特性成为了核酸酶高效基因编辑的基础,对诱导的断裂区进行改造性修复。基因编辑技术对深入了解基因功能、改变基因以及基因治疗有着革命性的意义。
目前,应用于基因组编辑的核酸酶包括四个家族:Zincfingernucleases(ZFNs)、TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases(TALENs)、theengineeredmeganucleasere-engineeredhomingendonucleases和CRISPR/Cas9system。前三者或者对靶向序列有特殊要求、或者针对靶向序列需要对酶本身个体化特定设计、或者有高脱靶可能,所以应用受到限制。CRISPR/Cas9是目前比较推崇的基因编辑系统。Cas9源自细菌,它以向导RNA为引导,理论上可对基因组中的任何在靠近PAM序列上游的靶点进行切割造成DSB。然而,因为RNA较易形成二级结构,因此对GC丰富的基因序列,Cas9系统效率低下。并且,因为细胞自身产生大量RNA片段,Cas9有与这些非特异RNA结合被错误引导切割非靶向基因组位点的可能性;而且Cas9对向导RNA和靶向DNA序列错配的耐受较高(5个核苷酸错配不会阻止切割),所以Cas9有一定的脱靶缺陷。
Argonautes是一种核酸酶,其普遍存在于细菌、植物、真菌、哺乳细胞内。Argonaute广为人们所知的是其参与RNA干扰机制,大部分物种的Argonaute与短链非编码RNA相结合,后者作为向导RNA通过互补反应识别靶向mRNA,引导Argonaute降解mRNA,或阻止翻译进程达到抑制基因翻译的效果。近来发现从细菌Thermusthermophilus获取的Argonaute(TtAgo)能够结合单链DNA并以后者为向导降解DNA质粒。这一现象提示某些物种的Argonaute可作为DNA核酸内切酶。TtAgo自身因为酶切反应需要较高的温度(>65℃)而不适于用作基因编辑工具。本发明中,我们公开了来自于一种细菌的Argonaute,其在37℃具有很好的酶切活性适用于作为基因编辑的工具。该蛋白用5’磷酸化的单链DNA作为向导DNA,对哺乳动物细胞的基因定点切割造成DSB。该Argonaute系统高效精准,向导DNA设计简单,能有效地将外源基因片段导入切割区。其不受GC序列和PAM序列的限制,能针对基因组的任何序列进行编辑,并且忠实度高。是较CRISPR/Cas9更为有效的基因编辑工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的以Argonaute核酸酶为主体的以短链DNA作为向导的高保真基因编辑工具。其可被用于但不限于DNA体外编辑、细胞内DNA编辑、基因组基因灭活、外源片段插入基因组。
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,10-50℃以5’端磷酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互补的靶向DNA进行切割,造成靶向DNA双链断裂。所述的Argonaute核酸酶为能以5’端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞自身的低保真Non-HomologousEndJoining修复途径,引入突变,从而造成靶向基因或功能区灭活或改变。
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具有同源序列的外源DNA片段情况下,能够通过细胞自身的HomologousDirectedRepair修复途径将该外源DNA片段插入双链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
本发明的特点在于1、向导单链DNA设计简单,除5’磷酸化24个核苷酸长外无特殊序列或二级结构要求;2、对靶序列无特殊序列要求,靶序列富含GC不影响其切割效率,因此可编辑基因组的任何位置;3、因为哺乳动物细胞内罕有5’磷酸化的单链DNA,所以基本不存在被其它非向导DNA误导脱靶的可能;4、高特异低脱靶性,向导DNA与靶序列间1个碱基对的错配就会造成切割效率大大下降;3个碱基对的错配会造成切割活性的丧失;5、因为向导是DNA,因此转染细胞简单而且剂量可控。
附图说明
图1:(a)靶质粒、靶切割位点和向导DNA的设计图。(b)靶质粒pACYCDuet-GFP与细胞来源经过纯化的NgAgo蛋白以及向导DNA分别孵育4小时和8小时。随后电泳分析质粒。4小时时部分质粒还处于完整的超螺旋结构,部分单链断裂成开环结构,部分双链断裂成线性DNA。8小时时反应完全,所有质粒均被双链切割。(c)靶质粒被NgAgo双链切割后靶位点测序的部分结果。结果显示靶位点被定向切割并有部分序列被移除。
图2:(a)靶质粒、靶切割位点、向导DNA和向导RNA的设计图。(b)部分Hela细胞共转染了EGFP-N1靶质粒、NgAgo表达载体和标注的向导DNA;部分细胞共转染了靶质粒、Cas9表达载体和标注的向导RNA。GFP蛋白的表达通过Westernblot来检测。本Western电泳图是三次独立实验的代表图,其相应半定量结果显示在左下方柱形图。右下方柱形图显示了NgAgo系统和Cas9系统改变GFP蛋白表达的统计结果(***p<0.01)。(c)用NgAgo的三种同源酶HpAgo、NaAgo和NtAgo分别重复上述实验,结合向导DNA后,此三种Argonaute均可有效的靶向抑制靶蛋白GFP的表达。
图3:(a)选取的两个靶位点分别是人基因组里HBA2和GATA4基因的高GC含量序列。分别设计了针对这两个序列的向导DNA(G37和G40)。(b)293T细胞转染了NgAgo表达载体和向导DNA,一些细胞转染了Cas9表达载体和靶向于同一区域的向导RNA。随后用T7核酸内切酶I(T7EI)检测法检测基因组里的靶位点被编辑的效率。可以看见NgAgo系统对高GC含量的靶向区编辑效率较Cas9系统要高得多。
图4:(a)NgAgo系统对哺乳动物基因组连续多途径编辑实验模式图。RFP-TGA-GFP供体DNA由以下序列组成:一个报告基因区和一个抗G418选择基因,后者由自带的CMV启动子引导具有表达功能。前者报告基因区由一个红色荧光蛋白(RFP)基因和一个绿色荧光蛋白(GFP)基因组成。二者由TGA转录终结子分隔。该供体DNA两端由两段人DYRK1A基因同源序列构成。如果该供体DNA按正确读码框插入基因组的靶向位置,RFP和G418选择基因会表达而GFP因为TGA的存在而不表达。(b)293T细胞共转染了NgAgo表达载体、针对DYRK1A基因靶向区的向导DNA和RFP-TGA-GFP供体DNA。3天后,细胞的靶向区用PCR扩增,发现供体DNA准确的插入靶向区域。(c)通过G418选择两周后,绝大部分细胞表达RFP。这些细胞又被转染NgAgo表达载体和针对TGA转录终结子区的向导DNA进行第二次编辑,以去除表达阻隔使GFP蛋白表达激活。2天后,流式细胞仪检测表明11.7%的细胞成功的表达了RFP-GFP红绿荧光复合蛋白。
具体实施方式
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,其特征在于以5’端磷酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互补的靶向DNA进行切割,造成靶向DNA双链断裂。所述的Argonaute核酸酶能在10-50℃编辑DNA,具体为能以5’端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
所述的Argonaute核酸酶优选自以下(a)~(i)中的一种:
(a)来自NatronobacteriumgregoryiSP2细菌,所述的NatronobacteriumgregoryiSP2细菌的ATCC菌株号为CP003377,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:AFZ73749.1;
(b)来源于MicrocystisaeruginosaNIES843,简称MaAgo,所述的MicrocystisaeruginosaNIES843的FACHB编号为315,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(c)来源于HalosarcinapallidaJCM14848,简称HpAgo,所述HalosarcinapallidaJCM14848的中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号为:1.8954,所述的Argonaute核酸酶的GenBank:ELZ29017.1;
(d)来源于NatrialbaasiaticaDSM12278,简称NaAgo,所述NatrialbaasiaticaDSM12278的ATCC编号为:700177,CGMCC编号为:1.2199,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_006111085.1;
(e)来源于NatronorubrumtibetenseGA33,简称NtAgo,所述NatronorubrumtibetenseGA33的CGMCC编号:1.2123,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_006090832.1;
(f)来源于NatrinemapellirubrumDSM15624,简称NpAgo,所述NatrinemapellirubrumDSM15624的CGMCC编号:1.3708,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为NCBI基因序列号:WP_006183335.1;
(g)来源于Microcystissp.7806,简称SPAgo,所述Microcystissp.7806的中国科学院淡水藻种库(FACHB)编号:FACHB-915,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_002747795.1;
(h)来源于MicrocystisaeruginosaNIES843,简称NIESAgo,所述MicrocystisaeruginosaNIES843的FACHB编号为:315,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(i)来源于Synechococcus7942,简称SchAgo,所述Synechococcus7942的FACHB编号为:805,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1。
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞自身的低保真Non-HomologousEndJoining修复途径,引入突变,从而造成靶向基因或功能区灭活或改变。
本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具有同源序列的外源DNA片段情况下,能够通过细胞自身的HomologousDirectedRepair修复途径将该外源DNA片段插入双链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
下面结合实施例进行说明。
实施例一:体外DNA质粒内切
1.将从NatronobacteriumgregoryiSP2细菌获得的Argonaute(简称NgAgo)完整阅读框克隆于pcDNA3.1质粒上,其5’端和3’端分别附带FLAG和HA标记序列。NgAgo的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.合成一段5’磷酸化的向导DNA5'P-TGCTTCAGCCGCTACCCCGACCAC-3',其与pACYCDuet-GFP靶向质粒上的GFP基因的一段序列互补(图1a)。
3.将构建的该FLAG-NgAgo-HA-pcDNA3.1质粒与上述步骤2的向导片段共转染入人源293T细胞。
4.用FLAG,HATandemAffinityPurificationKit试剂盒(Sigma-Aldrich公司)从被转染的细胞内纯化结合有向导DNA的FLAG-NgAgo-HA蛋白。
5.5μg纯化的结合有向导DNA的NgAgo蛋白与400ngpACYCDuet-GFP质粒于50ul反应体系37℃下(10mmTrisPH8.0,20mMNacl,0.5mMMgCl2,0.4%glycerol,2mMDTTand20μg/mlBSA)孵育8小时。
6.用proteinaseK于52℃反应2小时降解反应体系里的蛋白,而后产物于1%agrose胶电泳。结果:孵育4小时后尚有未切割的超螺旋质粒以及单链切割的开放环状质粒;部分质粒被双链切割成线性化。孵育8小时后可见所有质粒都被切割成双链断裂的线性化质粒(图1b)。
7.对反应8小时后的质粒产物的靶位点进行测序,发现靶向序列被NgAgo成功切割,并且靶向序列里1-20个核苷酸被随机去除(图1c)。
实施例二:哺乳动物细胞内Argonaute介导的质粒切割以及与CRISPR/Cas9系统介导的切割效率的比较
1.在NgAgo蛋白N端附加细胞核内定位信号(NLS),该改良蛋白NLS-NgAgo基因序列构建于pcDNA3.1质粒上。NLS-NgAgo-pcDNA3.1在Hela细胞表达后主要分布在细胞核内。
2.Hela细胞共转染了EGFP-N1靶质粒、NLS-NgAgo-pcDNA3.1表达质粒。另外,细胞还分别转染了4条针对靶质粒CMV启动子区和GFP编码区的向导DNA(G1-G4)(图2a)。转染条件:200ngNLS-NgAgo-pcDNA3.1质粒与100ng向导DNA通过Lipofectamine2000转染入2×105细胞内(于24孔板)。
3.另外一组细胞共转染了EGFP-N1靶质粒、Cas9表达质粒SpCas9-pCDNA3.1以及分别针对CMV启动子区的向导RNA(sgRNA1)和针对GFP编码区的向导RNA(sgRNA2)。
4.转染36小时后,Western电泳分析GFP蛋白的表达量(图2b)。结果:NgAgo能够有效的抑制质粒GFP的表达,并且效果较转染了同样剂量的Cas9要好。
5.用同样的方法,我们发现来自于HalosarcinapallidaJCM14848的Argonaute(简称HpAgo,HpAgo的氨基酸序列如SEQIDNO:2)所示。来自于NatrialbaasiaticaDSM12278的Argonaute(简称NaAgo,NaAgo的氨基酸如SEQIDNO:3所示)。和来自于NatronorubrumtibetenseGA33的Argonaute(简称NtAgo,NtAgo的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示)等Argonaute都与NgAgo一样有很强的编辑哺乳动物细胞内基因表达的能力(图2c)。
另外,
(b)来源于MicrocystisaeruginosaNIES843,简称MaAgo,所述的MicrocystisaeruginosaNIES843的FACHB编号为315,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(f)来源于NatrinemapellirubrumDSM15624,简称NpAgo,所述NatrinemapellirubrumDSM15624的CGMCC编号:1.3708,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为NCBI基因序列号:WP_006183335.1;
(g)来源于Microcystissp.7806,简称SPAgo,所述Microcystissp.7806的中国科学院淡水藻种库(FACHB)编号:FACHB-915,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_002747795.1;
(h)来源于MicrocystisaeruginosaNIES843,简称NIESAgo,所述MicrocystisaeruginosaNIES843的FACHB编号为:315,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(i)来源于Synechococcus7942,简称SchAgo,所述Synechococcus7942的FACHB编号为:805,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1;
等Argonaute核酸酶也能在37℃编辑DNA(附图2b),它们的共同性在于都能以5’端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂(而其它大部分物种的Argonaute都是以RNA作为向导切割靶向RNA)。
实施例三:哺乳动物细胞内Argonaute介导的针对基因组内富含GC序列的切割以及与CRISPR/Cas9系统介导的切割效率的比较
1.293T细胞转染了NLS-NgAgo表达质粒以及分别针对HBA2基因和GATA4基因里富含GC区的向导DNA(图3a)。
2.作为比较,一些293T细胞转染了Cas9表达质粒以及针对同一区域的向导RNA。
3.因为哺乳动物基因组的双链断裂主要通过细胞自发的indel-formingnon-homologousendjoining(NHEJ)途径进行修复,所以我们用T7核酸内切酶I(T7EI)检测法检测基因组靶序列被切割效率。在每个T7EI反应里,500ngPCR产物与T7核酸内切酶I反应,后者会切割不配对的DNA序列。产物通过变性PAGE电泳以及银染检测。条带密度由ImageLab(Bio-Rad)软件分析.基因组被切割效率由以下公式计算:{1–[1–(b+c/a+b+c)]1/2}×100(其中a代表DNA底物的条带密度,b和c代表切割后产物的条带密度)。
4.结果:NgAgo能非常有效的切割这些基因组位点,但Cas9对这些基因组内富含GC位点的切割活性非常有限(图3b)。
实施例四:哺乳动物细胞内Argonaute介导的基因组HDR和NHEJ复合编辑
1.供体DNA由一段报告基因和G418拮抗基因组成。报告基因又由两个报告片段组成:分别是表达红色荧光的RFP(redmonomer)和表达绿色荧光的GFP,它们被一个TGA转录终结子分隔。报告基因不带启动子,因此供体DNA必须按正确编码结构(in-frame)插入基因组后才能被表达。(图4a)
2.以人类基因DYRK1A的一段外显子为靶序列设计了向导DNA。
3.293T细胞(24孔板)转染了200ngNLS-NgAgo表达质粒、100ng向导DNA以及500ng供体DNA。
4.3天后,通过荧光显微镜观察到有表达红色荧光的细胞存在,证明HDR介导的外源DNA片段插入成功。另外,通过以下方法对靶位点PCR扩增后测序证明供体DNA插入成功:
(1)细胞的基因组DNA通过QuickExtractDNA提取试剂盒(Epicentre)提取。
DYRK1A基因的靶向区随后用以下引物PCR扩增:
5'Junction
DYRK1A-test-F:5’-GGTCACTGTTGAAACTCATCC-3’and
Rm-test-R:5’-CTTGTAGATGAAGGTGCCG-3’;
3'Junction
PolyA-test-F:5’-CTAACTGAAACACGGAAGGAG-3’and
DYRK1A-test-R:5’-CTTGTAGCGGTTCAGTGTGT-3’
(2)PCR产物随后克隆到T-载体上接受测序,测序结果证明基因组上的靶位点被精准插入了供体DNA(图4b)。
5.细胞随后通过G418选择2周,所有的细胞都表达红色荧光。
6.随后,插入的阳性细胞又被转染了NLS-NgAgo表达质粒以及针对TGA转录终结子序列的向导DNA,希望NgAgo对TGA转录终结子切割后通过NHEJ途径错位修复造成转录终结子失效(图4c)。
7.2天后,流式细胞仪检测表明:11.7%的细胞表达RED-GFP红绿荧光复合蛋白(图4c)。
Claims (8)
1.一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,其特征在于在10-50℃下以5’端磷酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互补的靶向DNA进行切割,造成靶向DNA双链断裂。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的Argonaute核酸酶为在10-50℃下能以5’端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于所述的Argonaute核酸酶优选自以下(a)~(i)中的一种:
(a)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:AFZ73749.1;
(b)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(c)所述的Argonaute核酸酶的GenBank:ELZ29017.1;
(d)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_006111085.1;
(e)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_006090832.1;
(f)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_006183335.1;
(g)所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_002747795.1;
(h)所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209.1;
(i)所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1。
4.权利要求1所述方法在基因组靶向编辑上的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞自身的低保真Non-HomologousEndJoining修复途径,引入突变,从而造成靶向基因或功能区灭活或改变。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具有同源序列的外源DNA片段情况下,能够通过细胞自身的HomologousDirectedRepair修复途径将该外源DNA片段插入双链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
7.权利要求1所述方法对细胞内病毒DNA靶向编辑上的应用。
8.权利要求1所述方法在体外DNA靶向编辑上的应用。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510971234.5A CN105483118A (zh) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
US16/064,435 US20200040334A1 (en) | 2015-12-21 | 2016-12-20 | Compositions and methods for gene editing |
CN201680074820.2A CN109153990A (zh) | 2015-12-21 | 2016-12-20 | 用于基因编辑的组合物和方法 |
PCT/CN2016/111045 WO2017107898A2 (en) | 2015-12-21 | 2016-12-20 | Compositions and methods for gene editing |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510971234.5A CN105483118A (zh) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105483118A true CN105483118A (zh) | 2016-04-13 |
Family
ID=55670392
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510971234.5A Pending CN105483118A (zh) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105483118A (zh) |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104611318A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-05-13 | 北京大学 | 一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法 |
CN106555011A (zh) * | 2016-07-18 | 2017-04-05 | 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司 | 基因检测或基因分型的组合物及方法 |
CN106566844A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-04-19 | 南通大学 | 一种下调真核基因表达的方法及其试剂盒 |
CN106589134A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-04-26 | 仪宏 | 嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用以及使用向导的嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用 |
WO2019041344A1 (en) * | 2017-09-04 | 2019-03-07 | Hebei University Of Science And Technology | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TRANSFECTION OF SINGLE STRANDED DNA |
WO2020232661A1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Sinobioway Bio-Agriculture Group Co., Ltd. | Abiotic stress tolerant plants and methods |
CN112941107A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用 |
WO2021130718A1 (en) | 2019-12-24 | 2021-07-01 | Selexis Sa | Targeted integration in mammalian sequences enhancing gene expression |
CN113416261A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-09-21 | 南通大学 | 格氏嗜盐碱杆菌Argonaute融合蛋白及其在标记DNA与RNA中的应用 |
CN113436679A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 北京合生基因科技有限公司 | 确定待测核酸样本变异率的方法和系统 |
CN113817804A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | 上海金匙医学检验实验室有限公司 | 一种测序文库自连接头消除的方法及应用 |
CN114606215A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-06-10 | 湖北大学 | 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
WO2022121301A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 湖北大学 | 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
CN115975985A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-04-18 | 湖北大学 | 一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用 |
CN117778377A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-03-29 | 湖北大学 | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103497241A (zh) * | 2013-09-10 | 2014-01-08 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA和用途 |
CN104805120A (zh) * | 2014-01-27 | 2015-07-29 | 苟德明 | 一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法 |
WO2015140347A1 (en) * | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Cellectis | Engineering mammalian genome using dna-guided argonaute interference systems (dais) |
WO2015157534A1 (en) * | 2014-04-10 | 2015-10-15 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for using argonaute to modify a single stranded target nucleic acid |
US20150315252A1 (en) * | 2013-06-11 | 2015-11-05 | Clontech Laboratories, Inc. | Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same |
-
2015
- 2015-12-21 CN CN201510971234.5A patent/CN105483118A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150315252A1 (en) * | 2013-06-11 | 2015-11-05 | Clontech Laboratories, Inc. | Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same |
CN103497241A (zh) * | 2013-09-10 | 2014-01-08 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA和用途 |
CN104805120A (zh) * | 2014-01-27 | 2015-07-29 | 苟德明 | 一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法 |
WO2015140347A1 (en) * | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Cellectis | Engineering mammalian genome using dna-guided argonaute interference systems (dais) |
WO2015157534A1 (en) * | 2014-04-10 | 2015-10-15 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for using argonaute to modify a single stranded target nucleic acid |
Cited By (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104611318A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-05-13 | 北京大学 | 一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法 |
CN104611318B (zh) * | 2014-12-18 | 2017-12-19 | 北京大学 | 一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法 |
CN106555011A (zh) * | 2016-07-18 | 2017-04-05 | 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司 | 基因检测或基因分型的组合物及方法 |
CN106555011B (zh) * | 2016-07-18 | 2023-12-19 | 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司 | 基因检测或基因分型的组合物及方法 |
CN106566844A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-04-19 | 南通大学 | 一种下调真核基因表达的方法及其试剂盒 |
CN106566844B (zh) * | 2016-11-02 | 2020-04-07 | 南通大学 | 一种下调真核基因表达的方法及其试剂盒 |
CN106589134A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-04-26 | 仪宏 | 嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用以及使用向导的嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用 |
CN106589134B (zh) * | 2016-11-11 | 2021-04-20 | 仪宏 | 嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用以及使用向导的嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用 |
WO2019041344A1 (en) * | 2017-09-04 | 2019-03-07 | Hebei University Of Science And Technology | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TRANSFECTION OF SINGLE STRANDED DNA |
WO2020232661A1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Sinobioway Bio-Agriculture Group Co., Ltd. | Abiotic stress tolerant plants and methods |
US11976289B2 (en) | 2019-05-22 | 2024-05-07 | Pioneer Overseas Corporation | Abiotic stress tolerant plants and methods |
WO2021130718A1 (en) | 2019-12-24 | 2021-07-01 | Selexis Sa | Targeted integration in mammalian sequences enhancing gene expression |
CN113436679A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 北京合生基因科技有限公司 | 确定待测核酸样本变异率的方法和系统 |
CN113436679B (zh) * | 2020-03-23 | 2024-05-10 | 北京合生基因科技有限公司 | 确定待测核酸样本变异率的方法和系统 |
WO2022121301A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 湖北大学 | 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
CN112941107A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用 |
CN112941107B (zh) * | 2021-04-01 | 2024-01-23 | 西北农林科技大学 | 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用 |
CN113416261A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-09-21 | 南通大学 | 格氏嗜盐碱杆菌Argonaute融合蛋白及其在标记DNA与RNA中的应用 |
CN113817804A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | 上海金匙医学检验实验室有限公司 | 一种测序文库自连接头消除的方法及应用 |
CN113817804B (zh) * | 2021-09-22 | 2024-03-08 | 上海金匙医学检验实验室有限公司 | 一种测序文库自连接头消除的方法及应用 |
CN114606215B (zh) * | 2022-01-24 | 2022-11-29 | 湖北大学 | 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
WO2023138082A1 (zh) * | 2022-01-24 | 2023-07-27 | 湖北大学 | 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
CN114606215A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-06-10 | 湖北大学 | 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用 |
CN115975985B (zh) * | 2022-10-14 | 2023-09-26 | 湖北大学 | 一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用 |
CN115975985A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-04-18 | 湖北大学 | 一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用 |
CN117778377A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-03-29 | 湖北大学 | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105483118A (zh) | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 | |
US10301613B2 (en) | Targeted remodeling of prokaryotic genomes using CRISPR-nickases | |
JP7201294B2 (ja) | 多重rna誘導型ゲノム編集 | |
KR101311619B1 (ko) | 클로스트리디아에서 dna 서열 대체 및 염색체 통합하기 위한 방법 | |
Kobayashi | Ribosomal RNA gene repeats, their stability and cellular senescence | |
CN108473998B (zh) | 用于以高效率从植物原生质体生成基因组工程改造的植物的方法 | |
CN106119269B (zh) | 一种在大肠杆菌中制备线性单链dna的方法 | |
CN104651401A (zh) | 一种mir-505双等位基因敲除的方法 | |
CN104212836A (zh) | 一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法 | |
CN110317828A (zh) | 修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法 | |
CN105543223A (zh) | 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 | |
US20240043876A1 (en) | Genome editing in archaea | |
CN105567718A (zh) | 一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法 | |
CN111876422B (zh) | 可用于富集CRISPR/Cas9介导的精确NHEJ修复细胞的筛选报告系统 | |
US20220298494A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
CN109295060A (zh) | 一种用于基因编辑的配对sgRNA及其应用 | |
JP2016103986A (ja) | 複数のユニットが多重に連結したdnaカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法 | |
JP2022549721A (ja) | 環状一本鎖ポリヌクレオチドを含む核酸送達ベクター | |
BR112021011983A2 (pt) | Bactérias clostridium geneticamente modificadas, preparação e utilização das mesmas | |
Ansai et al. | Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system | |
CN102399810A (zh) | 一种携带attB高效定向整合假attP位点的载体及其转基因方法 | |
CN111057717B (zh) | 快速制备可直接使用的gRNA表达载体的方法及其应用 | |
KR20230156665A (ko) | CRISPR-Cas9을 이용한 정교한 다중 유전체 편집 방법 및 이의 용도 | |
Swartjes et al. | Towards sequential conjugation-assisted laboratory evolution (SCALE) of Cas nucleases | |
CN117586987A (zh) | 一种单碱基编辑系统和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170109 Address after: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Applicant after: Zhejiang Univ. Applicant after: Hebei Univ. of Science and Technology Address before: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Applicant before: Zhejiang Univ. |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160413 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |