BR112021011983A2

BR112021011983A2 - Bactérias clostridium geneticamente modificadas, preparação e utilização das mesmas

Info

Publication number: BR112021011983A2
Application number: BR112021011983-3A
Authority: BR
Inventors: Rémi HOCQ; Gwladys Chartier; François Wasels; Nicolas Lopes Ferreira
Original assignee: IFP Energies Nouvelles
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-09-14
Also published as: FR3090691B1; FR3090691A1; EP3898970A1; WO2020128379A1; KR20210118826A; JP2022516025A; CA3123468A1; CN113614229A; US20230109758A1

Abstract

bactérias clostridium geneticamente modificadas, preparação e utilização das mesmas a presente invenção se refere à modificação genética de bactérias do gênero clostridium, tipicamente de bactérias solvogênicas do gênero clostridium, em particular de bactérias que possuam, no estado selvagem, um gene que codifica uma anfenicol-o-acetiltransferase. a mesma se refere, assim, a métodos, ferramentas e kits que permitem uma tal modificação genética, particularmente a eliminação ou a modificação de uma sequência de código ou que controle a transcrição de um anfenicol-o-acetiltransferase, as bactérias geneticamente modificadas obtidas e suas utilizações, particularmente para produzir um solvente, preferencialmente em escala industrial.

Description

BACTÉRIAS CLOSTRIDIUM GENETICAMENTE MODIFICADAS, PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO DAS MESMAS

[0001] A presente invenção se refere à modificação genética de bactérias do gênero Clostridium, tipicamente de bactérias solvogênias do gênero Clostridium, particularmente bactérias que possuam, em estado selvagem, um gene que codifica um anfenicol-O-acetiltranferase. A mesma se refere, desse modo, a métodos, ferramentas e kits que permitam uma tal modificação genética, particularmente a eliminação ou a modificação de uma sequência de código, ou controlando a transcrição de uma sequência de código, uma anfenicol-O- acetiltransferase, as bactérias geneticamente modificadas obtidas e suas utilizações, particularmente para produzir um solvente, de preferência em escala industrial.

ANTECEDENTES TECNOLÓGICOS

[0002] O gênero Clostridium contém as bactérias grampositivas, anaeróbicas estritas e esporulantes, que pertencem ao filo das Firmicutes. As Clostridia são um grupo importante para a comunidade científica por diversas razões. A primeira é que um certo número de doenças graves (por exemplo, tétano, botulismo) são devidas a infecções de membros patogênicos dessa família (Gonzales et al., 2014). A segunda é a possibilidade de utilizar as cepas ditas acidogênicas ou solvogênicas na biotecnologia (John & Wood, 1986, e Moon et al., 2016). Essas Clostridia, não patogênicas, têm naturalmente a capacidade de transformar uma variedade importante de açúcares para produzir compostos químicos de interesse, e mais particularmente de acetona, butanol e etanol (John & Wood, 1986) ao longo de um processo de fermentação dito ABE. De modo semelhante, a fermentação IBE é possível em certas espécies particulares, no momento em que a acetona é reduzida em uma proporção variável a isopropanol (Chen et al., 1986, George et al., 1983) graças à presença no genoma dessas cepas de genes que codificam álcool desidrogenases secundárias (s-ADH; Ismael et al., 1993, Hiu et al., 1987). As espécies de Clostridia solvogênicas apresentam similaridades fenotípicas importantes, o que torna difícil sua classificação antes da emergência das técnicas de sequenciação moderna (Rogers et al., 2006). Com a possibilidade de sequenciar os genomas completos dessa bactérias, hoje é possível classificar esse gênero de bactérias em 4 espécies maiores: C. acetobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum e C. beijerinckii. Uma publicação recente permitiu classificar essa Clostridia solvogênica em 4 clados principais após análise comparativa de genomas completos de 30 cepas (Figura 1).

[0003] Esses grupos separam, notavelmente, as espécies que são C. acetobutylicum e C. beijerinckii com, como respectivas referências, C. acetobutylicum ATCC 824 (também designado DSM 792 ou ainda LMG 5710) e C. beijerinckii NCIMB 8052 que são as cepas modelo para o estudo da fermentação do tipo ABE.

[0004] As cepas de Clostridium naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE são pouco numerosas e pertencem majoritariamente à espécie Clostridium beijerinckii (ver Zhang et al., 2018, Tabela 1). Essas cepas são tipicamente selecionadas dentre as cepas C. butylicum LMD 27.6, C. aurantibutylicum NCIB 10659, C. beijerinckii

LMD 27.6, C. beijerinckii VPI2968, C. beijerinckii NRRL B- 593, C. beijerinckii ATCC 6014, C. beijerinckii McClung 3081, C. isopropylicum IAM 19239, C. beijerinckii DSM 6423, C. sp. A1424, C. beijerinckii optinoii, e C. beijerinckii BGS1.

[0005] Todavia, não existe atualmente uma cepa de bactéria Clostridium naturalmente com capacidade para produzir isopropanol, em particular naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE, que tenha sido modificada geneticamente de modo a se tornar sensível a um antibiótico que pertença à classe de anfenicois, tal como o cloroanfenicol ou o tiamfenicol, de preferência para permitir a produção otimizada de isopropanol.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0006] Os inventores descrevem, no contexto da presente invenção e pela primeira vez, uma bactéria C. beijerinckii geneticamente modificada, assim como as ferramentas que permitem uma modificação genética de bactérias do gênero Clostridium, tipicamente de bactérias solvogênicas do gênero Clostridium naturalmente (isto é, no estado selvagem) capazes de produzir isopropanol, em particular naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE, em particular bactérias que compreendam, no estado selvagem, um gene que confira à bactéria a resistência a um ou vários antibióticos, em particular um gene que codifica uma anfenicol-O-transferase, por exemplo, uma cloroanfenicol-O- acetiltransferase ou um tianfenicol-O-acetiltransferase.

[0007] Uma bactéria geneticamente modificada preferida segundo a invenção é uma bactéria que não exprime uma enzima que a confere resistência a um ou mais antibióticos, em particular uma bactéria que não exprime um anfenicol-O-

transferase, por exemplo, uma bactéria desprovida do gene catB ou incapaz de exprimir o dito gene.

[0008] Uma bactéria geneticamente modificada preferida segundo a invenção é a bactéria identificada na presente descrição como C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB tal como é registrada sob o número de depósito LMG P-31151 (também identificada como Clostridium beijerinckii IFP962 delta catB) junto à Belgian Co-ordinated Collections of Micro- organisms ("BCCM", K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Bélgica) em 6 de dezembro de 2018. A descrição se refere também a toda bactéria derivada, clone, mutante ou versão geneticamente modifica desta.

[0009] Um objeto particular descrito pelo inventores é um ácido nucleico que reconhece (ligado pelo menos em parte), e de preferência marcando, isto é, reconhecendo e permitindo o corte, em um genoma de uma bactéria de interesse, pelo menos de um ramo i) de uma sequência de código, ii) de uma sequência que controla a transcrição de uma sequência de código, ou iii) de uma sequência que flanqueia a sequência de código, uma enzima que permite à dita bactéria de interesse crescer em um meio de cultura que contém um antibiótico, tipicamente um antibiótico que pertence à classe de anfenicois, de preferência selecionados dentre o cloroanfenicol, o tianfenicol, o azidanfenicol e o florfenicol, tipicamente um anfenicol-O-acetiltransferase, tal como um cloroanfenicol-O-acetiltransferase.

[0010] Os inventores também descrevem a utilização de um tal ácido nucleico para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria do gênero Clostridium, de preferência uma bactéria do gênero Clostridium com capacidade para naturalmente produzir o isopropanol, em particular uma bactéria do gênero Clostridium com capacidade para efetuar uma fermentação IBE.

[0011] Os inventores descrevem particularmente a utilização de um ácido nucleico que reconhece o gene catB da sequência SEQ ID NO: 18 ou uma sequência idêntica a pelo menos 70% desta no seio do genoma de C. beijerinckii DSM 6423 para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria C. beijerinckii DSM 6423.

[0012] A bactéria com capacidade para produzir o isopropanol em estado selvagem pode ser, por exemplo, uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum, uma bactéria C. butyricum, uma bactéria C. saccharoperbutylacetonicum, uma bactéria C. botulinum, uma bactéria C. drakei, uma bactéria C. scatologenes, uma bactéria C. perfringens, e uma bactéria C. tunisiense, de preferência uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum e uma bactéria C. saccharoperbutylacetonicum. Uma bactéria com capacidade para produzir naturalmente o isopropanol particularmente preferido é uma bactéria C. beijerinckii.

[0013] De acordo com um aspecto particular, o ácido nucleico que reconhece, e de preferência marca, i) uma sequência que codifica uma anfenicol-O-acetiltransferase, ii) uma sequência que controla a transcrição de uma tal sequência, ou iii) uma sequência que flanqueia uma tal sequência, é utilizada para transformar um sub-clado de C. beijerinckii selecionado dentre DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815,

NRRL B-593, NCCB 27006 e um sub-clado que apresente ao menos 97% de identidade com a cepa DSM 6423.

[0014] Os inventores descrevem, aliás, um processo para transformar, e de preferência modificar geneticamente, uma bactéria do gênero Clostridium. Esse processo compreende uma etapa de transformação da dita bactéria para introduzir nessa bactéria um ácido nucleico que reconhece, e de preferência que marque, i) uma sequência de código, ii) uma sequência que controla a transcrição de uma sequência de código, ou iii) uma sequência que flanqueia uma sequência de código, uma enzima de interesse, de preferência uma anfenicol-O- acetiltransferase. Esse processo é tipicamente realizado com a ajuda de uma ferramenta de modificação genética, por exemplo, com ajuda de uma ferramenta de modificação genética selecionada dentre uma ferramenta CRISPR, uma ferramenta baseada na utilização de íntrons do tipo II e uma ferramenta de troca alélica. Também são descritas as bactérias transformadas e modificadas geneticamente com ajuda de um tal processo, cuja bactéria C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB é um exemplo.

[0015] Um outro aspecto descrito pelo inventores se refere à utilização de uma bactéria modificada geneticamente de acordo com a invenção, de preferência da bactéria C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB tal como registrada sob o número de depósito LMG P-31151, ou de uma versão geneticamente modificada da mesma, para produzir solvente, de preferência isopropanol, ou uma mistura de solventes, de preferência em escala industrial.

[0016] A descrição se refere, enfim, a kits, em particular a um kit que compreenda um ácido nucleico descrito no presente texto e uma ferramenta de modificação genética, em particular uma ferramenta de modificação genética selecionada dentre os elementos de uma ferramenta genética selecionada dentre uma ferramenta CRISPR, uma ferramenta baseada na utilização de íntrons do tipo II e uma ferramenta de troca alélica; um ácido nucleico tal como um RNA guia (gRNA); um ácido nucleico tal como uma matriz de reparação; pelo menos um par de iniciadores; e um indutor que permite a expressão de uma proteína codificada pela dita ferramenta.

RELATÓRIO DESCRITIVO DA INVENÇÃO

[0017] Ainda que utilizados industrialmente há mais de um século, os conhecimentos sobre as bactérias que pertencem ao gênero Clostridium são limitados por dificuldades encontradas na sua modificação genética. Diferentes ferramentas genéticas foram concebidas ao longo dos últimos anos para otimizar as cepas desse gênero, tendo sido a última geração baseada na utilização da tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats)/Cas (CRISPR-associated protein). Esse método é baseado no emprego de uma enzima chamada nuclease (tipicamente uma nuclease do tipo Cas no caso da ferramenta genética CRISPR/Cas, tal como a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes), que, guiada por uma molécula de RNA, vai realizar um corte de fita dupla no seio de uma molécula de DNA (sequência marca de interesse). A sequência de RNA guia (gRNA) determinará o locus do corte da nuclease, conferindo-lhe assim uma especificidade mais forte (Figura 17).

[0018] Sendo um corte de fita dupla no seio de uma molécula de DNA indispensável letal para um organismo, a sobrevivência desse último dependerá de sua capacidade de repará-la (ver, por exemplo, Cui & Bikard, 2016). Nas bactérias do gênero Clostridium, a reparação de um corte de fita dupla depende de um mecanismo de recombinação homóloga que necessita de uma cópia intacta da sequência clivada. Ao fornecer à bactéria um fragmento de DNA que permite efetuar essa reparação ao mesmo tempo que modifica a sequência original é possível forçar o microrganismo a ser integrado nas mudanças desejas no seio de seu genoma. A modificação realizada não deve mais permitir a marcação do DNA genômico pelo complexo ribonucleoproteico Cas9-gRNA, via modificação da sequência marca ou do locus PAM (Figura 18).

[0019] Diferentes abordagens foram descritas para tentar tornar funcional essa ferramenta genética no seio de bactérias do gênero Clostridium. Esses microrganismos foram, de fato, conhecidos por ser difíceis de modificar geneticamente em razão de suas fracas frequências de transformação e de recombinação homóloga. Algumas abordagens são baseadas no emprego de Cas9, expressas de modo constitutivo em C. beijerinckii et C. ljungdahlii (Wang et al, 2015; Huang et al, 2016) ou sob controle de um promotor indutivo em C. beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum e C. authoethanogenum (Wang et al, 2016; Nagaraju et al, 2016; Wang et al, 2017). Outros autores descreveram a utilização de uma versão modificada da nuclease, Cas9n, que realiza cortes de fita simples, ao invés de corte de fita dupla, no seio do genoma (Xu et al, 2015; Li et al, 2016). Essa escolha se deve às observações segundo as quais a toxidade do Cas9 é importante demais para sua utilização nas bactérias do gênero Clostridium nas condições experimentais testadas. A maioria das ferramentas descritas precedentemente repousam sobre a utilização de um único plasmídeo. Enfim, é igualmente possível utilizar sistemas CRISPR/Cas endógenas quando as mesmas forem determinadas no seio de um genoma do microrganismo, como por exemplo em C. pasteurianum (Pyne et al, 2016).

[0020] A menos que se utilize (como no último caso descrito acima) a maquinaria endógena da cepa a ser modificada, as ferramentas baseadas na tecnologia CRISPR apresentam o inconveniente maior de limitar significativamente o tamanho do ácido nucleico de interesse (e então o número de sequências de código ou genes) suscetíveis de serem inseridas no genoma bacteriano (no máximo cerca de 1,8 kb segundo Xu et al., 2015).

[0021] Os inventores focaram e descreveram uma ferramenta genética com melhor desempenho de modificação de bactérias, adaptadas às bactérias, tipicamente às bactérias que pertencem ao filo das Firmicutes, particularmente às bactérias do gênero Clostridium, baseadas na utilização de dois ácidos nucleicos distintos, tipicamente de dois plasmídeos (ver WO2017064439, Wasels et al., 2017 e Figura 3) que resolvem notavelmente esse problema. Em um modo de realização particular, o primeiro ácido nucleico dessa ferramenta permite a expressão de cas9 e um segundo ácido nucleico, específico da modificação a ser efetuada, contém um ou mais cassetes de expressão de gRNA tanto quanto uma matriz de reparação que permite a substituição de uma porção de DNA bacteriano marcado pelo Cas9 por uma sequência de interesse. A toxicidade do sistema é limitada ao se colocar cas9 e/ou o(s) cassete(s) de expressão de gRNA sob o controle de promotores indutíveis. Os inventores recentemente melhoraram essa ferramenta que permite aumentar muito significativamente a eficácia de transformação e logo a obtenção, em número e quantidade útil (em particular em um contexto de seleção de cepas robustas para uma produção em escala industrial), de bactérias geneticamente modificadas de interesse (ver FR 18/54835). Nessa ferramenta melhorada pelo menos um ácido nucleico compreende uma sequência que codifica uma proteína anti-CRIPR ("acr"), colocada sob o controle de um promotor indutível. Essa proteína anti-CRISPR permite reprimir a atividade do complexo endonuclease de DNA/RNA guia. A expressão da proteína é regulada para permitir sua expressão unicamente ao longo da sua etapa de transformação da bactéria.

[0022] Por bactéria que pertence ao filo das Firmicutes entende-se, no contexto da presente descrição, as bactérias que pertencem à classe das Clostridia, Mollicutes, Bacilli ou das Togobacteria, de preferência à classe das Clostridia ou das Bacilli.

[0023] As bactérias particulares que pertencem ao filo das Firmicutes compreendem, por exemplo, as bactérias do gênero Clostridium, as bactérias do gênero Bacillus ou as bactérias do gênero Lactobacillus.

[0024] Por "bactéria do gênero Bacillus", entende-se particularmente B. amyloliquefaciens, B. thurigiensis, B. coagulans, B. cereus, B. anthracis ou ainda B. subtilis.

[0025] Por "bactéria do gênero Clostridium", entende-se particularmente as espécies de Clostridium ditas de interesse industrial, tipicamente as bactérias solvogênicas ou acetogênicas do gênero Clostridium. A expressão "bactéria do gênero Clostridium" engloba as bactérias selvagens tanto quanto as cepas derivadas destas, modificadas geneticamente a fim de melhorar seu desempenho (por exemplo, superexprimindo os genes ctfA, ctfB et adc) sem terem sido expostas ao sistema CRISPR.

[0026] Por "espécie de Clostridium de interesse industrial", entendem-se as espécies com capacidade para produzir, por fermentação, solventes e ácidos tais como o ácido butírico ou o ácido acético, a partir de açúcares ou de óleos, tipicamente a partir de sucos que contenham 5 átomos de carbono tais como a xilose, a arabinose ou a frutose, açúcares que contenham 6 átomos de carbono tais como a glucose ou a manose, de poliósidos tais como a celulose ou as hemiceluloses e/ou qualquer outro açúcar de carbono assimilável e utilizável por bactérias do gênero Clostridium (CO, CO2 e metanol, por exemplo). Exemplos de bactérias solvogênicas de interesse são as bactérias do gênero Clostridium produtoras de acetona, de butanol, de etanol e/ou isopropanol, tais como as cepas identificadas na literatura como "cepa ABE" [cepas que realizam fermentações que permitem a produção de acetona, de butanol e de etanol] e "cepa IBE" [cepas que realizam fermentações que permitem a produção de isopropanol (por redução de acetona), de butanol e de etanol]. Bactérias solvogênicas do gênero Clostridium podem ser selecionadas, por exemplo, dentre C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytoferm–entans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum e C. tyrobutyricum, preferencialmente dentre C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C.

tyrobutyricum e C. cellulolyticum, e ainda mais preferencialmente dentre C. acetobutylicum e C. beijerinckii.

[0027] As bactérias do gênero Clostridium naturalmente produtoras de isopropanol, tipicamente possuem em seu genoma um gene adh que codifica um álcool-desidrogenase primário/secundário que permite a redução da acetona em isopropanol, distinguindo-se ao mesmo tempo geneticamente e funcionalmente das bactérias capazes, em seu estado natural, de uma fermentação ABE.

[0028] Os inventores foram vantajosamente bem-sucedidos, no contexto da presente invenção, em modificar geneticamente uma bactéria do gênero Clostridium naturalmente produtora de isopropanol, a bactéria C. beijerinckii DSM 6423, assim como a cepa de referência C. acetobutylicum DSM 792.

[0029] Os inventores descrevem assim, pela primeira vez, uma bactéria solvogênica do gênero Clostridum naturalmente (isto é, no estado selvagem) com capacidade para produzir o isopropanol, em particular naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE, que foi modificada geneticamente, assim como as ferramentas, particularmente as ferramentas genéticas, o que permitiu sua obtenção. Essas ferramentas apresentam a vantagem de facilitar consideravelmente a transformação e a modificação genética das bactérias capazes, em seu estado selvagem, de produzir o isopropanol, particularmente de efetuar uma fermentação IBE, particularmente essas que portam o gene que codifica uma enzima responsável pela resistência a um antibiótico.

[0030] Uma parte dos trabalhos descritos na parte experimental foram realizados no seio de uma cepa com capacidade para fermentação IBE, isto é, a cepa C. beijerinckii DSM 6423 cujo genoma e uma análise transcriptômica foram descritas recentemente pelos inventores (Maté de Gerando et al., 2018).

[0031] No momento da reunião do genoma dessa cepa, os inventores descobriram particularmente, além do cromossomo, a presença de elementos geneticamente móveis (número de acesso PRJEB11626 - https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626): dois plasmídeos naturais (pNF1 e pNF2) e um bacteriófago linear (Φ6423).

[0032] Em um modo de realização particular da invenção, os inventores foram bem-sucedidos em apagar da cepa C. beijerinckii DSM 6423 seu plasmídeo natural pNF2.

[0033] Em um outro modo de realização particular, eles foram bem-sucedidos em apagar o gene upp na origem presente sobre o cromossomo da cepa C. beijerinckii DSM 6423. Essas experiências demonstram, assim, a possível utilização de ferramentas e, mais geralmente, da tecnologia descrita no presente texto pelos inventores para modificar geneticamente uma bactéria capaz, no estado selvagem, de produzir o isopropanol, particularmente de efetuar uma fermentação IBE.

[0034] Em um modo de realização particularmente vantajoso, os inventores foram particularmente bem sucedidos em tornar sensível a um anfenicol uma bactéria que porta naturalmente (portadora no estado selvagem) de um gene que codifica uma enzima responsável pela resistência a esses antibióticos.

[0035] Exemplos de anfenicóis de interesse no contexto da invenção são o cloroanfenicol, o tianfenicol, o azidanfenicol e o florfenicol (Schwarz S. et al., 2004), particularmente o clorofencol e o tianfenicol.

[0036] Um primeiro aspecto da invenção se refere, assim, a uma ferramenta genética utilizável para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria de interesse, tipicamente uma bactéria tal como descrito no presente texto que pertence ao filo das Firmicutes, por exemplo, uma bactéria do gênero Clostridium, do gênero Bacillus ou do gênero Lactobacillus, de preferência uma bactéria solvogênica do gênero Clostridium naturalmente (isto é, no estado selvagem) com capacidade para produzir isopropanol, em particular naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE, de preferência uma bactéria naturalmente resistente a um ou mais antibióticos, tal como uma bactéria C. beijerinckii. Uma bactéria de preferência possui, no estado selvagem, de uma vez um cromossomo bacteriano e pelo menos uma molécula de DNA distinta do DNA cromossômico.

[0037] De acordo com um aspecto particular, essa ferramenta genética consiste em um ácido nucleico (também identificado no presente texto como "ácido nucleico de interesse") que reconhece (ligado ao menos em parte), e de preferência marcante, isto é, que reconhece e permite o corte, no genoma de uma bactéria de interesse, de pelo menos um ramo i) de uma sequência que codifica uma enzima que permite à bactéria de interesse de crescer em um meio de cultura que contém um antibiótico diante do qual a mesma lhe confere uma resistência, ii) de uma sequência que controla a transcrição de uma sequência que codifica uma enzima que permite à bactéria de interesse de crescer em um meio de cultura que contenha um antibiótico diante do qual a mesma lhe confere uma resistência, ou iii) de uma sequência que flanqueia uma sequência que codifica uma enzima que permite à bactéria de interesse crescer em um meio de cultura que contém um antibiótico diante do qual a mesma lhe confere uma resistência. Esse ácido nucleico de interesse é utilizado tipicamento no contexto da presente invenção para apagar a sequência reconhecida do genoma da bactéria ou para modificar sua expressão, por exemplo, para modular/regular sua expressão, por exemplo, para modular/regular sua expressão, em particular inibi-la, de preferência para modificá-la de modo a tornar a dita bactéria incapaz de exprimir uma proteína, em particular uma proteína funcional, a partir da dita sequência. A sequência reconhecida é igualmente identificada no presente texto enquanto "sequência marca" ou "sequência marcada".

[0038] Em um modo de realização particular, o ácido nucleico de interesse compreende pelo menos uma região complementar da sequência marca idêntica à 100% ou idêntica a 80% pelo menos, de preferência a 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% pelo menos na região/porção/sequência de DNA marcado no seio do genoma bacteriano e tem capacidade para se hibridizar em toda ou parte da sequência complementar da dita região/porção/sequência, tipicamente a uma sequência que compreende pelo menos 1 nucleotídeo, de preferência pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos, tipicamente entre 1, 10 ou 20 e 1000 nucleotídeos, por exemplo, entre 1, 10 ou 20 e 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucleotídeos, entre 1, 10 ou 20 e 100 nucleotídeos, entre 1, 10 ou 20 e 50 nucleotídeos, ou entre 1, 10 ou 20 e 40 nucleotídeos, entre 10 e 40 nucleotídeos, entre 10 e 30 nucleotídeos, entre 10 e 20 nucleotídeos, entre 20 e 30 nucleotídeos, entre 15 e 40 nucleotídeos, entre 15 e 30 nucleotídeos ou entre 15 e 20 nucleotídeos, de preferência uma sequência que compreenda 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. A região complementar da sequência marca presente no seio do ácido nucleico de interesse pode corresponder à região "SDS" de um RNA guia (gRNA) utilizado em uma ferramenta CRISPR tal como descrito no presente texto.

[0039] Em um outro modo de realização particular, o ácido nucleico de interesse compreende pelo menos duas regiões complementares, cada uma sequência marca, idênticas a 100% ou idênticas a 80% pelo menos, de preferência a 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% pelo menos na dita região/porção/sequência de DNA marcada no seio do genoma bacteriano. Essas regiões têm capacidade para se hibridizar em toda ou parcialmente na sequência complementar da dita região/porção/sequência, tipicamente a uma sequência tal como descrito acima que compreenda pelo menos 1 nucleotídeo, tipicamente pelo menos 100 nucleotídeos, tipicamente entre 100 e 1000 nucleotídeos. As regiões complementares da sequência marca presentes no seio do ácido nucleico de interesse podem reconhecer, de preferência marcar, as regiões que flanqueiam em 5' e 3' da sequência marcada em uma ferramenta de modificação genética tal como descrito no presente texto, por exemplo, a ferramenta genética ClosTron®, a ferramenta genética Targetron® ou uma ferramenta de troca alélica tipo ACE®.

[0040] Tipicamente, a sequência marca é uma sequência que codifica uma anfenicol-O-acetiltransferase, por exemplo, uma cloroanfenicol-O-acetiltransferase ou uma tianfenicol-O- acetiltransferase, que controla a transcrição de uma tal sequência ou que flanqueiam uma tal sequência, no seio do genoma de uma bactéria de interesse do gênero Clostridium com capacidade para crescer em um meio de cultura contendo um ou mais antibióticos que pertencem à classe dos anfenicóis, por exemplo, o cloroanfenicol e/ou o tiamfenicol.

[0041] Em um modo de realização particular, a sequência reconhecida é a sequência SEQ ID NO: 18 que corresponde ao gene catB (CIBE_3859) que codifica uma cloroanfenicol-O- acetiltransferase de C. beijerinckii DSM 6423 ou uma sequência de aminoácidos idêntica a pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à dita cloroanfenicol-O- acetiltransferase, ou uma sequência que compreende tudo ou pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência SEQ ID NO: 18. Em outras palavras, a sequência reconhecida pode ser uma sequência que compreende pelo menos 1 nucleotídeo, de preferência pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos, tipicamente, entre 1 e 40 nucleotídeos, de preferência uma sequência que compreende 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos da sequência SEQ ID NO:

18.

[0042] Exemplos de sequências de aminoácidos idênticas a pelo menos 70% à cloroanfenicol-O-acetiltransferase codificada pela sequência SEQ ID NO: 18 correspondem à sequência identificada na base de dados NCBI sob as referências que seguem: WP_077843937.1, SEQ ID NO: 44 (WP_063843219.1), SEQ ID NO: 45 (WP_078116092.1), SEQ ID NO:

46 (WP_077840383.1), SEQ ID NO: 47 (WP_077307770.1), SEQ ID NO: 48 (WP_103699368.1), SEQ ID NO: 49 (WP_087701812.1), SEQ ID NO: 50 (WP_017210112.1), SEQ ID NO: 51 (WP_077831818.1), SEQ ID NO: 52 (WP_012059398.1), SEQ ID NO: 53 (WP_077363893.1), SEQ ID NO: 54 (WP_015393553.1), SEQ ID NO: 55 (WP_023973814.1), SEQ ID NO: 56 (WP_026887895.1), SEQ ID NO 57 (AWK51568.1), SEQ ID NO: 58 (WP_003359882.1), SEQ ID NO: 59 (WP_091687918.1), SEQ ID NO: 60 (WP_055668544.1), SEQ ID NO: 61 (KGK90159.1), SEQ ID NO: 62 (WP_032079033.1), SEQ ID NO: 63 (WP_029163167.1), SEQ ID NO: 64 (WP_017414356.1), SEQ ID NO: 65 (WP_073285202.1), SEQ ID NO: 66 (WP_063843220.1), e SEQ ID NO: 67 (WP_021281995.1).

[0043] Exemplos de sequências de aminoácidos idênticas a pelo menos 75% à cloroanfenicol-O-acetiltransferase codificada pela sequência SEQ ID NO: 18 correspondem às sequências WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 AWK51568.1, WP_003359882.1, WP_091687918.1, WP_055668544.1 e KGK90159.1.

[0044] Exemplos de sequências de aminoácidos idênticas a pelo menos 90 % à cloroanfenicol-O-acetiltransferase codificada pela sequência SEQ ID NO: 18, são as sequências WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 e AWK51568.1.

[0045] Exemplos de sequências de aminoácidos idênticas a pelo menos 95 % à cloroanfenicol-O-acetiltransferase codificada pela sequência SEQ ID NO: 18 correspondem às sequências WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, e WP_026887895.1.

[0046] Exemplos de sequências de aminoácidos idênticas a pelo menos 99% à cloroanfenicol-O-acetiltransferase codificada pela sequência SEQ ID NO: 18, são as sequências WP_077843937.1, SEQ ID NO: 44 (WP_063843219.1) e SEQ ID NO: 45 (WP_078116092.1).

[0047] Uma sequência particular idêntica à sequência SEQ ID NO: 18 é a sequência identificada na base de dados NCBI sob a referência WP_077843937.1.

[0048] Em um modo de realização particular, a sequência marca é a sequência SEQ ID NO: 68 que corresponde ao gene catQ que codifica uma cloroanfenicol-O-acetiltransferase de C. perfringens cuja sequência de aminoácidos corresponde à SEQ ID NO: 66 (WP_063843220.1), ou uma sequência idêntica a pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% a dita cloroanfenicol-O-acetiltransferase, ou uma sequência que compreende tudo ou pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência SEQ ID NO: 68.

[0049] Em outras palavras, a sequência reconhecida pode ser uma sequência que compreende pelo menos 1 nucleotídeo, de preferência pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos, tipicamente, entre 1 e 40 nucleotídeos, de preferência uma sequência que compreende 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29 ou 30 nucleotídeos da sequência SEQ ID NO: 68.

[0050] Em ainda outro modo de realização particular, a sequência reconhecida é selecionada dentre uma sequência de ácidos nucleicos catB (SEQ ID NO: 18), catQ (SEQ ID NO 68), catD (SEQ ID NO: 69, Schwarz S. et al., 2004) ou catP (SEQ ID NO: 70, Schwarz S. et al., 2004) conhecido pelo versado na técnica, presente naturalmente no seio de uma bactéria do gênero Clostridium ou introduzida artificialmente em uma tal bactéria.

[0051] Conforme indicado anteriormente, segundo um outro modo de realização, a sequência marca pode ser também uma sequência que controla a transcrição de uma sequência que codifica tal como descrito anteriormente (codificando uma enzima que permite à bactéria de interesse crescer em um meio de cultura que contém um antibiótico para o qual a mesma tem resistência), tipicamente uma sequência promotora, por exemplo, a sequência promotora (SEQ ID NO: 73) do gene catB ou aquela (SEQ ID NO: 74) do gene catQ.

[0052] O ácido nucleico de interesse, utilizado como ferramenta genética, reconhece assim, e então tipicamente tem capacidade para se ligar a uma sequência que controla a transcrição de uma sequência tal como descrito precedentemente.

[0053] Segundo um outro modo de realização, a sequência marca pode ser uma sequência que flanqueia uma sequência que codifica tal como descrito precedentemente (que codifica uma enzima que permite à bactéria de interesse crescer em um meio de cultura que contém um antibiótico para o qual a mesma tem resistência), por exemplo, uma sequência que flanqueia o gene catB de sequência SEQ ID NO: 18 ou uma sequência idêntica a ou pelo menos 70% desta. Uma tal sequência que a flanqueia compreende tipicamente 1, 10 ou 20 e 1000 nucleotídeos, por exemplo, entre 1, 10 ou 20 e 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucleotídeos, entre 1, 10 ou 20 e 100 nucleotídeos, entre 1, 10 ou 20 e 50 nucleotídeos, ou entre 1, 10 ou 20 e 40 nucleotídeos, por exemplo entre 10 e 40 nucleotídeos, entre 10 e 30 nucleotídeos, entre 10 e 20 nucleotídeos, entre 20 e 30 nucleotídeos, entre 15 e 40 nucleotídeos, entre 15 e 30 nucleotídeos ou entre 15 e 20 nucleotídeos. Segundo um aspecto particular, a sequência marca corresponde ao par de sequências que flanqueiam uma tal sequência de código, cada sequência flanqueadora compreendendo tipicamente ao menos 20 nucleotídeos, tipicamente entre 100 e 1000 nucleotídeos, de preferência entre 200 e 800 nucleotídeos.

[0054] Por "ácido nucleico" entende-se, no sentido da invenção, toda molécula de DNA ou de RNA natural, sintética, semi-sintética ou recombinada, eventualmente modificada quimicamente (isto é, compreendendo bases não naturais, nucleotídeos modificados que compreendem, por exemplo, uma ligação modificada, bases modificadas e/ou açúcares modificados), ou otimizado de modo a que os códons das transcrições sintetizadas a partir das sequências de códigos sejam os códons mais frequentemente encontrados em uma bactéria do gênero Clostridium em vista de sua utilização na mesma. No caso do gênero Clostridium, os códons otimizados são tipicamente códons otimizados ricos em bases adeninas ("A") e timinas ("T").

[0055] Nas sequências peptídicas descritas nesse documento, os aminoácidos são representados por seu código de uma letra segundo a nomenclatura seguinte: C: cisteína; D: ácido aspártico; E: ácido glutâmico; F: fenilalanina; G: glicina; H: histidina; I: isoleucina; K: lisina; L: leucina; M: metionina; N: asparagina; P: prolina; Q: glutamina; R: arginina; S: serina; T: treonina; V: valina; W: triptofano e Y: tirosina.

[0056] No contexto da presente invenção, o ácido nucleico de interesse, utilizado como ferramenta genética para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria de interesse, é um fragmento de DNA i) que reconhece uma sequência de código, ii) que controla a transcrição de uma sequência de código, ou iii) flanqueando uma sequência de código, uma enzima de interesse, de preferência uma anfeniocol-O-acetiltransferase, por exemplo, uma cloroanfenicol-O-acetiltransferase, no seio de um genoma de uma bactéria do gênero Clostridium, particularmente de uma bactéria solvogênica do gênero Clostridium naturalmente com capacidade para produzir o isopropanol, particularmente naturalmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE.

[0057] A bactéria com capacidade para produzir naturalmente isopropanol pode ser, por exemplo, uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum, uma bactéria C. butyricum, uma bactéria C. saccharoperbutylacetonicum, uma bactéria C. botulinum, uma bactéria C. drakei, uma bactéria C. scatologenes, uma bactéria C. perfringens, et uma bactéria C. tunisiense, de preferência uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum e uma bactéria

C. saccharoperbutylacetonicum. Uma bactéria com capacidade para produzir o isopropanol, no estado selvagem, particularmente preferida é uma bactéria C. beijerinckii.

[0058] Segundo um aspecto particular, a bactéria do gênero Clostridium é uma bactéria C. beijerinckii cujo sub- clado é selecionado dentre DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NCCB 27006 e um sub-clado que apresenta pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a cepa DSM 6423.

[0059] Como indicado anteriormente, o ácido nucleico de interesse de acordo com a invenção tem capacidade para apagar a sequência ("sequência marca") reconhecida do genoma da bactéria ou de modificar sua expressão, por exemplo, de modulá-la, em particular de inibí-la, de preferência modificá-la de modo a tornar a dita bactéria incapaz de exprimir uma proteína, de preferência uma anfenicol-O- acetiltransferase, em particular uma proteína funcional, a partir da dita sequência.

[0060] Esse ácido nucleico de interesse se apresenta tipicamente sob a forma de um cassete de expressão (ou "construção") tal como, por exemplo, um ácido nucleico que compreende um promotor transcricional ligado de modo operacional (no sentido em que o entende o versado na técnica) de interesse, por exemplo, um operon que compreende várias sequências de código de interesse cujos produtos de expressão concorrem ao seio da bactéria, ou um ácido nucleico que compreende, além disso, uma sequência ativadora e/ou um terminador de transcrição; ou sob a forma de um vetor, circular ou linear, simples ou dupla fita, por exemplo um plasmídeo, um fago, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou sintético, que compreende um ou mais cassetes de expressão tais como definido abaixo. Preferencialmente, o vetor é um plasmídeo.

[0061] Os ácidos nucleicos de interesse, tipicamente os cassetes ou vetores, podem ser construídos por técnicas clássicas bem conhecidas pelo versado na técnica e podem comportar um ou mais promotores, origens de replicação bacteriana (sequências ORI), sequências de terminação, genes de seleção, por exemplo genes de resistência a um antibiótico, e sequência(s) (por exemplo "região(ões) flanqueada(s)") que permitam a inserção marcada da fita ou do vetor. Aliás, esses cassetes e vetores de expressão podem ser integrados no seio do genoma por técnicas bem conhecidas pelo versado na técnica.

[0062] Sequências ORI de interesse podem ser escolhidas dentre pIP404, pAMβl, pCB102, repH (origem de replicação em C. acetobutylicum), ColE1 ou rep (origem de replicação em E. colï), ou qualquer outra origem de replicação que permita manter o vetor, tipicamente do plasmídeo, no seio de uma célula de Clostridium.

[0063] Sequências de terminação de interesse podem ser escolhidas dentre aqueles genes adc, thl, do operon bcs, ou de qualquer outro terminador, bem conhecidos pelo versado na técnica, que permite parar a transcrição no seio do Clostridium.

[0064] Genes de seleção (genes de resistência) de interesse podem ser escolhidos dentre ermB, catP, bla, tetA, tetM, e/ou todo outro gene de resistência a ampicilina, a eritromicina, a cloranfenicol, a tianfenicol, a tetraciclina ou qualquer outro antibiótico que possa ser utilizado para selecionar bactérias do gênero Clostridium bem conhecidos pelo versado na técnica.

[0065] Em um modo de realização particular em que a sequência reconhecida que codifica uma enzima é uma sequência que confere à bactéria uma resistência ao cloranfenicol e/ou ao tianfenicol, o gene de seleção usado não é um gene de resistência ao cloroanfenicol e/ou ao tianfenicol, e não é de preferência nenhum dos genes catB, catQ, catD ou catP.

[0066] Em um modo de realização particular, o ácido nucleico de interesse compreende um ou vários RNA guias (gRNA) marcando uma sequência ("sequência marca", "sequência marcada" ou "sequência reconhecida") de código, que controla a transcrição de uma sequência de código, ou flanqueia uma sequência de código, uma enzima de interesse, em particular uma anfenicol-O-acetiltransferase, e/ou uma matriz de modificação (também identificada no presente texto como "matriz de edição"), por exemplo, uma matriz que permite eliminar ou modificar toda ou uma parte da sequência marcada, de preferência no sentido de inibir ou apagar a expressão da sequência marca, tipicamente uma matriz que compreende sequências homólogas (correspondentes) às sequências situadas acima e abaixo da sequência marca tais como descritas precedentemente, tipicamente das sequências (homólogas às ditas sequências situadas acima e abaixo da sequência marca) que compreende cada uma entre 10 ou 20 pares de base e 1000, 1500 ou 2000 pares de base, por exemplo entre 100, 200, 300, 400 ou 500 pares de base e 1000, 1200, 1300, 1400 ou 1500 pares de base, de preferência entre 100 e 1500 ou entre 100 e 1000 pares de base, e de maneira ainda mais preferencialmente entre 500 e 1000 pares de base ou entre 200 e 800 pares de base. Um ácido nucleico de interesse particular se apresenta sob a forma de um vetor que compreende um ou vários cassetes de expressão, cada fita codificando ao menos um RNA guia (gRNA).

[0067] Uma ferramenta genética particular de acordo com a invenção que compreende vários (ou pelo menos dois) ácidos nucleicos de interesse tais como descritos precedentemente, sendo os ditos ácidos nucleicos diferentes uns dos outros.

[0068] Em um modo de realização particular, o ácido nucleico de interesse utilizado com ferramenta genética para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria de interesse, tipicamente uma bactéria do gênero Clostridium, é um ácido nucleico que reconhece uma sequência de código, uma sequência que controla a transcrição, ou uma sequência que flanqueia, uma sequência que codifica uma enzima que confere à bactéria a resistência a um ou mais antibióticos, e com capacidade para apagar a dita sequência no seio do genoma dessa bactéria ou de torná-la não funcional, em particular um ácido nucleico que não apresenta metilação nos níveis de motivos reconhecidos pelas metiltransferases de tipo Dam e Dcm (preparada a partir de uma bactéria Escherichia coli que apresenta o genótipo dam- dcm-).

[0069] Quando a bactéria de interesse a ser transformada e/ou modificada geneticamente é uma bactéria C. beijerinckii, particularmente que pertence a um dos sub- clados DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 e NCCB 27006, o ácido nucleico de interesse utilizado como ferramenta genética, por exemplo o plasmídeo, é um ácido nucleico que não apresenta metilação no nível de motivos reconhecidos pelas metiltransferases de tipo Dam e Dcm, tipicamente um ácido nucleico cuja adenosina ("A") do motivo GATC e/ou a segunda citosina ("C") do motivo CCWGG (W podendo corresponder a uma adenosina ("A") ou a uma timina ("T")) são desmetilados.

[0070] Um ácido nucleico que não apresenta metilação nos níveis dos motivos reconhecidos pelas metiltransferases do tipo Dam e Dcm pode tipicamente ser preparado a partir de uma bactéria Escherichia coli que apresenta o genoma dam- dcm- (por exemplo Escherichia coli INV 110, Invitrogen). Esse mesmo ácido nucleico pode comportar outras metilações realizadas por exemplo por metiltransferases do tipo EcoKI, essa última visando as adeninas ("A") dos motivos AAC(N6)GTGC e GCAC(N6)GTT (N podendo corresponder a qualquer base).

[0071] Em um modo de realização preferencial, a sequência marcada corresponde a um gene que codifica uma anfenicol-O- acetiltransferase tal como o gene catB, em uma sequência que controla a transcrição desse gene, ou a uma sequência que flanqueia esse gene.

[0072] Um ácido nucleico de interesse particular utilizado como ferramenta genética no quadro da invenção é, por exemplo, um vetor, de preferência um plasmídeo, por exemplo o plasmídeo pCas9ind-ΔcatB de sequência SEQ ID NO: 21 ou o plasmídeo pCas9ind-gRNA_catB de sequência SEQ ID NO: 38 descrito na parte experimental da presente descrição, em particular uma versão da dita sequência não apresenta metilação no nível dos motivos reconhecidos por metiltransferases do tipo Dam e Dcm.

[0073] A presente descrição se refere também à utilização de um ácido nucleico de interesse tal como descrito no presente texto para transformar e/ou modificar, em particular uma bactéria solvogênica do gênero Clostridium capazes, no estado selvagem, de produzir isopropanol, particularmente capazes, no estado selvagem, de efetuar uma fermentação IBE.

[0074] Uma bactéria com capacidade para produzir o isopropanol em estado selvagem, particularmente com capacidade para efetuar uma fermentação IBE no estado selvagem, pode ser por exemplo uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum, uma bactéria C. butyricum, uma bactéria C. saccharoperbutylacetonicum, uma bactéria C. botulinum, uma bactéria C. drakei, uma bactéria C. scatologenes, uma bactéria C. perfringens, e uma bactéria C. tunisiense, de preferência uma bactéria selecionada dentre uma bactéria C. beijerinckii, uma bactéria C. diolis, uma bactéria C. puniceum e uma bactéria C. saccharoperbutylacetonicum.

[0075] Uma bactéria (naturalmente) com capacidade para produzir isopropanol no estado selvagem, em particular com capacidade para efetuar uma fermentação IBE no estado selvagem, particularmente preferível é uma bactéria C. beijerinckii.

[0076] As bactérias acetogênicas de interesse são bactérias produtoras de ácido e/ou de solventes a partir de CO2 e H2. Bactérias acetogênicas do gênero Clostridum podem ser selecionadas por exemplo dentre C. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes e C. carboxydivorans.

[0077] Em um modo de realização particular, a bactéria do gênero Clostridum se refere a uma "cepa ABE", de preferência a cepa DSM 792 (também designada cepa ATCC 824 ou ainda LMG

5710) de C. acetobutylicum, ou a cepa NCIMB 8052 de C. beijerinckii.

[0078] Em um outro modo de realização particular, a bactéria do gênero Clostridium se refere a uma "cepa IBE", tipicamente uma das bactérias C. beijerinckii identificadas na presente descrição, por exemplo uma bactéria C. beijerinckii cujo sub-clado é selecionado dentre DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006, ou uma bactéria C. aurantibutyricum DSZM 793 (Georges et al., 1983), e um sub-clado de uma tal bactéria C. beijerinckii ou C. aurantibutyricum que apresenta pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a cepa DSM 6423. Uma bactéria C. beijerinckii, ou um sub-clado de bactéria C. beijerinckii, particularmente preferível é desprovido(a) do plasmídeo pNF2.

[0079] Os respectivos genomas dos sub-clados LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 e NCCB 27006 por um lado, e DSM 793 por outro lado, apresentam porcentagens de identidade de sequência de pelo menos 97% com o genoma do sub-clado DSM

6423.

[0080] Os inventores realizaram testes de fermentação que confirmam que as bactérias C. beijerinckii do sub-clado DSM 6423, LMG 7815 e NCCB 27006 têm capacidade para produzir isopropanol no estado selvagem (ver tabela 1). [Tabela 1]

[0081] Balanço dos testes de fermentação de glucose com ajuda das cepas naturalmente produtoras de isopropanol C. beijerinckii DSM 6423, LMG 7815 e NCCB 27006.

[0082] Em um modo de realização particularmente preferível da invenção, a bactéria C. beijerinckii é a bactéria do sub-clado DSM 6423.

[0083] Em ainda um outro modo de realização preferível da invenção, a bactéria C. beijerinckii é uma cepa C. beijerinckii IFP963 ΔcatB ΔpNF2 (registrada em 20 de fevereiro de 2019 sob o número de depósito LMG P-31277 junto à coleção BCCM-LMG, e também identificada no presente texto enquanto C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2).

[0084] A bactéria destinada a ser transformada, e de preferência modificada geneticamente, é de acordo com um modo de realização particular uma bactéria que foi exposta a uma primeira etapa de transformação e a uma primeira etapa de modificação genética com ajuda de um ácido nucleico ou ferramenta genética de acordo com a invenção, tendo permitido apagar pelo menos uma molécula de DNA extracromossômica (tipicamente pelo menos um plasmídeo) naturalmente presente no seio da dita bactéria no estado selvagem.

[0085] Um outro aspecto descrito pelos inventores traçou um processo para transformar, e além disso preferencialmente modificar geneticamente, uma bactéria do gênero Clostridium com ajuda de um ácido nucleico de interesse de acordo com a invenção tal como descrito mais acima. Esse processo compreende uma etapa de transformação da bactéria por introdução na dita bactéria do ácido nucleico de interesse descrito no presente texto. O processo pode compreender, além disso, em uma etapa de obtenção, de recuperação, de seleção ou de isolamento da bactéria transformada, isto é, da bactéria que apresenta a ou as recombinações /modificações/otimizações pesquisadas.

[0086] Em um modo de realização particular, o processo para transformar, e de preferência modificar geneticamente, uma bactéria do gênero Clostridium intervém com uma ferramenta de modificação genética selecionada dentre uma ferramenta CRISPR, uma ferramenta baseada sobre a utilização de íntrons do tipo II (por exemplo a ferramenta Targetron® ou a ferramenta ClosTron®) e uma ferramenta de troca alélica (por exemplo uma ferramenta ACE®), e compreende uma etapa de transformação da bactéria de um ácido nucleico de interesse de acordo com a invenção tal como descrito mais acima.

[0087] A presente invenção é típica e vantajosamente executada desde que a ferramenta de modificação genética selecionada para transformação, e de preferência modificar geneticamente, uma bactéria do gênero Clostridium, seja destinada a ser utilizada sobre uma bactéria tal como C. beijerinckii, que porta, no estado selvagem, um gene que codifica uma enzima responsável pela resistência a um ou mais antibióticos, e que a execução da dita ferramenta genética compreende uma etapa de transformação da dita bactéria com ajuda de um ácido nucleico que permite a expressão de um marcador de resistência a um antibiótico ao qual essa bactéria é resistente no estado selvagem e/ou uma etapa de seleção das bactérias transformadas e/ou modificadas geneticamente com ajuda do dito antibiótico (ao qual a bactéria é resistente no estado selvagem).

[0088] Uma modificação realizável graças à presente invenção, por exemplo com ajuda de uma ferramenta genética selecionada dentre uma ferramenta CRISPR, uma ferramenta baseada sobre a utilização de íntrons de tipo II e uma ferramenta de troca alélica, consiste em apagar uma sequência que codifica uma enzima que confere à bactéria a resistência a um ou vários antibióticos, ou a tornar essa sequência não funcional. Uma outra modificação vantajosamente realizável graças à presente invenção consiste em modificar geneticamente uma bactéria a fim de melhorar seus desempenhos, por exemplo seus desempenhos na produção de um solvente ou de uma mistura de solventes de interesse, tendo a dita bactéria já sido anteriormente modificada graças à invenção para torná-la sensível a um antibiótico ao qual a mesma era resistente no estado selvagem.

[0089] Em um modo de realização preferível, o processo de acordo com a invenção é baseado na utilização de (executar) a tecnologia / a ferramenta genética CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats), particularmente a ferramenta genética CRISPR/Cas (proteína associada a CRISPR).

[0090] Esse método é baseado no emprego de uma enzima chamada nuclease (tipicamente uma nuclease do tipo Cas no caso da ferramenta genética CRISPR/Cas, tal como a proteína Cas9 (proteína associada a CRISPR 9) de Streptococcus pyogenes), que vai, guiada por uma molécula de RNA, realizar um corte de dupla fita no seio de uma molécula de DNA (sequência marca de interesse). A sequência de RNA guia (gRNA) determinará o locus de corte da nuclease, conferindo- lhe assim uma especifidade muito forte. Sendo um corte de dupla fita no seio de uma molécula de DNA indispensável à sobrevivência do microrganismo de fato letal para um organismo, a sobrevivência desse último dependerá de sua capacidade de repará-la (ver por exemplo Cui & Bikard, 2016). Nas bactérias do gênero Clostridium, a reparação de um corte de fita dupla depende de um mecanismo de recombinação homóloga que necessita de uma cópia intacta da sequência clivada. Ao fornecer à bactéria um fragmento de DNA que permite efetuar essa reparação ao mesmo tempo que modifica a sequência original é possível forçar o microrganismo a ser integrado nas mudanças desejas no seio de seu genoma.

[0091] A presente invenção pode ser executada sobre uma bactéria do gênero Clostridium com ajuda de uma ferramenta genética CRISPR/Cas clássica ao utilizar um único plasmídeo que compreende uma nuclease, um gRNA e uma matriz de reparação tal como descrito por Wang et al. (2015). O sistema CRISPR/Cas contém dois elementos essenciais distintos, isto é i) uma endonuclease, no caso presente a nuclease associada ao sistema CRISPR, Cas e ii) um RNA guia. O RNA guia se apresenta sob a forma de um RNA quimérico que consiste na combinação de uma RNA bacteriano CRISPR (crRNA) e de uma tracrRNA (RNA CRISPR transativador). O gRNA combina a especificidade da marcação de crRNA que corresponde às "sequências espaçadoras" que servem de guias às proteínas Cas, e as propriedades conformacionais do tracrRNA em uma única transcrição. Quando o gRNA e a proteína Cas são exprimidos simultaneamente na célula, a sequência genômica marca pode ser modificada de maneira permanente graças a uma matriz de reparação fornecida. O versado na técnica pode facilmente definir a sequência e a estrutura do gRNA de acordo com a região cromossômica ou o elemento genético móvel a ser marcado ao utilizar técnicas bem conhecidas (ver, por exemplo, o artigo de DiCarlo et al., 2013).

[0092] A introdução na bactéria de elementos (ácidos nucleicos ou gRNA) da ferramenta genética é realizada por todo um método, direto ou indireto, conhecido do versado na técnica, por exemplo por transformação, conjugação, microinjeção, transfecção, eletroporação, etc., de preferência por eletroporação (Mermelstein et al, 1993).

[0093] Os inventores focaram recentemente e descrevem uma ferramenta genética de modificação e bactérias, adaptada às bactérias do gênero Clostridium e utilizáveis no contexto da presente invenção, baseada na utilização de dois plasmídeos (ver WO2017/064439, Wasels et al., 2017, e Figura 15 associadas à presente descrição).

[0094] Em um modo de realização particular, o "primeiro" plasmídeo dessa ferramenta permite a expressão da nuclease Cas e um "segundo" plasmídeo, específico da modificação a ser efetuada, contém um ou mais cassetes de expressão de gRNA (que marcam tipicamente regiões diferentes do DNA bacteriano) assim como uma matriz de reparação que permite, por um mecanismo de recombinação homóloga, a substituição de uma porção do DNA bacteriano marcado por Cas por uma sequência de interesse. O gene cas e/ou o(s) cassete(s) de expressão de gRNA são postos sob controle de promotores de expressão constitutivos ou indutíveis, de preferência indutíveis, conhecidos do versado na técnica (por exemplo descritos no pedido WO2017/064439 e incorporados por referência à presente descrição), e de preferência diferentes mas indutíveis pelo mesmo agente indutor.

[0095] Os gRNA podem ser RNA naturais, sintéticos ou produzidos por técnicas de recombinação. Esses gRNA podem ser preparados por todos os métodos conhecidos do versado na técnica tais como, por exemplo, a síntese química, a transcrição in vivo ou técnicas de amplificação. Quando vários gRNA são utilizados, a expressão de cada gRNA pode ser controlada por um promotor diferente. De preferência, o promotor utilizado é o mesmo para todos os gRNA. Um mesmo promotor pode, em um modo de realização particular, ser utilizado para permitir a expressão de vários, por exemplo de somente alguns, ou, de outro modo, de toda ou parte dos gRNA destinados a serem expressos.

[0096] Em um modo de realização particular, utilizável em um contexto da presente invenção, ii) pelo menos um dos ditos "primeiro" e "segundo" ácidos nucleicos codificam, além disso, um ou mais RNA guias (gRNA) ou a ferramenta genética que compreende além disso um ou mais RNA guias, sendo que cada RBA compreende uma estrutura RNA de fixação à enzima Cas e uma sequência complementar da porção marcada do DNA bacteriano, e iii) pelo menos um dos ditos "primeiro" e "segundo" ácidos nucleicos que compreendem, além disso, uma sequência que codifica uma proteína anti-CRISPR posicionada sob o controle de um promotor indutível, ou a ferramenta genética que compreende além disso um "terceiro" ácido nucleico que codifica uma proteína anti-CRISPR posta sob o controle de um promotor indutível, de preferência diferente de promotores que controlam a expressão de Cas e/ou do(s) gRNA e indutível por um outro agente indutor.

[0097] Em um modo de realização preferível, a proteína anti-CRISPR tem capacidade para inibir, preferencialmente de neutralizar, a ação da nuclease, preferencialmente durante a fase de introdução das sequências de ácidos nucleicos da ferramenta genética na cepa bacteriana de interesse.

[0098] Um processo particular que intervém com a tecnologia CRISPR, suscetível de ser executada no contexto da presente invenção para transformar, e tipicamente para modificar geneticamente por recombinação homóloga, uma bactéria do gênero Clostridium, que compreende as seguintes etapas: a) de introdução na bactéria de uma ferramenta CRISPR descrita pelos inventores na presença de um agente indutor da expressão de uma proteína anti-CRISPR, e b) de cultura da bactéria transformada obtida ao longo da etapa a) sobre um meio que não contém (ou em condições que não implicam) o agente indutor da expressão da proteína anti-CRISPR, que permite tipicamente a expressão do complexo ribonucleoproteico Cas/gRNA.

[0099] Em um modo de realização particular, o processo compreende, além disso, durante ou após a etapa, b) uma etapa de indução da expressão do ou dos promotores indutíveis que controlam a expressão de Cas e/ou do ou dos RNA guias quando um tal ou tais promotores estão presentes no seio da ferramente genética, a fim de permitir a modificação genética de interesse da bactéria uma vez que a dita ferramenta genética tenha sido introduzida na dita bactéria. A indução é realizada com ajuda de uma substância que permite tirar a inibição da expressão ligada ao promotor indutível selecionado.

[0100] Em um outro modo de realização particular, o processo compreende uma etapa c) adicional de eliminação do ácido nucleico que contém a matriz de reparação (a célula bacteriana sendo então considerada como "curada" do dito ácido nucleico) e/ou de eliminação do(s) RNA guias ou das sequências que codificam o(s) RNA guias introduzidos com a ferramenta genética no momento da etapa a).

[0101] Ainda em um outro modo de realização particular, o processo compreende uma ou várias etapas adicionais, posterior(es) à etapa b) ou à etapa c), de introdução de um enésimo, por exemplo terceiro, quarto, quinto, etc., ácido nucleico que contém uma matriz de reparação distinta da(s) já introduzida(a) e de um ou mais cassetes de expressão de RNA guias que permitam a integração da sequência de interesse contida na dita matriz de reparação distinta em uma zona marcada do genoma da bactéria, na presença de um agente indutor da expressão da proteína anti-CRISPR, cada etapa adicional sendo seguida de uma etapa de cultura da bactéria assim transformada sobre um meio que não contém o agente indutor de expressão da proteína anti-CRISPR, que permite tipicamente a expressão do complexo ribonucleoproteico Cas/gRNA.

[0102] Em um modo de realização particular do processo de acordo com a invenção, a bactéria é transformada com ajuda de uma ferramenta CRISPR ou de um processo, tal como descrito acima, ao utilizar (por exemplo ao codificar) uma enzima responsável pelo corte de pelo menos um ramo da sequência marca de interesse, na qual a enzima é de um modo particular uma nuclease, de preferência uma nuclease do tipo Cas, preferencialmente selecionada dentre uma enzima Cas9 e uma enzima MAD7. De modo preferível, a sequência marca de interesse é uma sequência, por exemplo o gene catB, que codifica uma enzima que confere à bactéria a resistência a um ou mais antibiótico, de preferência a um ou mais antibióticos que pertencem à classe dos anfenicois, tipicamente uma anfenicol-O-acetiltransferase tal como uma cloroanfenicol-O-acetiltransferase, uma sequência que controla a transcrição da sequência de código ou uma sequência que flanqueia a dita sequência de código.

[0103] Exemplos de proteínas Cas9 utilizáveis na presente invenção incluem, não se limitando às mesmas, as proteínas Cas9 de S. pyogenes (ver SEQ ID NO: 1 do pedido WO2017/064439 e número de entrada NCBI: WP_010922251.1), Streptococcus thermophilus, Streptococcus mutans, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Francisella novicida, Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica e Legionella pneumophila (ver Fonfara et al, 2013; Makarova et al, 2015).

[0104] A nuclease MAD7 (cuja sequência de aminoácidos corresponde à sequência SEQ ID NO: 72), também identificada enquanto "Cas12" ou "Cpf1", pode ser de outro modo vantajosamente utilizada no contexto da presente invenção ao combiná-la com um ou mais gRNA conhecidos do versado na técnica capaz(es) de se ligar a uma tal nuclease (ver Garcia- Doval et al., 2017 e Stella S. et al., 2017). De acordo com um aspecto particular, a sequência que codifica a nuclease MAD7 é uma sequência otimizada para ser facilmente expressa nas cepas de Clostridium, de preferência a sequência SEQ ID NO: 71. Quando utilizada, a proteína anti-CRISPR é tipicamente uma proteína "anti-Cas", isto é uma proteína com capacidade para inibir ou impedir/neutralizar a ação de Cas, e/ou uma proteína com capacidade para inibir ou impedir/de neutralizar a ação de um sistema CRISPR/Cas, por exemplo de um sistema CRISPR/Car do tipo II quando a nuclease é uma nuclease do tipo Cas9.

[0105] A proteína anti-CRISPR é vantajosamente uma proteína "anti-Cas9", por exemplo selecionada dentre AcrlIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 e AcrIIC3 (Pawluk et al, 2018). De modo preferível, a proteína "anti-Cas9" é AcrIIA2 ou AcrIIA4. Uma tal proteína tipicamente tem capacidade para limitar muito significativamente, idealmente impedir, a ação de Cas9, por exemplo ao se fixar à enzima Cas9.

[0106] Uma outra proteína anti-CRISPR vantajosamente utilizável é uma proteína "anti-MAD7", por exemplo a proteína AcrVA1 (Marino et al, 2018).

[0107] Assim como a porção de DNA marcada ("sequência reconhecida"), a matriz de edição/reparação pode compreender ela mesma uma ou mais sequências de ácidos nucleicos ou porções de sequências de ácido nucleico que correspondem a sequências naturais e/ou sintéticas, de códigos e/ou não. A matriz pode igualmente compreender uma ou mais sequências "estrangeiras", isto é naturalmente ausentes do genoma das bactérias que pertencem ao gênero Clostridium ou do genoma de espécies particulares do dito gênero. A matriz pode compreender também uma combinação de sequências.

[0108] A ferramenta genética utilizada no contexto da presente invenção permite à matriz de reparação guiar a incorporação no seio do genoma bacteriano de um ácido nucleico de interesse, tipicamente de uma sequência ou porção de sequência de DNA que compreendem pelo menos 1 par de base (pb), de preferência pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1.000, 10.000, 100.000 ou 1.000.000 pb, tipicamente entre 1 pb e 20 kb, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 kb, ou entre 1 pb e 10 kb, de preferência entre

10 pb e 10 kb ou entre 1 kb e 10 kb, por exemplo entre lpb e 5 kb, entre 2 kb e 5 kb, ou ainda entre 2,5 ou 3 kb e 5 kb.

[0109] Em um modo de realização particular, a expressão da sequência de DNA de interesse permite à bactéria do gênero Clostridium de fermentar (tipicamente de modo simultâneo) vários açúcares diferentes, por exemplo pelo menos dois açúcares diferentes, tipicamente pelo menos dois açúcares diferentes dentre os açúcares que compreendam 5 átomos de carbono (tais como a glucose ou a manose) e/ou dentre os açúcares que compreendem 6 átomos de carbono (tais como a xilose, a arabinose ou a frutose), de preferência pelo menos três açúcares diferentes, selecionados por exemplo dentre glucose, zilose e manose; glucose, arabinose e manose; e glucose, xilose e arabinose.

[0110] Em um outro modo de realização particular, a sequência de DNA de interesse codifica pelo menos um produto de interesse, de preferência um produto que favorece a produção de solvente pela bactéria do gênero Clostridum, tipicamente pelo menos uma proteína de interesse, por exemplo uma enzima; uma proteína membranária tal como um transportador; uma proteína de maturação de outras proteínas (proteína acompanhante); um fator de transcrição; ou uma combinação destes.

[0111] Em um outro modo de realização, o processo de acordo com a invenção é baseado na utilização de íntrons do tipo II, e executa por exemplo a tecnologia/a ferramenta genética ClosTron® ou a ferramenta genética Targetron®.

[0112] A tecnologia Targetron® repousa sobre a utilização de um íntron do grupo II (baseado no íntron Ll.ltrB de

Lactococcus lactis) reprogramável, com capacidade para integrar o genoma bacteriano rapidamente a um locus desejado (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013), tipicamente com o fim de inativar um gene marcado. Os mecanismos de reconhecimento da zona editada assim como da de inserção no genoma por retro-splicing são baseadas em uma homologia entre o íntron e a dita zona por um lado, e na atividade de uma proteína (ltrA) por outro lado.

[0113] A tecnologia ClosTron® repousa sobre uma abordagem semelhante, completada pela adição de um marcador de seleção em uma sequência do íntron (Heap et al., 2007). Esse marcador permite selecionar a integração do íntron no genoma, e facilita assim a obtenção dos mutantes desejados. Esse sistema genético explora também os íntrons do tipo I. De fato, o marcado de seleção (chamado RAM por retrotransposition-activated marker) é interrompido por um tal elemento genético, que impede sua expressão desde o plasmídeo (uma descrição mais precisa do sistema: Zhong et al.). O splicing desse elemento genético é produzido antes da integração em um genoma, o que permite a obtenção de um cromossomo que apresenta uma forma ativa do gene de resistência. Uma versão otimizada do sistema compreende locus FLP/FRT acima e abaixo desse gene, o que permite utilizar a recombinase FRT para eliminar o gene de resistência (Heap et al., 2010).

[0114] Em um outro modo de realização, o processo de acordo com a invenção é baseado na utilização de uma ferramenta de troca alélica, e executa, por exemplo, a tecnologia/a ferramenta genética ACE®.

[0115] A tecnologia ACE® repousa sobre a utilização de um mutante auxotrófico (para a uracila em C. acetobutylicum ATCC 824 por eliminação do gene pyrE, que provoca também uma resistência ao ácido 5-fluoro orótico (A-5-FO); (Heap et al., 2012). O sistema utiliza o mecanismo de troca alélica, bem conhecido do versado na técnica. Em seguida a uma transformação com um vetor pseudo-suicida (em cópias muito fracas), a integração desse último no cromossomo bacteriano por um primeiro evento de troca alélica é selecionado graças ao gene de resistência presente inicialmente sobre o plasmídeo. A etapa de integração pode ser realizada de duas maneiras diferentes, seja no seio do locus pyrE seja no seio de outro locus:

[0116] No caso da integração ao locus pyrE, o gene pyrE é igualmente posicionado sobre o plasmídeo, sem todavia ser expresso (sem promotor funcional). A segunda recombinação restaura um gene pyrE funcional e pode então ser selecionada por auxotrofia (meio mínimo, não contendo uracila). O gene pyrE não funcional apresenta também um caráter selecionável (sensibilidade ao A-5-FO), de outras integrações são em seguida concebíveis segundo o mesmo modelo, ao alterar sucessivamente o estado do pyrE entre funcional e não- funcional.

[0117] No caso da integração a um outro locus, uma zona genômica, que permite uma expressão do marcador de contra- seleção após a recombinação, é marcada (tipicamente, em operon após um outro gene, de preferência um gene fortemente expresso). Essa segunda recombinação é então selecionada por auxotrofia (meio mínimo, não contendo uracila).

[0118] Nos modos de realização descritos baseados na utilização de íntrons do tipo II, e executando por exemplo a tecnologia/ a ferramenta genética ClosTron® ou a ferramenta genética Targetron®, ou baseada na utilização de uma ferramenta de troca alélica, e executando a tecnologia/ a ferramenta genética ACE®, a sequência marcada é preferencialmente uma sequência que flanqueia a sequência que codifica uma enzima de interesse, de preferência, como explicado acima, uma anfenicol-O-acetiltransferase.

[0119] Um outro objeto da invenção se refere a uma bactéria transformada e/ou geneticamente modificada, tipicamente uma bactéria do gênero Clostridium que pertence a uma espécie ou correspondente a um dos sub-clados descritos pelos inventores, obtidos com ajuda de um processo tal como descrito pelos inventores no presente texto, assim como qualquer bactéria derivada, clone, mutante ou versão geneticamente modificada da mesma.

[0120] Uma bactéria assim transforada e/ou geneticamente modificada típica da invenção é uma bactéria que não expressa uma enzima que lhe confere a resistência a um ou mais antibióticos, particularmente uma bactéria que não expressa mais uma anfenicol-O-acetiltransferase, por exemplo uma bactéria que expressa no estado selvagem o gene catB, e desprovida do dito catB ou incapaz de expressar o dito gene catB uma vez transformada e/ou geneticamente modificada graças à invenção. A bactéria assim transformada e/ou geneticamente modificada graças à invenção torna-se sensível a um anfenicol, por exemplo a um anfenicol tal como descrito no presente texto, particularmente ao cloroanfenicol ou ao tianfenicol. Um exemplo particular de bactéria geneticamente modificada preferível de acordo com a invenção é a bactéria identificada na presente descrição enquanto C. beijerinckii

DSM 6423 ΔcatB tal como registrada sob o número de depósito LMG P-31151 junto à Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms ("BCCM", K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Bélgica) em 6 de dezembro de 2018. A descrição se refere também a toda bactéria derivada, clonada, mutante ou versão geneticamente modificada da dita bactéria que se mantém sensível a um anfenicol tal como o tianfenicol e/ou o cloroanfenicol. De acordo com um modo de realização particular, a bactéria transformada e/ou geneticamente modificada de acordo com a invenção não expressa uma enzima que lhe confere a resistência a um ou mais antibióticos, em particular um anfenicol-O-acetiltransferase, por exemplo a bactéria C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB, ainda é suscetível de ser transformada, e de preferência modificada geneticamente. Isso pode ser feito com ajuda de um ácido nucleico, por exemplo um plasmídeo tal como descrito na presente descrição, por exemplo na parte experimental. Um exemplo de ácido nucleico suscetível de ser vantajosamente utilizado é o plasmídeo pCas9 acr de sequência SEQ ID NO: 23 (descrito na parte experimental da presente descrição).

[0121] Um aspecto particular da invenção se refere, de fato, à utilização de uma bactéria modificada geneticamente de acordo com a invenção, preferencialmente a bactéria C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB depositada sob o número LMG P- 31151 ou um versão geneticamente modificada desta, por exemplo, com ajuda de uma das ferramentas genéticas ou processos descritos no presente texto, para produzir, graças à expressão do ou dos ácidos nucleicos de interesse introduzir voluntariamente em seu genoma, um ou mais solventes, de preferência pelo menos o isopropanol, de preferência em escala industrial.

[0122] A invenção se refere também a um kit (estojo) que compreende (i) um ácido nucleico de interesse de acordo com a invenção, tipicamente um fragmento de DNA que reconhece uma sequência de código, ou que controla a transcrição de uma sequência de código, uma enzima de interesse em uma bactéria do gênero Clostridium, particularmente em uma bactéria com capacidade para efetuar uma fermentação IBE tal como descrito no presente texto, e (ii) pelo menos uma ferramenta, de preferência várias ferramentas, selecionadas dentre os elementos de uma ferramenta de modificação genética que permitem transformar, e tipicamente modificar geneticamente uma bactéria do gênero Clostridium, para produzir uma variante melhorada da dita bactéria; um ácido nucleico enquanto matriz de reparação; pelo menos um par de iniciadores, por exemplo um paz de iniciadores tal como descritos no contexto da presente invenção; e um indutor que permite a expressão de uma proteína codificada pela dita ferramenta, por exemplo de uma nuclease do tipo Cas9 ou MAD7.

[0123] A ferramenta de modificação genética para transformar, e tipicamente modificar geneticamente uma bactéria do gênero Clostridum, pode ser, por exemplo, selecionada dentre uma ferramenta CRISPR, uma ferramente baseada na utilização de íntrons do tipo II e uma ferramenta de troca alélica, como explicado mais acima.

[0124] O kit pode, além disso, compreender um ou mais indutores adaptados ao(s) promotor(es) indutível(is) selecionado(s), eventualmente utilizado(s), no seio da ferramenta genética para controlar a expressão da nuclease utilizada e/ou de um ou mais RNA guias.

[0125] Um kit particular de acordo com a invenção permite a expressão de uma nuclease que compreende uma etiqueta (ou "tag").

[0126] Os kits de acordo com a invenção podem além disso compreender um ou mais consumíveis tais como um meio de cultura, pelo menos uma bactéria competente do gênero Clostridium (isto é condicionada para a transformação), pelo menos um gRNA, uma nuclease, um ou várias moléculas de seleção, ou ainda uma nota explicativa.

[0127] A descrição se refere também à utilização de um kit de acordo coma invenção, ou de um ou vários elementos desse kit, para a execução de um processo de transformação e idealmente de modificação genética de uma bactéria do gênero Clostridium descritos no presente texto, e/ou para a produção de solvente(s) ou de biocombustível(is), ou de misturas dos mesmos, de preferência em escala industrial, com ajuda de uma bactéria do gênero Clostridium, de preferência de uma bactéria do gênero Clostridium naturalmente produtora de isopropanol.

[0128] Solventes suscetíveis de serem produzidos são tipicamente acetona, butanol, etanol, isopropanol, ou uma mistura dos mesmos, tipicamente uma mistura de etanol/isopropanol, butanol/isopropanol, ou etanol/butanol, de preferência uma mistura isopropanol/butanol.

[0129] A utilização de bactérias transformadas de acordo com a invenção permite tipicamente a produção anual em escala industrial de pelo menos 100 toneladas de acetona, pelo menos 100 toneladas de etanol, pelo menos 1.000 toneladas de isopropanol, pelo menos 1.800 toneladas de butanol, ou pelo menos 40.000 toneladas de uma mistura dos mesmos.

[0130] Os exemplos e figuras que seguem tem como objetivo ilustrar mais completamente a invenção sem limitar seu escopo.

FIGURAS

[0131] [Fig 1] A Figura 1 representa a Classificação de 30 cepas de Clostridium solvogênicos, segundo Poehlein et al., 2017. Nota-se que o sob-clado C. beijerinckii NRRL B- 593 também é identificado na literatura como C. beijerinckii DSM 6423.

[0132] [Fig 2] A Figura 2 representa o Mapa do plasmídeo pCas9ind-ΔcatB

[0133] [Fig 3] A Figura 3 representa o Mapa do plasmídeo pCas9acr

[0134] [Fig 4] A Figura 4 representa o Mapa do plasmídeo pEC750S-uppHR

[0135] [Fig 5] A Figura 5 representa o Mapa do plasmídeo pEX-A2-gRNA-upp.

[0136] [Fig 6] A Figura 6 representa o Mapa do plasmídeo pEC750S-Δupp.

[0137] [Fig 7] A Figura 7 representa o Mapa do plasmídeo pEC750C-Δupp

[0138] [Fig 8] A Figura 8 representa o Mapa do pGRNA-pNF2

[0139] [Fig 9] A Figura 9 representa a Amplificação PCR do gene catB nos clones oriundos da transformação bacteriana da cepa C. beijerinckii DSM 6423.

[0140] Amplificação de cerca 1,5 kb se a cepa possuir ainda o gene catB, ou de cerca de 900 pb se o gene tiver sido apagado.

[0141] [Fig 10] A Figura 10 representa o Crescimento das cepas C. beijerinckii DSM6423 WT e ΔcatB no meio 2YTG e meio seletivo 2YTG tianfenicol.

[0142] [Fig 11] A Figura 11 representa a indução do sistema CRISPR/Cas9acr nos transformantes da cepa C. beijerinckii DSM 6423 que contém pCas9acr e um plasmídeo de expressão de gRNA que marca upp, com ou sem matriz de reparação. Legenda: Em, eritromicina; Tm, tianfenicol; aTc, anidrotetraciclina; ND, não diluída.

[0143] [Fig 12A] A Figura 12 representa a Modificação do locus upp de C. beijerinckii DSM 6423 via sistema CRISPR/Cas9. A Figura 12A representa a organização genética do locus upp: genes, locus marca do gRNA e matrizes de reparação, associadas às regiões de homologias que correspondem ao DNA genômico. Os locus de hibridização dos iniciadores para a verificação por PCR (RH010 e RH011) também estão indicados.

[0144] [Fig 12B] A Figura 12 representa a Modificação do locus upp de C. beijerinckii DSM 6423 via sistema CRISPR/Cas9. A Figura 12B representa a amplificação do locus com ajuda dos iniciadores RH010 e RH011. Uma amplificação de 1680 pb é esperada no caso de um gene selvagem, contra 1090 pb por um gene upp modificado. M, marcador de tamanho 100 bp - 3 kb (Lonza); WT, cepa selvagem.

[0145] [Figura 13] A Figura 13 representa a Amplificação PCR que verifica a presença do plasmídeo pCas9ind. na cepa C. beijerinckii 6423 ΔcatB.

[0146] [Fig 14] A Figura 14 representa a Amplificação PCR (≈900 pb) que verifica a presença ou não do plasmídeo natural pNF2 antes da indução (controle positivo 1 e 2) e, depois, após indução em meio que contém aTc do sistema CRISPR-Cas9.

[0147] [Fig 15] A Figura 15 representa a Ferramenta genética de modificação de bactérias, adaptada às bactérias do gênero Clostridium, baseadas na utilização de dois plasmídeos (ver WO2017/064439, Wasels et al., 2017).

[0148] [Fig 16] A Figura 16 representa o Mapa do plasmídeo pCas9ind-gRNA_catB.

[0149] [Fig 17] A Figura 17 representa o sistema CRISPR/Cas9 utilizado para a edição do genoma enquanto ferramenta genética que permite criar, com ajuda da nuclease Cas9, um ou mais cortes de dupla fita no DNA genômico dirigido(s) pelo gRNA.

[0150] gRNA, RNA guia; PAM, Protospacer Adjacent Motif. Figura modificada da de Jinek et al, 2012.

[0151] [Fig 18] A Figura 18 representa a reparação por recombinação homóloga de um corte de dupla fita induzido por Cas9. PAM, Protospacer Adjacent Motif.

[0152] [Fig 19] A Figura 19 representa a utilização de CRISPR/Cas9 em Clostridium. ermB, gene da resistência à eritromicina; catP (SEQ ID NO: 70), gene de resistência ao tianfenicol/cloranfenicol; tetR, gene cujo produto de expressão reprime a transcrição a partir de Pcm-tetO2/1; Pcm-2tetO1 e Pcm-tetO2/1, promotores indutíveis da anidrotetraciclina, "aTc" (Dong et al., 2012); miniPthl, promotor constitutivo (Dong et al., 2012).

[0153] [Fig 20] A Figura 20 representa o mapa do plasmídeo pCas9acr (SEQ ID NO: 23).

[0154] ermB, gene da resistência à eritromicina; rep, origem de replicação em E. coli; repH, origem de replicação em C. acetobutylicum; Tthl, terminador tiolase; miniPthl, promotor constitutivo (Dong et al., 2012); Pcm-tetO2/1, promotor reprimido pelo produto de tetR e induzível pela anidrotetraciclina, "aTc" (Dong et al., 2012); Pbgal, promotor reprimido pelo produto de lacR e induzível pela lactose (Hartman et al., 2011); acrIIA4, gene que codifica a proteína anti-CRISPR AcrII14; bgaR, gene cujo produto de expressão reprime a transcrição a partir de Pbgal.

[0155] [Fig 21] A Figura 21 representa a taxa de transformação relativa de C. acetobutylicum DSM 792 que contém pCas9ind (SEQ ID NO: 22) ou pCas9acr (SEQ ID N: 23). As frequências são expressas em número de transformantes obtidos por µg de DNA utilizados no momento da transformação, remetidos às frequências de transformação de pEC750C (SEQ ID NO: 106), e representam as médias de pelo menos duas experiências independentes.

[0156] [Fig 22] A Figura 22 representa a indução do sistema CRISPR/Cas9 nos transformantes da cepa DSM 792 que contêm pCas9acr e um plasmídeo de expressão de gRNA que marca bdhB, com (SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80) ou sem (SEQ ID NO: 105) matriz de reparação. Em, eritromicina; Tm, tianfenicol; aTc, anidrotetraciclina; ND, não diluída.

[0157] [Fig 23A] A Figura 23 representa a modificação do locus bdh de C. acetobutylicum DSM792 via sistema CRISPR/Cas9. A figura 23A representa a organização genética do locus bdh. Os homólogos entre matriz de reparação e DNA genômico são evidenciadas com ajuda de paralelogramas cinza claros. Os locus de hibridização dos iniciadores V1 e V2 também são representados.

[0158] [Fig 23B] A Figura 23 representa a modificação do locus bdh de C. acetobutylicum DSM792 via sistema CRISPR/Cas9. A figura 23B representa a amplificação do locus bdh com ajuda dos iniciadores V1 e V2. M, marcador de tamanho

2-log (NEB); P, plasmídeo pGRNA-ΔbdhAΔbdhB; WT, cepa selvagem.

[0159] [Fig. 24] A figura 24 representa a eficácia de transformação (em colônias observadas por µg de DNA transformado) para 20 µg plasmídeo pCas9ind na cepa de C. beijerinckii DSM6423. As barras de erro representam o erro padrão da média por um triplicado biológico.

[0160] [Fig. 25] A figura 25 representa o mapa do plasmídeo pNF3.

[0161] [Fig. 26] A figura 26 representa o mapa do plasmídeo pEC751S.

[0162] [Fig. 27] A figura 27 representa o mapa do plasmídeo pNF3S.

[0163] [Fig. 28] A figura 28 representa o mapa do plasmídeo pNF3E.

[0164] [Fig. 29] A figura 29 representa o mapa do plasmídeo pNF3C.

[0165] [Fig. 30] A figura 30 representa a eficácia da transformação (em colônias observadas por µg DNA transformado) do plasmídeo pCas9ind em três cepas de C. beijerinckii DSM 6423. As barras de erro correspondem ao desvio padrão da média por um duplicado biológico.

[0166] [Fig. 31] A Figura 31 representa a eficácia da transformação (em colônias observadas por µg de DNA transformado) do plasmídeo pEC750C em duas cepas derivadas de C. beijerinckii DSM 6423. As barras de erro correspondem ao desvio padrão da média por um duplicado biológico.

[0167] [Fig. 32] A figura 32 representa a eficácia de transformação (em colônias observadas por µg DNA transformados) dos plasmídeos pEC750C, pNF3C, pFW01 e pNF3E na cepa C. beijerinckii IFP963 ΔcatB ΔpNF2. As barras de erro correspondem ao desvio padrão da média para um triplicado biológico.

[0168] [Fig. 33] A figura 33 representa a eficácia de transformação (em colônias observadas por µg de DNA transformado) de plasmídeo pFW01, pNF3E e pNF3S na cepa C. beijerinckii NCIMB 8052.

EXEMPLOS EXEMPLO n°1 Materiais e métodos Condições de cultura

[0169] C. acetobutylicum DSM 792 foi cultivado em meio 2YTG (Tryptone 16 g.l-1, extrato de levedura 10 g.l-1, glucose 5 g.l-1, NaCl 4 g.l-1). E. coli NEB10B foi cultivado em meio LB (Tryptone 10 g.l-1, extrato de levedura 5 g.l-1, NaCl 5 g.l-1). Os meios sólidos foram realizados adicionando 15 g.l- 1 de agarose nos meios líquidos. A eritromicina (em concentrações de 40 ou 500 mg.l-1 respectivamente em meio 2YTG ou LB), o cloroanfenicol (25 ou 12,5 mg.l-1 respectivamente em LB sólido ou líquido) e o tianfenicol (15 mg.l-1 em meio 2YTG) foram utilizados quando necessário. Manipulação de ácidos nucleicos

[0170] Todas as enzimas e kits foram utilizados seguindo as recomendações dos fornecedores. Construção dos plasmídeos

[0171] O plasmídeo pCas9acr (SEQ ID NO: 23), apresentado na Figura 20, foi construído clonando o fragmento (SEQ ID NO: 81) que contém bgaR e acrIIA4 sob o controle do promotor Pbgal sintetizado pelo Eurofins Genomics no nível Sacl do vetor pCas9ind (Wasels et al, 2017).

[0172] O plasmídeo pGRNAind (SEQ ID NO: 82) foi construído clonado um cassete de expressão (SEQ ID NO: 83) de um gRNA sob controle do promotor Pcm-2tet01 (Dong et al, 2012) sintetizados pela Eurofins Genomics no nível do locus Sacl do vetor pEC750C (SEQ ID NO: 106) (Wasels et al, 2017). Os plasmídeos pGRNA-xylB (SEQ ID NO: 102), pGRNA-xylR (SEQ ID NO: 103), pGRNA-glcG (SEQ ID NO: 104) e pGRNA-bdhB (SEQ ID NO: 105) foram construídos clonando os pares de iniciadores respectivos 5’-TCATGATTTCTCCATATTAGCTAG-3’ e 5’- AAACCTAGCTAATATGGAGAAATC-3’, 5’-TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT-3’ e 5’-AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC-3’, 5’- TCATTTCCGGCAGTAGGATCCCCA-3’ e 5’-AAACTGGGGATCCTACTGCCGGAA- 3’, 5’-TCATGCTTATTACGACATAACACA-3’ e 5’- AAACTGTGTTATGTCGTAATAAGC-3’ no seio do plasmídeo pGRNAind (SEQ ID NO: 82) digerido por BsaI.

[0173] O plasmídeo pGRNA-ΔbdhB (SEQ ID NO: 79) foi construído clonando o fragmento de DNA obtido por montagem de PCR sobreposta dos produtos de PCR obtidos com os iniciadores 5’-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3’ e 5’-GGTTGATTTCAAATCTGTGTAAACCTACCG-3’ por um lado, 5’- ACACAGATTTGAAATCAACCACTTTAACCC-3’ e 5’- ATGCATGTCGACTCTTAAGAACATGTATAAAGTATGG-3’ por outro lado, no vetor pGRNA-bdhB digerido por BamHI e SacI.

[0174] O plasmídeo pGRNA-ΔbdhAΔbdhB (SEQ ID NO: 80) foi construído clonando o fragmento de DNA obtido por montagem de PCR sobreposta dos produtos de PCR obtidos com os iniciadores 5’-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3’ e 5’-GCTAAGTTTTAAATCTGTGTAAACCTACCG-3’ por um lado, 5’- ACACAGATTTAAAACTTAGCATACTTCTTACC-3’ e 5’- ATGCATGTCGACCTTCTAATCTCCTCTACTATTTTAG-3’ por outro lado, no vetor pGRNA-bdhB digerido por BamHI e SacI. Transformação

[0175] C. acetobutylicum DSM 792 foi transformado de acordo com o protocolo descrito por Mermelstein et al, 1993. A seleção de transformantes de C. acetobutylicum DSM 792 que contêm já um plasmídeo de expressão de Cas9 (pCas9ind ou pCas9acr) transformado com um plasmídeo que contém um cassete de expressão de um gRNA foi realizado em um meio 2YTG sólido que contém eritromicina (40 mg.l-1) do tianfenicol (15 mg.l- 1) e da lactose (40 nM). Indução da expressão de cas9

[0176] A indução da expressão de cas9 foi realizada via o crescimento dos transformantes obtidos em um meio 2YTG sólido que contém eritromicina (40 mg.l-1), tianfenicol (15 mg.l-1), e o agente indutor da expressão de cas9 e de gRNA, o aTc (1 mg.l-1). Amplificação do locus bdh

[0177] O controle da edição do genoma de C. acetobutylicum DSM 792 no nível do locus dos genes bdhA e bdhB foi realizado pelo PCR com ajuda da enzima Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) com ajuda dos iniciadores V1 (5’-ACACATTGAAGGGAGCTTTT- 3’) e V2 (5’-GGCAACAACATCAGGCCTTT-3’). Resultados Eficácia da transformação

[0178] A fim de avaliar o impacto da inserção do gene acrIIA4 sobre a frequência de transformação do plasmídeo de expressão de cas9, diferentes plasmídeos de expressão de gRNA foram transformados na cepa DSM 792 que contém pCas9ind (SEQ ID NO: 22) ou pCas9acr (SEQ ID NO: 23), e os transformantes foram selecionados em um meio suplementado em lactose. As frequências de transformações obtidas estão apresentadas na Figura 21. Geração de mutantes AbdhB et AbdhAAbdhB

[0179] O plasmídeo de marcação que contém o cassete de expressão de gRNA que marca bdhB (pGRNA-bdhB - SEQ ID NO: 105) assim como dois plasmídeos derivados que contêm as matrizes de reparação que permitem a eliminação do gene bdhB apenas (pGRNA-ΔbchB - SEQ ID NO: 79) ou os genes bdhA e bdhB (pGRNA-ΔbdhAΔbdhB - SEQ ID NO: 80) foram transformados na cepa DSM 792 que contém pCas9ind (SEQ ID NO: 22) ou pCas9acr (SEQ ID NO: 23). As frequências de transformação obtidas estão apresentadas na Tabela 2: [Tabela 2] DSM 792 pCas9ind pCas9acr pEC750C 32,6 ± 27,1 ufc.µg-1 24,9 ± 27,8 ufc.µg-1 pGRNA-bdhB 0 ufc.µg-1 17,0 ± 10,7 ufc.µg-1 pGRNA-ΔbdhB 0 ufc.µg-1 13,3 ± 4,8 ufc.µg-1 pGRNA-ΔbdhAΔbdhB 0 ufc.µg-1 33,1 ± 13,4 ufc.µg-1

[0180] Frequências de transformação da cepa DSM 792 que contêm pCas9ind ou pCas9acr com plasmídeos marcando bdhB. As frequências são expressas em número de transformantes obtidos por µg de DNA utilizado no momento da transformação, e representam as médias de pelo menos duas experiências independentes.

[0181] Os transformantes obtidos foram submetidos a uma fase de indução da expressão do sistema CRISPR/Cas9 via uma passagem em meio suplementado em anidrotetraciclina, aTC (Figura 22).

[0182] As modificações desejadas foram confirmadas por PCR sobre DNA genômico de duas colônias resistentes ao aTc (Figura 23). Conclusões

[0183] A ferramenta genética baseada em CRISPR/Cas9 descrita em Wasels et al. (2017) utiliza dois plasmídeos: - o primeiro plasmídeo, pCas9ind, contém cas9 sob controle de um promotor indutível ao aTC, e - o segundo plasmídeo, derivado de pEC750C, contém o cassete de expressão de um gRNA (posicionado sob o controle de um segundo promotor induzível ao aTc) assim como uma matriz de edição que permite reparar a quebra dupla no ramo induzida pelo sistema.

[0184] Contudo, os inventores observaram que certos gRNA pareciam ainda ser muito tóxicos, apesar do controle de sua expressão assim como a da Cas9 com ajuda dos promotores indutíveis ao aTc, consequentemente limitando a eficácia de transformação das bactérias por ferramenta genética e então a modificação do cromossomo.

[0185] A fim de melhorar essa ferramenta genética, o plasmídeo de expressão de cas9 foi modificado, via inserção de um gene anti-CRISPR, acrllA4, sob controle de um promotor induzível à lactose. As eficácias de transformação de diferentes plasmídeos de expressão de gRNA puderam ser, assim, melhoradas de modo muito significativo, o que permite a obtenção de transformantes para todos os plasmídeos testados.

[0186] Também foi possível realizar a edição do locus bdhB no seio do genoma de C. acetobutylicum DSM 792, com ajuda de plasmídeos que não puderam ser introduzidos na cepa DSM 792 que contém pCas9 ind. As frequências de modificação observadas são as mesmas que aquelas observadas precedentemente (Wasels et al, 2017), com 100% de colônias testadas modificadas.

[0187] Concluindo, a modificação do plasmídeo de expressão de cas9 permite um melhor controle do complexo ribonucleoproteico Cas9-gRNA, facilitando vantajosamente a obtenção de transformantes nos quais a ação de Cas9 pode ser desencadeada a fim de obter mutantes de interesse. EXEMPLO n°2 Materiais e métodos Condições de cultura

[0188] C. beijerinckii DSM 6423 foi cultivado em meio 2YTG (Tryptone 16 g L-1, extrato de levedura 10 g L-1, glucose 5 g L-1, NaCl 4 g L-1). E. coli NEB 10-beta e INV110 foram cultivados em meio LB (Tryptone 10 g L-1, extrato de levedura 5 g L-1, NaCl 5 g L-1). Os meios sólidos foram realizados adicionando 15 g L-1 de agarose aos meios líquidos. Eritromicina (em concentrações de 20 ou 500 mg L-1 respectivamente em meio 2YTG ou LB), cloranfenicol (25 ou 12,5 mg L-1 respectivamente em LB sólido ou líquido) e tianfenicol (15 mg L-1 em meio 2YTG) ou espectinomicina (em concentrações de 100 ou 650 mg L-1 respectivamente em meio LB ou 2YTG) foram utilizados se necessário. Ácidos nucleicos e vetores plasmídicos

[0189] Todas as enzimas e kits foram utilizados seguindo as recomendações dos fornecedores.

[0190] Os testes de PCR sobre colônia respeitaram o seguinte protocolo:

[0191] Uma colônia isolada de C. beijerinckii DSM 6423 é ressuspensa em 100 µl de Tris 10 mM pH 7,5 EDTA 5 mM. Essa solução é aquecida a 98 °C durante 10 min sem agitação. 0,5 µl desse lisado bacteriano pode ser então utilizado como matriz de PCR nas reações de 10 µl com a Phire (Thermo Scientifrc), a Phusion (Thermo Scientifrc), a Q5 (NEB) ou a KAPA2G Robust (Sigma-Aldrich) polimerase.

[0192] A lista de iniciadores que serviram ao conjunto de construções (nome/sequência de DNA) é detalhada abaixo: ΔcatB_fwd: TGTTATGGATTATAAGCGGCTCGAGGACGTCAAACCATGTTA

ATCATTGC ΔcatB_rev: AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGCAATTTCACCAAAGAAT

TCGCTAGC ΔcatB_gRNA_rev AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGGGGCAAAAGTGTAAAGA

CAAGCTTC RH076: CATATAATAAAAGGAAACCTCTTGATCG RH077: ATTGCCAGCCTAACACTTGG RH001: ATCTCCATGGACGCGTGACGTCGACATAAGGTACCAGGAATT

AGAGCAGC RH002: TCTATCTCCAGCTCTAGACCATTATTATTCCTCCAAGTTTGC

T RH003: ATAATGGTCTAGAGCTGGAGATAGATTATTTGGTACTAAG RH004: TATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGAAGCGCTTATTATT

GCATTAGC pEX-fwd: CAGATTGTACTGAGAGTGCACC pEX-rev: GTGAGCGGATAACAATTTCACAC pEC750C-fwd CAATATTCCACAATATTATATTATAAGCTAGC M13-rev: CAGGAAACAGCTATGAC RH010: CGGATATTGCATTACCAGTAGC RH011: TTATCAATCTCTTACACATGGAGC RH025: TAGTATGCCGCCATTATTACGACA RH134: GTCGACGTGGAATTGTGAGC pNF2_fwd: GGGCGCACTTATACACCACC pNF2_rev: TGCTACGCACCCCCTAAAGG RH021 ACTTGGGTCGACCACGATAAAACAAGGTTTTAAGG RH022 TACCAGGGATCCGTATTAATGTAACTATGATATCAAT

TCTTG aad9-fwd2 ATGCATGGTCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTA

GTTTTATGG aad9-rev ATGCGAGTTAACAACTTCTAAAATCTGATTACCAATT

AG RH031 ATGCATGGATCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTT

AGTTTTATGG RH032 ATGCGAGAGCTCAACTTCTAAAATCTGATTACCAATT

AG RH138 ATGCATGGATCCGTCTGACAGTTACCAGGTCC RH139 ATGCGAGAGCTCCAATTGTTCAAAAAAATAATGGCGG

AG RH140 ATGCATGGATCCCGGCAGTTTTTCTTTTTCGG RH141 ATGCGAGAGCTCGGTTAAATACTAGTTTTTAGTTACA

GAC

[0193] OS nove vetores plasmídicos seguintes foram preparados: - Plasmídeo N°1: pEX-A258-ΔcatB (SEQ ID NO: 17)

[0194] O mesmo contém o fragmento de DNA sintetizado ΔcatB clonado em um plasmídeo pEX-A258. Esse fragmento ΔcatB compreende i) um cassete de expressão de um RNA guia marcando o gene catB (gene de resistência ao cloroanfenicol que codifica uma cloroanfenicol-O-acetiltransferase - SEQ ID NO: 18) de C. beijerinckii DSM6423 sob o controle de um promotor indutível à anidrotetraciclina (cassete de expressão: SEQ ID NO: 19), e ii) uma matriz de edição (SEQ ID NO: 20) que compreende 400 pb homólogos situados acima e abaixo do gene catB. - Plasmídeo N°2: pCas9ind-ΔcatB (ver Figura 2 e SEQ ID NO: 21)

[0195] O mesmo contém o fragmento ΔcatB amplificado por PCR (iniciadores ΔcatB_fwd e ΔcatB_rev) e clonado no pCas9ind (descrito na ordem de Patente Nº WO2017/064439 - SEQ ID NO: 22) após digestão de diferentes DNA por enzimas de restrição Xhol. - Plasmídeo N°3: pCas9acr (ver Figura 3 e SEQ ID NO: 23) - Plasmídeo N°4: pEC750S-uppHR (ver Figura 4 e SEQ ID NO: 24)

[0196] O mesmo contém uma matriz de representação (SEQ ID NO: 25) utilizada para a eliminação do gene upp e constituída por dois fragmentos de DNA homólogos acima e abaixo do gene upp (tamanhos respectivos: 500 (SEQ ID NO: 26) e 377 (SEQ ID NO: 27) pares de bases). A montagem foi obtida com ajuda do sistema de clonagem Gibson (New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix 2X). Para isso, as partes acima e abaixo foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico da cepa DSM 6423 (ver Maté de Gerando et al., 2018 e número de acesso PRJEB11626 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626)) com ajuda dos iniciadores respectivos RH001 / RH002 et RH003 / RH004. Esses dois fragmentos foram em seguida montados no pEC750S anteriormente linearizado pela restrição enzimática (enzimas de restrição SalI et SacI). - Plasmídeo N°5: pEX-A2-gRNA-upp (ver Figura 5 e SEQ ID NO: 28)

[0197] Esse plasmídeo compreende o fragmento de DNA gRNA- upp que corresponde a um cassete de expressão (SEQ ID NO: 29) de um RNA guia que marca o gene upp (protoespaçador que marca upp (SEQ ID NO:31)) sob o controle de um promotor constitutivo (RNA que não codifica a sequência SEQ ID NO: 30), inserida em um plasmídeo de replicação nomeado pEX-A2. - Plasmídeo N°6: pEC750S-Δupp (ver Figura 6 e SEQ ID NO: 32)

[0198] O mesmo tem como base o plasmídeo pEC750S-uppHR (SEQ ID NO: 24) e contém além disso o fragmento de DNA que comporta um cassete de expressão de um RNA guia que marca o gene upp sob o controle de um promotor constitutivo.

[0199] Esse fragmento foi inserido em um pEX-A2, chamado pEX-A2-gRNA-upp. A inserção foi em seguida amplificada por PCR com os iniciadores pEX-fwd e pEX-rev, depois digerida com as enzimas de restrição XhoI e NcoI. Enfim, esse fragmento foi clonado por ligação no pEC750SuppHR anteriormente digerido pelas mesmas enzimas de restrições para obter o pEC750S-Δupp. - Plasmídeo N°7: pEC750C-Δupp (ver Figura 7 e SEQ ID NO : 33)

[0200] A fita que comporta o RNA guia assim como a matriz de reparação foram em seguida amplificadas com os iniciadores pEC750C-fwd e M13-rev. O amplicon foi digerido por restrição enzimática com as enzimas XhoI e SacI, depois clonado por ligação enzimática com o pEC750C para obter o pEC750C-Δupp. - Plasmídeo N°8: pGRNA-pNF2 (ver Figura 8 e SEQ ID NO: 34)

[0201] Esse plasmídeo tem como base pEC750C e contém um cassete de expressão de um RNA guia que marca o plasmídeo pNF2 (SEQ ID NO: 118). - Plasmídeo N°9: pCas9ind-gRNA_catB (ver Figura 16 e SEQ ID NO: 38).

[0202] O mesmo contém a sequência que codifica para o RNA guia que marca o locus catB amplificado pelo PCR (iniciadores ΔcatB_fwd e ΔcatB_gRNA_rev) e clonados no pCas9ind (descritos no pedido de Patente Nº: WO2017/064439) após digestão de diferentes DNA pela enzima de restrição Xhol e ligadura. - Plasmídeo N°10: pNF3 (ver Figura 25 e SEQ ID NO: 119)

[0203] O mesmo contém uma parte do pNF2, que compreende notavelmente a origem de replicação e um gene que codifica para uma proteína de replicação de plasmídeo (CIBE_p20001), amplificada com os iniciadores RH021 e RH022. Esse produto de PCR foi em seguida clonado no nível de locus de restrição SalI e BamHI no plasmídeo pUC19 (SEQ ID NO: 117). - Plasmídeo N°11: pEC751S (ver Figura 26 e SEQ ID NO: 121)

[0204] O mesmo contém todos os elementos do pEC750C (SEQ ID NO: 106), salvo o gene de resistência ao cloranfenicol catP (SEQ ID NO: 70). Esse último foi substituído pelo gene aad9 do Enterococcus faecalis (SEQ ID NO: 130), que confere uma resistência à espectinomicina. Esse elemento foi amplificado com os iniciadores aad9-fwd2 e aad9-rev a partir do plasmídeo pMTL007S-El (SEQ ID NO: 120) e clonado nos locus AvaII e HpaI do pEC750C, no lugar do gene catP (SEQ ID NO: 70). - Plasmídeo N°12: pNF3S (ver Figura 27 e SEQ ID NO: 123)

[0205] O mesmo contém todos os elementos do pNF3, com uma inserção do gene aad9 (amplificado com os iniciadores RH031 e RH032 a partir do pEC751S) entre os locus BamHI e SacI. - Plasmídeo N°13: pNF3E (ver Figura 28 e SEQ ID NO: 124)

[0206] O mesmo contém todos os elementos do pNF3, com uma inserção do gene ermB de Clostridium difficile (SEQ ID NO: 131) sob o controle do promotor miniPthl. Esse elemento foi amplificado a partir do pFW01 com os iniciadores RH138 e RH139 e clonado entre os locus BamHI e SacI do pNF3E. - Plasmídeo N°14: pNF3C (ver Figura 29 e SEQ ID NO: 125)

[0207] O mesmo contém todos os elementos do pNF3, com uma inserção do gene catP de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 70). Esse elemento foi amplificado a partir do pEC750C com os iniciadores RH140 e RH141 e clonado entre os locus BamHI e SacI do pNF3E. Resultados n°1 Transformação da cepa C. beijerinckii DSM 6423

[0208] Os plasmídeos foram introduzidos e replicados em uma cepa de E. coli dam- dcm- (INV110, Invitrogen). Isso permite eliminar as metilações de tipo Dam e Dcm sobre o plasmídeo pCas9ind-ΔcatB antes de introduzir por transformação na cepa DSM 6423 de acordo com o protocolo descrito por Mermelstein et al. (1993), com as modificações a seguir: a cepa é transformada com uma quantidade mais importante de plasmídeo (20 µg), a uma DO 600 de 0,8, e com ajuda dos parâmetros de eletroporação seguintes: 100 Ω, 25 µF, 1400 V. O esfregaço em uma placa de Petri contendo a eritromicina (20 µg/ml) permitiu assim obter transformantes de C. beijerinckii DSM 6423 contendo o plasmídeo pCas9ind-

ΔcatB. Indução da expressão de cas9 e obtenção da cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB

[0209] Várias colônias resistentes à eritromicina foram em seguida retomadas em 100 µl de meio de cultura (2YTG) e depois diluídas em série até um fator de diluição de 104 em um meio de cultura. Para cada colônia, oito µl de cada diluição foram depositados sobre uma placa de Petri que contém a eritromicina e de anidrotetraciclina (200 ng/ml) que permite induzir a expressão do gene que codifica a nuclease Cas9.

[0210] Após a extração do DNA genômico, a eliminação do gene catB no seio dos clones que cresceram sobre essa placa de Petri foi verificada por PCR, com ajuda de iniciadores RH076 e RH077 (ver Figura 9). Verificação da sensibilidade da cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB ao tianfenicol

[0211] Para assegurar que a eliminação do gene catB confere de fato uma sensibilidade nova ao tianfenicol, as análises comparativas sobre o meio ágar foram realizadas. As pré-culturas de C. beijerinckii DSM 6423 e C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB foram realizadas em meio 2YTG depois que 100 µl dessas pré-culturas foram espalhadas sobre os meios de ágar 2YTG suplementados ou não em tianfenicol a uma concentração de 15 mg/l. A figura 10 permite observar que a única cepa inicial C. beijerinckii DSM 6423 tem capacidade para crescer em um meio suplementado em tianfenicol. Eliminação do gene upp pela ferramenta CRISPR-Cas9 na cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB

[0212] Um clone da cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB foi anteriormente transformado com o vetor pCas9acr e não apresentou metilação aos níveis dos motivos reconhecidos pelas metiltransferases de tipo dam e dcm (preparados a partir de uma bactéria Escherichia coli que apresenta o genótipo dam dcmj. A verificação da presença do plasmídeo pCas9acr mantido na cepa C. beijerinckii DSM 6423 foi verificada por PCR na colônia com os iniciadores RH025 e RH134.

[0213] Um clone resistente à eritromicina foi em seguida transformado com pEC750C-Δupp anteriormente desmetilado. As colônias assim obtidas foram selecionadas no meio que continha eritromicina (20 µg/ml), tianfenicol (15 µg/ml) e lactose (40 mM).

[0214] Vários desses clones foram em seguida ressuspensos em 100 µl de meio de cultura (2YTG) e depois diluídos em série em um meio de cultura (até um fator de diluição de 104). Cinco µl de cada diluição foram depositados em placa de Petri que continha eritromicina, tianfenicol e anidrotetraciclina (200 ng/ml) (ver Figura 11).

[0215] Para cada clone, duas colônias resistentes ao aTc foram testadas por colônia PCR com os iniciadores destinados a amplificar o locus upp (ver Figura 12). Eliminação do plasmídeo natural pNF2 pela ferramenta CRISPR- Cas9 na cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB

[0216] Um clone da cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB foi anteriormente transformado com o vetor pCas9ind sem apresentar metilação aos níveis de motivos reconhecidos pelas metiltransferases de tipo Dam e Dcm (preparados a partir de uma bactéria Escherichia coli que apresenta o genótipo dam- dcm). A presença do plasmídeo pCas9ind no seio da cepa C. beijerinckii DSM6423 foi verificado por PCR com os iniciadores pCas9ind_fwd (SEQ ID NO: 42) e pCas9ind _rev (SEQ ID NO: 43) (ver Figura 13).

[0217] Um clone resistente à eritromicina foi em seguida utilizado para transformar o pGRNA-pNF2, preparado a partir de uma bactéria Escherichia coli que apresenta o genótipo dam- dcm-.

[0218] Várias colônias obtidas no meio que contém a eritromicina (20 µg/ml) e o tianfenicol (15 µg/ml) foram ressuspensas em um meio de cultura e diluídas em série até um fator de diluição de 104. Oito µl de cada diluição foram depositados em uma placa de Petri que continha eritromicina, tianfenicol e anidrotetraciclina (200 ng/ml) a fim de induzir a expressão do sistema CRISPR/Cas9.

[0219] A ausência do plasmídeo natural pNF2 foi verificada por PCR com os iniciadores pNF2_fwd (SEQ ID NO: 39) e pNF2_rev (SEQ ID NO: 40) (ver Figura 14). Conclusões

[0220] Ao longo desse trabalho, os inventores foram bem- sucedidos em introduzir e manter diferentes plasmídeos no seio da cepa Clostridium beijerinckii DSM 6423. Os mesmos foram bem-sucedidos em suprimir o gene catB com ajuda de uma ferramenta do tipo CRISPR-Cas9 baseada na utilização de apenas um plasmídeo. A sensibilidade ao tianfenicol das cepas recombinantes obtidas foram confirmadas por testes em meio ágar.

[0221] Essa eliminação lhes permitiu utilizar a ferramenta CRISPR-Cas9 que necessita de dois plasmídeos descritos no pedido de Patente Nº FR1854835. Dois exemplos que permitem demonstrar o interesse dessa aplicação foram realizados: a eliminação do gene upp e a eliminação de um plasmídeo natural não essencial para a cepa Clostridium beijerinckii DSM 6423. Resultados n°2 Transformação das cepas C. beijerinckii

[0222] Os plasmídeos preparados na cepa de E. coli NEB 10-beta são igualmente utilizados para transformar a cepa C. beijerinckii NCIMB 8052. Ao contrário, para C. beijerinckii DSM 6423, os plasmídeos foram anteriormente introduzidos e replicados em uma cepa de E. coli dam- dcm- (INV110, Invitrogen). Isso permitiu eliminar as metilações de tipo Dam e Dcm sobre os plasmídeos de interesse antes de introduzí-los por transformação em uma cepa DSM 6423.

[0223] A transformação é similarmente realizada de outra forma por cada cepa, isso é, segundo o protocolo descrito por Mermelstein et al. 1992, com as modificações a seguir: a cepa é transformada com uma quantidade mais importante de plasmídeo (5-20 µg), a uma DO600 de 0,6-0,8, e os parâmetros de eletroporação são 100 Ω, 25 µF, 1400 V. Após 3h de regeneração no 2YTG, as bactérias são espalhadas em uma placa de Petri (2YTG ágar) que contém o antibiótico desejado (eritromicina: 20-40 µg/ml; tianfenicol: 15 µg/ml; espectinomicina: 650 µg/ml). Comparação das eficácias de transformação das cepas de C. beijerinckii DSM 6423

[0224] Transformações foram realizadas em duplicados biológicos nas cepas de C. beijerinckii a seguir: DSM 6423 selvagem, DSM 6423 ΔcatB e DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2 (Figura 30). Para isso, o vetor pCas9ind, notavelmente difícil de ser utilizado para modificar uma bactéria porque não permitia boas eficácias de transformação, foi utilizado. O mesmo comporta, além disso, um gene que confere à cepa uma resistência à eritromicina, antibiótico para o qual as três cepas são sensíveis.

[0225] Os resultados indicam um aumento da eficácia de transformação de um fator de cerca de 15-20 imputável à perda do plasmídeo natural pNF2.

[0226] A eficácia de transformação também foi testada para o plasmídeo pEC750C, que confere uma resistência ao tianfenicol, unicamente nas cepas DSM 6423 ΔcatB (IFP962 ΔcatB) e DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2 (IFP963 ΔcatB ΔpNF2), uma vez que a cepa selvagem é resistente a esse antibiótico (Figura 31). Para esse plasmídeo, o ganho em eficácia de transformação foi ainda mais flagrante (melhora de um fator de cerca de 2.000). Comparação das eficácias de transformação dos plasmídeos pNF3 com outros plasmídeos

[0227] A fim de determinar a eficácia da transformação de plasmídeos que contém a origem de replicação do plasmídeo natural pNF2, os plasmídeos pNF3E e pNF3C foram introduzidos na cepa C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2. A utilização de vetores que contém os genes de resistência à eritromicina ou ao cloroanfenicol permite comparar a eficácia da transformação do vetor em função da natureza do gene resistente. Os plasmídeos pFW01 e pEC750C também foram transformados. Esses dois plasmídeos contêm genes da resistência a antibióticos diferentes (respectivamente a eritromicina e o tianfenicol) e são atualmente utilizados para transformar C. beijerinckii e C. acetobutylicum.

[0228] Como mostrado na Figura 32, os vetores baseados no pNF3 apresentam uma excelente eficácia de transformação, e são notavelmente utilizáveis em C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2. Em particular, o pNF3E (que contém um gene de resistência à eritromicina) mostra uma eficácia de transformação claramente superior àquela do pFWOI, que compreende o mesmo gene de resistência. Esse mesmo plasmídeo não pode ser introduzido na cepa C. beijerinckii DSM 6423 selvagem (0 colônias obtidas com 5 µg de plasmídeos transformados em duplicado biológico), o que demonstra o impacto da presença do plasmídeo natural pNF2. Verificação da transformabilidade dos plasmídeos pNF3 em outras cepas/espécies

[0229] Para ilustrar a possibilidade de utilizar esse novo plasmídeo em outras cepas solvogênicas de Clostridium, os inventores realizaram uma análise comparativa das eficácias de transformação dos plasmídeos pFW01, pNF3E et pNF3S na cepa ABE C. beijerinckii NCIMB 8052 (Figura 33). Sendo a cepa NCIMB 8052 naturalmente resistente ao tianfenicol, o pNF3S, que confere uma resistência à espectinomicina, foi utilizado no lugar do pNF3C.

[0230] Os resultados demonstram que a cepa NCIMB 8052 é transformável com os plasmídeos baseados sobre o pNF3, o que prova que esses vetores são aplicáveis à espécie C. beijerinckii grosso modo. A aplicabilidade dessa sequência de vetores de síntese baseados no pNF3 também foi testada na cepa referência DSM 792 de C. acetobutylicum. Um teste de transformação mostrou assim a possibilidade de transformar essa cepa pelo plasmídeo pNF3C (eficácia de transformação de 3 colônias observadas por µg de DNA transformados contra 120 colônias/µg para o plasmídeo pEC750C).

Verificação da compatibilidade dos plasmídeos pNF3 com a ferramenta genética descrita no pedido de Patente NºFR18/73492

[0231] O pedido de Patente Nº FR18/73492 descreve a cepa ΔcatB assim como a utilização de um sistema CRISPR/Cas9 em dois plasmídeos que necessitam da utilização de um gene de resistência à eritromicina e de um gene de resistência ao tianfenicol. Para demonstrar o interesse da nova sequência de plasmídeos pNF3, o vetor pNF3C foi transformado na cepa ΔcatB que já contém o plasmídeo pCas9acr. A transformação, realizada em duplicado, mostrou uma eficácia de transformação de 0,625 ± 0,125 colônias/µg de DNA (média ± erro padrão), o que prova que um vetor baseado no pNF3C pode ser utilizado em combinação com o pCas9acr na cepa ΔcatB.

[0232] Paralelamente a esses resultados, uma parte do plasmídeo pNF2 que compreende sua origem de replicação (SEQ ID NO: 118) pode ser reutilizado com sucesso para criar uma nova sequência de vetores naves (SEQ ID NO: 119, 123, 124 e 125), personalizáveis, permitindo notavelmente sua replicação em uma cepa de E. coli assim como sua reintrodução em C. beijerinckii DSM 6423. Esses novos vetores apresentam eficácias de transformação vantajosas para realizar a edição genética por exemplo em C. beijerinckii DSM 6423 e suas derivações, particularmente com ajuda da ferramenta CRISPR/Cas9 que compreende dois ácidos nucleicos diferentes.

[0233] Esses novos vetores também puderam ser testados com sucesso em uma outra cepa de C. beijerinckii (NCIMB 8052), e de espécie de Clostridium (particularmente C. acetobutylicum), demonstrando sua aplicabilidade em outros organismos do filo de Firmicutes. Um teste também foi realizado em Bacillus. Conclusões

[0234] Esses resultados demonstram que a supressão do plasmídeo natural pNF2 aumenta significativamente as frequências de transformação da bactéria que o continha (de um fator de cerca de 15 para o pFW01 e de um fator de cerca de 2000 para o pEC750C). Esse resultado é particularmente interessante no caso de bactérias do gênero Clostridium, conhecidas por serem difíceis de transformar, e particularmente para a cepa C. beijerinckii DSM 6423 que sofre naturalmente de uma eficácia de transformação fraca (inferior a 5 colônias/µg de plasmídeo.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Ácido nucleico que reconhece o gene catB de sequência SEQ ID NO: 18 ou uma sequência idêntica a pelo menos 70% desta no seio do genoma de uma bactérias do gênero Clostridium.

2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico é selecionado dentre um cassete de expressão e um vetor, de preferência um plasmídeo.

3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um RNA guia (gRNA) e/ou uma matriz de modificação.

4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria Clostridium é uma bactéria com capacidade para produzir isopropanol no estado selvagem.

5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria Clostridium é uma bactéria C. beijerinckii cujo sub-clado é selecionado dentre DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006 e um sub-clado que apresenta pelo menos 95% de identidade com a cepa DSM6423.

6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que se trata do plasmídeo pCas9ind-ΔcatB de sequência SEQ ID NO: 21 ou do plasmídeo pCas9ind-gRNA_catB de sequência SEQ ID NO: 38.

7. Utilização de um ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 6, para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria Clostridium com capacidade para produzir isopropanol no estado selvagem.

8. Utilização de um ácido nucleico que reconhece o gene catB de sequência SEQ ID NO: 18 ou uma sequência idêntica a pelo menos 70% desta no seio do genoma de C. beijerinckii DSM 6423 para transformar e/ou modificar geneticamente uma bactéria C. beijerinckii DSM 6423.

9. Utilização de um ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito ácido nucleico não apresenta metilação nos níveis de motivos reconhecidos pelas metiltransferases do tipo Dam e Dcm, para transformar um sub-clado C. beijerinckii selecionado dentre DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006 e um sub-clado que apresenta pelo menos 95%, de preferência 97%, de identidade com a cepa DSM 6423.

10. Processo para transformar e preferencialmente modificar geneticamente uma bactéria do gênero Clostridium com ajuda de uma ferramenta de modificação genética, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de transformação da bactéria pela introdução na dita bactéria de um ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a bactéria é transformada com ajuda de uma ferramenta CRISPR utilizando uma enzima responsável pelo corte de pelo menos um ramo da sequência marca ou controlando a transcrição de uma anfenicol-O- acetiltransferase.

12. Bactéria do gênero Clostridium modificada geneticamente obtida com ajuda do processo, conforme definido na reivindicação 10 ou 11.

13. Bactéria C. beijerinckii DSM6423 ΔcatB depositada sob o número LMG P-31151.

14. Utilização da bactéria modificada geneticamente, conforme definido na reivindicação 12, ou da bactéria C. beijerinckii DSM6423 ΔcatB depositada sob o número LMG P- 31151, conforme definido na reivindicação 13, para produzir um solvente, de preferência isopropanol, ou uma mistura de solventes, de preferência em escala industrial.

15. Kit que compreende (i) um ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 6, e (ii) pelo menos uma ferramenta selecionada dentre os elementos de uma ferramenta de modificação genética; um ácido nucleico enquanto gRNA; um ácido nucleico enquanto matriz de reparação; pelo menos um par de iniciadores; e um indutor que permite a expressão de uma proteína codificada pela dita ferramenta.