JP2023127863A - 好熱菌のゲノム改変方法、ゲノム改変好熱菌の製造方法、及び好熱菌のゲノム編集キット - Google Patents
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Abstract
【課題】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して好熱菌ゲノムを改変する方法を提供する。【解決手段】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法であって、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含み、好熱菌細胞に導入された第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより、好熱菌ゲノムの標的配列を改変する。【選択図】図４
Description
本発明は、好熱菌のゲノム改変方法、及びゲノム改変好熱菌の製造方法、及び好熱菌のゲノム編集キットに関するものである。
近年の原油価格の高騰や、地球温暖化を引き起こす温室効果ガスの一つであるＣＯ２排出削減への意識の高まりから、原油に代わる再生可能エネルギーとしてバイオマスの活用に注目が集まっている。その中で、微生物の発酵作用を利用して人の生活に伴って排出される食品廃棄物や汚泥等の有機性廃棄物から有価物を回収する技術の開発が進められている。例えば、微生物を用いて、有機性廃棄物から生分解性プラスチックの原料である乳酸を生産させたり（特許文献１）、廃糖蜜からのエタノールを生産させたり（特許文献２）などの試みが行われているが、まだ有価物の生産効率が十分でなく実用的なレベルには至っていない。
このような課題に対し、微生物の遺伝子を組み換えることによって有価物の生産性を向上させる技術開発が行われている。遺伝子組換え技術において、近年ではゲノムＤＮＡ配列の任意の箇所を自在に改変できるゲノム編集技術が特に進展している。ゲノム編集によるゲノムの切断システムは複数あるが、効率性や操作性の点でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が主流となっている（非特許文献１～２）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、原核生物において外来から侵入しようとするファージやプラスミドなどを特異的に認識し、排除する適応免疫機構として発見された（非特許文献３～４）。ＣＲＩＳＰＲは、リピート配列及びスペーサー配列の２種類のＤＮＡ配列の繰り返しによって構成される。リピート配列は、同一のＣＲＩＳＰＲ内において共通した配列である一方、スペーサー配列はそれぞれ特異的な配列を有している。ＣＲＩＳＰＲの上流には、リーダー配列と呼ばれる領域が存在し、さらに上流にはＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ(ｃａｓ遺伝子群)が存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ファージなどの外来生物が浸入すると、Ｃａｓタンパク質により、該外来生物のＰｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列を認識して、そのゲノムの一部を切り取って、ＣＲＩＳＰＲ領域に取り込む（アダプテーション）。再度、同じ外来生物が侵入すると、ＣＲＩＳＰＲ領域から転写されたｃｒＲＮＡがこの外来ゲノムの相補的な配列を認識し、該ｃｒＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質が外来ゲノムを切断し、排除する（インターフェアランス）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、このような原核生物の適応免疫機構を利用して、比較的簡便に遺伝子操作できるように改良されたゲノム編集ツールである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ゲノムＤＮＡのいずれかの鎖のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する標的配列に対応した標的認識配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９ヌクレアーゼ又はその変異体とを含む複合体を、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位に結合させることにより、その標的部位への変異（挿入、欠失、又は塩基置換など）の導入を促進する。
Jinek M et al:(2012)Science,Vol.337(6096),pp.816-21
Le Cong et al:(2013)Science,Vol.339(6121),pp.819-23
Barrangou R et al:(2007)Science,Vol.315(5819),pp1709-12
Marraffini LA et al:(2008)Science,Vol.322(5909),pp1843-5
廃棄系バイオマスを分解して有価物を生産する微生物に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようなゲノム編集により遺伝子操作を加えることで、有価物の生産性を向上させたり、該微生物が本来生産する有価物と種類の異なる有価物を生産させたりすることが可能となる。
しかし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、あらゆる条件または生物に対して適用できるわけではない。従来より使用されるＣａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｓｐＣａｓ９である。このｓｐＣａｓ９のヌクレアーゼ活性の至適温度は３７℃程度であるため、３７℃以上の高温環境下で生育する好熱菌に対しては、このようなＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を十分に発揮させることができないという問題があった。
本発明の目的は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して好熱菌ゲノムを改変する方法、該方法によりゲノム改変された好熱菌の製造方法、及び好熱菌のゲノムを改変するゲノム編集キットを提供することにある。
本発明の第１の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法であって、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含み、好熱菌細胞に導入された第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより前記標的配列を改変することを特徴とする。
本発明の第２の態様は、第１の態様の好熱菌ゲノムの改変方法による好熱菌の製造方法である。
本発明の第３の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムを改変するゲノム編集キットであって、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを有し、かつ、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含まず、好熱菌細胞に導入された第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより前記標的配列を改変することを特徴とする。
本発明によれば、ゲノム編集技術を用いて好熱菌のゲノムを改変できる。
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下の実施形態は、本質的に好ましい例示であって、本発明、その適用物、あるいはその用途の範囲を制限することを意図するものではない。また、以下に説明する各実施形態、変形例、その他の例等の各構成は、本発明を実施可能な範囲において、組み合わせたり、一部を置換したりできる。
《実施形態》
（１）好熱菌ゲノムの改変方法の概要
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた好熱菌ゲノムの改変方法は、好熱菌が有する内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを利用して、該好熱菌ゲノム中の標的配列を改変することにある。
（１）好熱菌ゲノムの改変方法の概要
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた好熱菌ゲノムの改変方法は、好熱菌が有する内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを利用して、該好熱菌ゲノム中の標的配列を改変することにある。
標的配列は、任意に選択される配列である。例えば、ある特定の遺伝子の改変を目的とする場合、標的配列は、該遺伝子のＤＮＡ配列の全部であってもよいし、一部であってもよい。標的配列の改変は、塩基配列の切断、欠失、置換、挿入などを含む。欠失は、標的配列の一部または全部の配列を対象とする。切断は、標的配列の両鎖であってもよいし、単鎖であってもよい。このように、本発明の好熱菌ゲノムの改変方法では、好熱菌ゲノムに含まれる遺伝子を特異的に不活化したり、他の遺伝子に置換したりすることができる。本発明の好熱菌ゲノムの改変方法について、以下具体的に説明する。
（２）好熱菌
本発明の好熱菌は、４１℃と１２２℃の間で生育でき、好適には４５℃超から８０℃の温度範囲で生育できる微生物である。本発明の好熱菌は、好熱性細菌または好熱性微生物と呼ぶ場合がある。好熱菌は、アンアエロバクター（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アンアエロバクテリウム（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディセルロシルプター（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属、サーモアンアエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモアンアエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サーモブラキウム（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ）属、サーモハロバクター（Ｔｈｅｒｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）属種を含むから選択される。本発明では、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌が好熱菌として好適に使用される。
本発明の好熱菌は、４１℃と１２２℃の間で生育でき、好適には４５℃超から８０℃の温度範囲で生育できる微生物である。本発明の好熱菌は、好熱性細菌または好熱性微生物と呼ぶ場合がある。好熱菌は、アンアエロバクター（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アンアエロバクテリウム（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディセルロシルプター（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属、サーモアンアエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモアンアエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サーモブラキウム（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ）属、サーモハロバクター（Ｔｈｅｒｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）属種を含むから選択される。本発明では、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌が好熱菌として好適に使用される。
（２－１）モーレラ属細菌
本発明のモーレラ属細菌は、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、モーレラ・グリセリニ（Ｍ．ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）もしくはモーレラ・ムルデリ（Ｍ．ｍｕｌｄｅｒｉ）に分類される細菌、または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されない。
本発明のモーレラ属細菌は、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、モーレラ・グリセリニ（Ｍ．ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）もしくはモーレラ・ムルデリ（Ｍ．ｍｕｌｄｅｒｉ）に分類される細菌、または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されない。
モーレラ属細菌は、廃棄物バイオマスから有用物質の生産する宿主として利用される。モーレラ属細菌は、至適生育温度が５５～６０℃で、糖およびＨ２－ＣＯ２から酢酸を生産する。酢酸は、Ｃ１化合物としてはメタノールに次ぐ生産量があり、その用途は、化学、食品、医薬品の分野に使用され、産業上重要な化合物である。
好ましいモーレラ属細菌としては、広島県の畑由来の土壌サンプルから所定の方法により単離したＹ７２株である。Ｙ７２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(ＮＰＭＤ)(千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター)に平成２４年８月３０日付で寄託されている。Ｙ７２株の受託番号はＮＩＴＥ Ｐ－１４１２である。
ここで、細菌分類学的にモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属に分類される細菌とは、ＩＪＳＥＭ（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology）誌にモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属として発表された細菌またはバージェイズ・マニュアル（De Vos, Paul、外７名編、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"、第２版、第３巻、米国、シュプリンガー、２００９年）に従って分類した場合にモーレラ属に分類することが適当であると認められる細菌をいう。
本実施形態において、本発明のゲノム改変方法によりゲノム改変を行ったモーレラ属細菌は、形態、生産物、その他の表現形質が種の定義に合致しない場合であっても、モーレラ属細菌と同種とみなされる。
（３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型～III型のうちＩ型が好適に使用される。本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、モーレラ属細菌の内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いて、該モーレラ属細菌のゲノム中の標的配列を改変する。内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡにより誘導される。ｃｒＲＮＡは、モーレラ属細菌に導入された第１ポリヌクレオチドにより産生される。本発明では、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入しない。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型～III型のうちＩ型が好適に使用される。本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、モーレラ属細菌の内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いて、該モーレラ属細菌のゲノム中の標的配列を改変する。内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡにより誘導される。ｃｒＲＮＡは、モーレラ属細菌に導入された第１ポリヌクレオチドにより産生される。本発明では、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入しない。
（３－１）第１ポリヌクレオチド
第１ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端に向かってリーダー配列とＣＲＩＳＰＲアレイとが接続された構造を有する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列とリピート配列とが交互に繰り返し接続された構造を有する。具体的には、スペーサー配列の５’末端側及び３’末端側のそれぞれにリピート配列が接続される。
第１ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端に向かってリーダー配列とＣＲＩＳＰＲアレイとが接続された構造を有する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列とリピート配列とが交互に繰り返し接続された構造を有する。具体的には、スペーサー配列の５’末端側及び３’末端側のそれぞれにリピート配列が接続される。
本実施形態のＣＲＰＩＳＲアレイでは、５’末端から３’末端に向かって第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続されている。このように、本例の第１ポリヌクレオチドは、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する。以下では、第１リピート配列と第２リピート配列とを総称してリピート配列と呼ぶ場合がある。
リーダー配列の鎖長は、特に限定されないが、本実施形態では、４５５塩基である。本実施形態の第１リピート配列と第２リピート配列とは同一の配列である。第１リピート配列及び第２リピート配列の鎖長は、特に限定されないが、本実施形態では、３０塩基である。
スペーサー配列の鎖長は、特に限定されないが、例えば、１０～６０塩基、好ましくは２０～５０塩基、より好ましくは２５～４０塩基、さらに好ましくは３２～３７塩基である。スペーサー配列は、好熱菌細胞のゲノムＤＮＡ中の標的配列に相補的なｃｒＲＮＡ（詳細は後述する）が生成される程度に、該標的配列との相同性を有していればよい。具体的には、スペーサー配列は、標的配列と７５％以上の相同性を有する。好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と８０％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と８５％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と９０％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と９２％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と９４％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と９６％以上の相同性を有する。さらに好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と９８％以上の相同性を有する。最も好ましくは、スペーサー配列は、標的配列と１００％の相同性を有する。
本発明の第１ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、例えば薬剤耐性遺伝子である。薬剤耐性遺伝子により、形質転換されなかった細胞株は、該薬剤が添加された培地では生存できないため、形質転換された細胞株のみをセレクションできる。マーカー遺伝子は、リーダー配列の５’末端側に接続される。マーカー遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲアレイの３’末端側に接続されてもよい。本実施形態のマーカー遺伝子は、ｐｙｒＦ遺伝子である（詳細は後述する）。
（３－２）ｃｒＲＮＡ
モーレラ属細菌内に導入された第１ポリヌクレオチドにより、ｃｒＲＮＡが産生される。ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上の標的配列に結合し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に誘導するために用いるＲＮＡである。
モーレラ属細菌内に導入された第１ポリヌクレオチドにより、ｃｒＲＮＡが産生される。ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上の標的配列に結合し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に誘導するために用いるＲＮＡである。
ｃｒＲＮＡが特異的に結合する標的配列は、ゲノムのいずれかの鎖のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列の直後に位置するように設計することができる。ｃｒＲＮＡは、そのような標的配列に対応した標的認識配列（ＲＮＡ配列）を含む。ｃｒＲＮＡはゲノムＤＮＡ中の標的配列の相補鎖配列とＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対形成により結合する。
（３－３）内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ
内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、好熱菌細胞のゲノムに存在するＣａｓ遺伝子群（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）から発現されるタンパク質である。内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、好熱菌細胞に導入された第１ポリヌクレオチドによりＣａｓ遺伝子群から発現されるＣａｓタンパク質であれば特に限定されないが、第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの一例として、Ｃａｓ３タンパク質が挙げられる。Ｃａｓ３タンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、標的配列まで誘導される。Ｃａｓ３タンパク質は、ｃｒＲＮＡが認識し相補的に結合した標的配列（標的部位）を特異的に切断する。
内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、好熱菌細胞のゲノムに存在するＣａｓ遺伝子群（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）から発現されるタンパク質である。内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、好熱菌細胞に導入された第１ポリヌクレオチドによりＣａｓ遺伝子群から発現されるＣａｓタンパク質であれば特に限定されないが、第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの一例として、Ｃａｓ３タンパク質が挙げられる。Ｃａｓ３タンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、標的配列まで誘導される。Ｃａｓ３タンパク質は、ｃｒＲＮＡが認識し相補的に結合した標的配列（標的部位）を特異的に切断する。
（４）好熱菌ゲノムの改変方法
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法は、第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含む。本発明の導入工程において、第１ポリヌクレオチドは好熱菌のゲノムの所定位置に導入される。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法は、第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含む。本発明の導入工程において、第１ポリヌクレオチドは好熱菌のゲノムの所定位置に導入される。
導入工程は、エレクトロポレーション法によって行うことが好適である。エレクトロポレーション法は、電気穿孔法とも呼ばれ、電気パルスにより細胞膜に微小な穴を一時的に開け、第１ポリヌクレオチドを直接的に導入する手法である。第１ポリヌクレオチドは、直鎖状として好熱菌細胞に導入されてもよいし、所定のプラスミドに組み込んだ環状として好熱菌細胞に導入されてもよい。
本実施形態では、第１ポリヌクレオチドは、所定のプラスミドに組込まれて、モーレラ属細菌に導入される。モーレラ属細菌に導入された第１ポリヌクレオチドは、ゲノムの所定位置に相同組換えにより挿入される。この場合、一対のホモロジーアーム（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ａｒｍ；ＨＡ）の一方が第１ポリヌクレオチドの５’末端側に付加され、他方が第１ポリヌクレオチドの３’末端側に付加される。具体的には、一対のホモロジーアームは、ゲノム上の所望の挿入位置を挟んで上流領域及び下流領域と相補的な配列に設計される。一対のホモロジーアームは、第１ポリヌクレオチドが組み込まれる前のプラスミド等に予め設けられていてもよいし、第１ポリヌクレオチドに一対のホモロジーアームを付加した後にプラスミドに組み込まれてもよい。
（５）実施例１
以下、実施例１に基づいて本発明を具体的に説明する。実施例１では、標的配列の切断を目的として好熱菌ゲノムの改変を行う。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例では、モーレラ属細菌であるモーレラｓｐＹ７２株（以下、Ｙ７２株、又はＹ７２細胞と呼ぶ場合がある）を本発明の好熱菌細胞とした。
以下、実施例１に基づいて本発明を具体的に説明する。実施例１では、標的配列の切断を目的として好熱菌ゲノムの改変を行う。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例では、モーレラ属細菌であるモーレラｓｐＹ７２株（以下、Ｙ７２株、又はＹ７２細胞と呼ぶ場合がある）を本発明の好熱菌細胞とした。
（５－１）ＰＡＭ候補配列の探索
スペーサー配列は、好熱菌ゲノム中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列に基づいて決定される。本例では、Ｙ７２株のＰＡＭ配列を特定するために、Ｙ７２株のＰＡＭ配列の候補となるＰＡＭ候補配列を探索した。
スペーサー配列は、好熱菌ゲノム中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列に基づいて決定される。本例では、Ｙ７２株のＰＡＭ配列を特定するために、Ｙ７２株のＰＡＭ配列の候補となるＰＡＭ候補配列を探索した。
はじめに、Ｙ７２株のＣＲＩＳＰＲアレイを探索した。Ｙ７２株の全ゲノム情報をもとに繰り返し配列を探索したところ、特定の３０塩基（ＧＴＴＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣ:配列番号１）の繰り返し配列が確認されたため、この繰り返し配列をＹ７２株のリピート配列と推定し、このリピート配列を含む配列をＹ７２株のＣＲＩＳＰＲアレイとした。図１に示すようにＹ７２株のＣＲＩＳＰＲアレイには、９６個のスペーサー配列が含まれることが確認された。
これら９６個のスペーサー配列のそれぞれについてＢＬＡＳＴ検索を行い、外来遺伝子と高い相同性を示すスペーサー配列を探索した。なお、スペーサー配列のミスマッチの許容範囲は５塩基以内とした。
表１に示すように、ＢＬＡＳＴ検索により９番目のスペーサーについて比較的高い相同性を示す外来遺伝子由来の配列が３つ確認された。
表１に示す下線はミスマッチの塩基を示す。このことにより、この３つの配列がプロトスペーサー配列であると仮定し、これらの５’末端側、及び３’末端側の５塩基をＹ７２株におけるＰＡＭ候補配列とした。
具体的には、５’末端側のＰＡＭ候補配列を、５’－ＴＡＴＡＡ－３’（配列番号６）、５’－ＧＡＴＧＡ－３’（配列番号８）、及び、５’－ＧＡＴＴＡ－３’（配列番号１０）とし、３’末端側のＰＡＭ候補配列を、５’－ＧＴＧＴＴ－３’ （配列番号７）、５’－ＧＡＧＴＧ－３’（配列番号９）、及び５’－ＧＧＧＴＧ－３’（配列番号１１）とした。
（５－２）プラスミドの構築
次に、上記ＰＡＭ候補配列のうち、いずれのＰＡＭ候補配列がＹ７２株の内在性のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるか検討を行った。
次に、上記ＰＡＭ候補配列のうち、いずれのＰＡＭ候補配列がＹ７２株の内在性のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるか検討を行った。
本検討の概略について図２を用いて説明する。各ＰＡＭ候補配列とプロトスペーサーとを有するプラスミドを構築して、該プラスミドをＹ７２株に導入する。そしてＹ７２株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに正しく認識されるＰＡＭ候補配列を有するプラスミドはＹ７２株の内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより切断されて、該プラスミドの一部のＤＮＡ配列のＹ７２株ゲノムへの組み込みが阻害される（図２（Ａ））。一方Ｙ７２株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに正しく認識されないＰＡＭ候補配列を有するプラスミドであれば、Ｙ７２株の内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより切断されず、該プラスミドの一部のＤＮＡ配列が相同組換えによりＹ７２株ゲノムへ組み込まれる（図２（Ｂ））。このように、プラスミドの組換え効率を確認することで、上記ＰＡＭ候補配列からＹ７２株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるＰＡＭ配列を特定できる。
表２に示すように、１１種類のプラスミドについて検討を行った。具体的に説明すると、プロトスペーサー配列の５’末端側と３’末端側にＰＡＭ候補配列を付加したプラスミド（Ｎｏ.１～Ｎｏ.３）、プロトスペーサー配列の５’末端側にＰＡＭ候補配列を付加したプラスミド（Ｎｏ.４～Ｎｏ.６）、プロトスペーサー配列の３’末端側にＰＡＭ候補配列を付加したプラスミド（ＮＯ.７～Ｎｏ.９）、プロトスペーサー配列の５’末端側に５’－ＡＴＴＡ（配列番号４９）を付加したプラスミド（Ｎｏ.１０）、プロトスペーサー配列の５’末端側に５’－ＴＴＡ（配列番号５０）を付加したプラスミド（Ｎｏ.１１）である。以下、各プラスミドの作製について説明する。
（５－２－１）ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２、及びｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋの作製
上記１１種類のプラスミドは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋをベースとして作製される。ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋは、ｐＵＣ１９ＤＮＡに、Ｙ７２株のｐｙｒＦ遺伝子（ピリミジン塩基生合成経路遺伝子の１つ）を挿入したプラスミド（以下、ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２と呼ぶ）のｐｙｒＦ下流にプロトスペーサー配列（ＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＡＴ：配列番号２）を付加することで作製される。ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＹ７２株のｐｙｒＦ遺伝子（配列番号１２）を含む周辺３ｋｂｐを挿入することで作製される。ｐｙｒＦ遺伝子は、本実施形態のマーカー遺伝子である。
上記１１種類のプラスミドは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋをベースとして作製される。ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋは、ｐＵＣ１９ＤＮＡに、Ｙ７２株のｐｙｒＦ遺伝子（ピリミジン塩基生合成経路遺伝子の１つ）を挿入したプラスミド（以下、ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２と呼ぶ）のｐｙｒＦ下流にプロトスペーサー配列（ＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＡＴ：配列番号２）を付加することで作製される。ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＹ７２株のｐｙｒＦ遺伝子（配列番号１２）を含む周辺３ｋｂｐを挿入することで作製される。ｐｙｒＦ遺伝子は、本実施形態のマーカー遺伝子である。
具体的には、表３に示したｐｙｒＦ７２－ｕｐ－ｉｎ－Ｆ（配列番号１５）と、ｐｙｒＦ７２－ｄｎ－ｉｎ－Ｒ（配列番号１６）との組み合わせを用いて、表４に示す反応液の組成で、表５に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子周辺領域の約２．７ｋｂｐを増幅した。テンプレートＤＮＡは、Ｙ７２株の全ＤＮＡである。ＰＣＲには、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製)に含まれるものを用いた。
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)のプロトコルに従い、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１９ＤＮＡに、表６に示す反応液の組成で得られたＰＣＲフラグメントを挿入することよって、ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２を得た。
ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋは、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて作製した。具体的には、表３に示したｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－Ｆ（配列番号１７）と、ｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－Ｒ（配列番号１８）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２である。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋを得た。なお、インバースＰＣＲのＰＣＲ酵素にはＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。それ以外は、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコルに従った。このｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋを用いて上述した１１種類のプラスミドを作製した。
（５－２－２）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＡＴＡＡが付加されたプラスミドである。ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてプラスミドの作製を行った。以下の（６－２－３）～（６－２－１２）のプラスミドの作製についても同様に、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＡＴＡＡが付加されたプラスミドである。ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてプラスミドの作製を行った。以下の（６－２－３）～（６－２－１２）のプラスミドの作製についても同様に、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。
具体的に、表３に示したＹ７２ｓｐａｃｅｒ－５ｐａｍＡ－Ｆ（配列番号１９）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａを得た。
（５－２－３）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＧＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したＹ７２ｓｐａｃｅｒ－５ｐａｍＢ－Ｆ（配列番号２０）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＧＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したＹ７２ｓｐａｃｅｒ－５ｐａｍＢ－Ｆ（配列番号２０）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂを得た。
（５－２－４）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したＹ７２ｓｐａｃｅｒ－５ｐａｍＣ－Ｆ（配列番号２１）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したＹ７２ｓｐａｃｅｒ－５ｐａｍＣ－Ｆ（配列番号２１）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃを得た。
（５－２－５）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ａ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＴＧＴＴ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＡ－Ｒ（配列番号２４）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ａを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＴＧＴＴ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＡ－Ｒ（配列番号２４）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ａを得た。
（５－２－６）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｂ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＡＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＢ－Ｒ（配列番号２５）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｂを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＡＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＢ－Ｒ（配列番号２５）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｂを得た。
（５－２－７）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｃ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＧＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＣ－Ｒ（配列番号２６）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｃを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列にＧＧＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＣ－Ｒ（配列番号２６）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－３’－Ｃを得た。
（５－２－８）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ａ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＡＴＡＡ及びＧＴＧＴＴ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＡ－Ｒ（配列番号２４）とのプライマーセットを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ａを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ａは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＡＴＡＡ及びＧＴＧＴＴ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＡ－Ｒ（配列番号２４）とのプライマーセットを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ａである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ａを得た。
（５－２－９）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｂ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＧＡ及びＧＡＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＢ－Ｒ（配列番号２５）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｂを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｂは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＧＡ及びＧＡＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＢ－Ｒ（配列番号２５）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｂである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｂを得た。
（５－２－１０）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＴＡ及びＧＧＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＣ－Ｒ（配列番号２６）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＧＡＴＴＡ及びＧＧＧＴＧ－３’が付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示したｐｙｒＦ－ｄｎ２ｂｐ－Ｆ（配列番号２３）とＹ７２ｓｐａｃｅｒ－３ｐａｍＣ－Ｒ（配列番号２６）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃを得た。
（５－２－１１）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－４ｎｔ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－４ｎｔは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＡＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示した５ｐａｍＣ－４ｎｔ－Ｆ（配列番号２７）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－４ｎｔは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＡＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示した５ｐａｍＣ－４ｎｔ－Ｆ（配列番号２７）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｆｌａｎｋ－Ｃを得た。
（５－２－１２）ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－３ｎｔ
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－３ｎｔは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示した５ｐａｍＣ－３ｎｔ－Ｆ（配列番号２８）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－３ｎｔを得た。
表２に示すように、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－３ｎｔは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－ｂｌａｎｋのプロトスペーサー配列に５’－ＴＴＡが付加されたプラスミドである。具体的に、表３に示した５ｐａｍＣ－３ｎｔ－Ｆ（配列番号２８）と、ｐｙｒＦ－ｄｎ１ｂｐ－Ｒ（配列番号２２）との組み合わせを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃである。その後、得られたＰＣＲ産物をセルフライゲーションによりｐｐｙｒＦ－ｓｐａｃｅｒ－５’－Ｃ－３ｎｔを得た。
（５－３）ＰＡＭ配列の同定
続いてＹ７２株の内在性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるＰＡＭ配列の同定を行った。具体的には、上記（５－２－２）～（５－２－１２）で作製した１１種類のプラスミドをＹ７２－ｋｍ株にそれぞれ導入して、各プラスミドのゲノムへの組換え効率を検討したＹ７２－ｋｍ株は、Ｙ７２株の変異株である。
続いてＹ７２株の内在性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるＰＡＭ配列の同定を行った。具体的には、上記（５－２－２）～（５－２－１２）で作製した１１種類のプラスミドをＹ７２－ｋｍ株にそれぞれ導入して、各プラスミドのゲノムへの組換え効率を検討したＹ７２－ｋｍ株は、Ｙ７２株の変異株である。
図３に示すようにＹ７２－ｋｍ株は、Ｙ７２株のｐｙｒＦ遺伝子をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤ）プロモーターが融合されたカナマイシン耐性遺伝子ｋａｎｒに置換した株であるＹ７２－ｋｍ株は、Ｋｉｔａらの方法（Kita et al.:Isolation of Thermophilic Acetogens and Transformation of Them with the pyrF and kanr Genes. Biosci. Biotechnol. Biochem. 77(2): 301-306,2013）に基づいて作製された。なお、この方法は、特開２０１４－０７６００３号公報にも記載されている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されないＰＡＭ候補配列を有するプラスミドであれば、該プラスミドのｐｙｒＦ遺伝子配列からプロトスペーサー配列までの領域は、相同組換えによりＹ７２－ｋｍ株のｋａｎＲ遺伝子と置換され、Ｙ７２－ｋｍ株のゲノム内に組み込まれる。一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに認識されるＰＡＭ候補配列を有するプラスミドであれば、該プラスミドは消化されてしまうため、Ｙ７２－ｋｍ株のゲノム内に組み込まれない。このように、上記各プラスミドについてＹ７２－ｋｍ株の形質転換効率を比較することで、どのＰＡＭ候補配列がＹ７２株のＰＡＭ配列であるかを把握できる。
（５－３－１）各プラスミドの形質転換効率の検討
上述した１１種類の各プラスミドをＹ７２－ｋｍ株に以下の手順で導入し、形質転換効率を算出した。
上述した１１種類の各プラスミドをＹ７２－ｋｍ株に以下の手順で導入し、形質転換効率を算出した。
Ｙ７２―ｋｍ株は表９に示す完全合成培地にフルクトースが終濃度２ｇ／ｌになるように加えた培地を用いて、嫌気的にＯＤ６００＝０．１～０．５程度まで培養した。培養液２０ｍｌを集菌し、溶存酸素をＮ２ガスで置換した２７２ｍＭスクロースで２回洗浄した。
洗浄した菌体にＯＤ６００が約１．０になるように２７２ｍＭスクロースを適当な量を加えて懸濁し、菌体懸濁液４００μｌに各プラスミドを２μｇ加えた。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌＴＭ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ）、および電極間距離（ギャップ）０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオ・ラッド ラボラトリーズ）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーション後の菌体懸濁液を完全合成培地５ｍｌに２ｇ／ｌのフルクトースを加えた培地を用いて嫌気的に２日間培養した。２日間培養後の培養液全量を用いてロールチューブを作製し、５日間培養した。培養後のロールチューブに形成された全コロニー数を数えて、２μｇのプラスミドを用いているので形質転換効率＝全コロニー数／２とした。形質転換は合計で３回行い、その３回の平均値から形質転換効率を求めた。
表１２に示すように、プロトスペーサ―配列の５’末端側に５’－ＴＴＡ－３’の配列があると、Ｙ７２－ｋｍ株の形質転換は生じないことがわかった。このことにより、Ｙ７２株のＰＡＭ配列は、プロトスペーサー配列の５’側にある５’－ＴＴＡ－３’（配列番号５０）であることがわかった。
（５－４）内在性ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた遺伝子の破壊
次に、同定された上記のＰＡＭ配列に基づいてＹ７２株の遺伝子の破壊について検討を行った。本検討では、対象遺伝子をアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｈ）遺伝子（配列番号１３）とした。
次に、同定された上記のＰＡＭ配列に基づいてＹ７２株の遺伝子の破壊について検討を行った。本検討では、対象遺伝子をアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｈ）遺伝子（配列番号１３）とした。
本検討の概略について図４を用いて説明する。ａｌｄｈ遺伝子の一部の配列をスペーサー配列として、ｐｙｒＦ遺伝子の下流にリーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列を順に付加した配列を第１ポリヌクレオチドとする（以下では、スペーサー配列をspacer、リーダー配列をleader、第１リピート配列及び第２リピート配列をrepeatと呼ぶ場合がある）。この第１ポリヌクレオチドを付加したプラスミド（以下、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈと呼ぶ）と、ａｌｄｈ遺伝子の上流１ｋｂｐと下流１ｋｂｐとを連結させたフラグメント（以下、ｄａｌｄｈフラグメントと呼ぶ）とをＹ７２－ｋｍ株に共導入する。
ここでＹ７２－ｋｍ株のゲノム中のａｌｄｈ遺伝子が相同組換えによってｄａｌｄｈフラグメントに置換されたＹ７２－ｋｍ株をａｌｄｈ破壊株（図４の（Ａ））とし、Ｙ７２－ｋｍ株のゲノム中のａｌｄｈ遺伝子がｄａｌｄｈフラグメントに置換されなかったＹ７２－ｋｍ株をａｌｄｈ非破壊株（図４の（Ｂ））とするＹ７２－ｋｍ株に導入されたｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが相同組換えによりゲノムの所定の位置に組み込まれると、ａｌｄｈ非破壊株では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによりａｌｄｈ遺伝子を対象とした標的部位が切断されるため、ａｌｄｈ非破壊株の生育は阻害される。一方、ａｌｄｈ破壊株では、ａｌｄｈ遺伝子は変異しているため標的領域は切断されず生育できる。従って、このようなセレクションにより、Ｙ７２－ｋｍ株の破壊株をスクリーニングできる。以下、本検討について具体的に説明する。
（５－４－１）ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈの構築
図５に示すように、このａｌｄｈ遺伝子内のＴＴＡ（図５内の下線）から下流３６塩基をプロトスペーサー配列（配列番号２２）とした。決定したプロトスペーサー配列に基づいて、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈを構築した。
図５に示すように、このａｌｄｈ遺伝子内のＴＴＡ（図５内の下線）から下流３６塩基をプロトスペーサー配列（配列番号２２）とした。決定したプロトスペーサー配列に基づいて、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈを構築した。
具体的に、表３に示したｌｅａｄ－ｉｎ－Ｆ（配列番号２９）と、ｌｅａｄ－ｓｐ－Ｒ（配列番号３０）とのプライマーセット、及び、ｔｅｒｍ－ｓｐ－Ｆ（配列番号３１）、及びｔｅｒｍ－Ｒ（配列番号３２）とのプライマーセットを用いて、表１３に示す反応液の組成で、表１４に示す条件でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、Ｙ７２株の全ＤＮＡである。なお、このＰＣＲで使用した試薬は、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）である。
その後、得られた２種類のＰＣＲ産物と、ｌｅａｄ－ｉｎ－Ｆ（配列番号２９）及びｔｅｒｍ－Ｒ（配列番号３２）のプライマーセットとを用いて、ＳＯＥ－ＰＣＲを行い、１つのＤＮＡ断片Ａを得た。ＳＯＥ―ＰＣＲでは、表１５の反応液組成と表１７の条件でＰＣＲを行った後、表１５のＰＣＲ産物にプライマーを加えた表１６の反応液を作製し表１８の条件で再度ＰＣＲを行ってＤＮＡ断片Ａを得た。このＳＯＥ－ＰＣＲで使用した試薬は、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）である。
さらに、ｐｙｒＦ－ｄｎ－Ｆ（配列番号３３）と、ｐｙｒＦ－Ｒ（配列番号３４）とのプライマーセットを用いて、表７に示す反応液の組成で、表８に示す条件でインバースＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡは、ＤＮＡ断片Ａ及びｐＵＣ１９－ｐｙｒＦ７２である。このインバースＰＣＲにより増幅して得られた線状化ベクターは、第１ポリヌクレオチドを含む。この線状化ベクターを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてｐＵＣ１９に挿入し、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈを得た。
（５－４－２）ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントの構築
Ｙ７２株の全ＤＮＡを鋳型として、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｕｐ－ｉｎ－Ｆ（配列番号３５）と、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｕｐ－ｉｎ－Ｒ（配列番号３６）のプライマーセット及びＹ７２ａｌｄｈ－ｄｎ－ｉｎ－Ｆ（配列番号３７）と、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｄｎ－ｉｎ－Ｒ（配列番号３８）のプライマーセットを用いて、表１９に示す反応液組成で、表２０に示す条件でそれぞれａｌｄｈの上流側約１ｋｂｐと下流側約１ｋｂｐをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｓｍａ１により切断されたｐＵＣ１９に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） を用いて、クローニングし、ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈを得た。このｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈを鋳型にＹ７２ａｌｄｈ―１０００ｕｐ―Ｆ（配列番号３９）とＹ７２ａｌｄｈ―６００ｄｎ―Ｒ（配列番号４０）のプライマーセットを用いて表２１に示す反応液組成で、表２２に示す条件でＰＣＲを行い、ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントを得た。
Ｙ７２株の全ＤＮＡを鋳型として、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｕｐ－ｉｎ－Ｆ（配列番号３５）と、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｕｐ－ｉｎ－Ｒ（配列番号３６）のプライマーセット及びＹ７２ａｌｄｈ－ｄｎ－ｉｎ－Ｆ（配列番号３７）と、Ｙ７２ａｌｄｈ－ｄｎ－ｉｎ－Ｒ（配列番号３８）のプライマーセットを用いて、表１９に示す反応液組成で、表２０に示す条件でそれぞれａｌｄｈの上流側約１ｋｂｐと下流側約１ｋｂｐをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｓｍａ１により切断されたｐＵＣ１９に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） を用いて、クローニングし、ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈを得た。このｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈを鋳型にＹ７２ａｌｄｈ―１０００ｕｐ―Ｆ（配列番号３９）とＹ７２ａｌｄｈ―６００ｄｎ―Ｒ（配列番号４０）のプライマーセットを用いて表２１に示す反応液組成で、表２２に示す条件でＰＣＲを行い、ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントを得た。
（５－４－３）Ｙ７２－ｋｍ株への導入
ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈ及びｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントのＹ７２－ｋｍ株へ共導入した。Ｙ７２―ｋｍ株は表９に示す完全合成培地にフルクトースが終濃度２ｇ／ｌになるように加えた培地を用いて、嫌気的にＯＤ６００＝０．１～０．５程度まで培養した。培養液２０ｍｌを集菌し、溶存酸素をＮ２ガスで置換した２７２ｍＭスクロースで２回洗浄した。
ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈ及びｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントのＹ７２－ｋｍ株へ共導入した。Ｙ７２―ｋｍ株は表９に示す完全合成培地にフルクトースが終濃度２ｇ／ｌになるように加えた培地を用いて、嫌気的にＯＤ６００＝０．１～０．５程度まで培養した。培養液２０ｍｌを集菌し、溶存酸素をＮ２ガスで置換した２７２ｍＭスクロースで２回洗浄した。
洗浄した菌体にＯＤ６００が約１．０になるように２７２ｍＭスクロースを適当な量を加えて懸濁し、菌体懸濁液４００μｌにｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈを４μｇ、ｐＵＣ１９－ｄａｌｄｈフラグメントを２μｇ加えた。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌＴＭ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）、および電極間距離（ギャップ）０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーション後の菌体懸濁液を完全合成培地５ｍｌに２ｇ／ｌのフルクトースを加えた培地を用いて嫌気的に２日間培養した。２日間培養後の培養液全量を用いてロールチューブを作製し、５日間培養した。
（５－４－４）ａｌｄｈ破壊株のスクリーニング
ここで、チミン、シトシンおよびウラシル等のピリミジン塩基は、ウリジル酸を中心に相互変換されるため、ピリミジン塩基生合成経路遺伝子の１つであるｐｙｒＦ遺伝子を有するＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル非要求性であるのに対し、ｐｙｒＦ遺伝子を有さないＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル要求性となる。本例では、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが相同組換えによりＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれたＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル非要求性となる一方、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれなかったＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル要求性となる。従って、ウラシル不含の培地では、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれなかったＹ７２－ｋｍ株は生育できないため、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが組込まれたＹ７２－ｋｍ株のみをスクリーニングできる。
ここで、チミン、シトシンおよびウラシル等のピリミジン塩基は、ウリジル酸を中心に相互変換されるため、ピリミジン塩基生合成経路遺伝子の１つであるｐｙｒＦ遺伝子を有するＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル非要求性であるのに対し、ｐｙｒＦ遺伝子を有さないＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル要求性となる。本例では、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが相同組換えによりＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれたＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル非要求性となる一方、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれなかったＹ７２－ｋｍ株は、ウラシル要求性となる。従って、ウラシル不含の培地では、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがＹ７２－ｋｍ株のゲノムに組み込まれなかったＹ７２－ｋｍ株は生育できないため、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが組込まれたＹ７２－ｋｍ株のみをスクリーニングできる。
さらに、上述したようにａｌｄｈ非破壊株では、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがゲノムに組み込まれると、内在性のＣａｓヌクレアーゼによりａｌｄｈを標的として所定のＤＮＡ配列が切断されるため、生育できないが、ａｌｄｈ破壊株は、Ｙ７２－ｋｍ株のａｌｄｈ遺伝子が変異しているため、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈがゲノムに組み込まれても、ＤＮＡ配列は切断されず生育できる。このように、二重の選択圧をかけることで、ｐＹ７２ＣＲＩＳＰＲ－ｄａｌｄｈが組み込まれたＹ７２－ｋｍ株のうちａｌｄｈ破壊株のみのスクリーニングを行うことができる。
ウラシル不含の寒天培地に形成されたコロニーのうち１６個をピックして、aldh遺伝子を対象としたＰＣＲ産物を電気泳動した。図６（Ａ）に示すように、ａｌｄｈ非破壊株では１．６ｋｂｐ、ａｌｄｈ破壊株では１．２ｋｂｐにバンドが出現するようにプライマーを設計した。具体的には、ピックアップしたコロニーを２０μlのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁し、９８℃で１０分間熱処理したサンプルをＰＣＲの鋳型とした。Ｙ７２ａｌｄｈ－ｓｑ－Ｆ（配列番号４１）とＹ７２ａｌｄｈ―６００ｄｎ―Ｒ（配列番号４０）のプライマーセットを用いて表２３に示す反応液組成で、表２４に示す条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで使用した試薬は、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）である。
その結果、図６（Ｂ）に示すように、１６株中１２株が目的のａｌｄｈ非破壊株であることが確認された。すなわち、ａｌｄｈ非破壊株は、第１ポリヌクレオチドにより誘導された内在性のＲＮＡヌクレアーゼによって、ａｌｄｈ遺伝子が破壊された結果、ウラシル不含の寒天培地上にはａｌｄｈ遺伝子の破壊株の方が多くコロニーを形成したことがわかった。このように、本実施形態の好熱菌ゲノムの改変方法によると、モーレラ属細菌のゲノム中の標的配列を切断できる。加えて、本実施形態の好熱菌ゲノムの改変方法によると、第１ポリヌクレオチドをモーレラ属細菌に導入することにより、内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによってゲノムが改変されたモーレラ属細菌の製造方法として利用できる。
（６）実施例２
以下、実施例２に基づいて本発明を具体的に説明する。実施例２では、標的配列への塩基挿入を目的として好熱菌ゲノムの改変、及びゲノムが改変された好熱菌の製造を行う。以下では、実施例１と異なる構成について説明する。
以下、実施例２に基づいて本発明を具体的に説明する。実施例２では、標的配列への塩基挿入を目的として好熱菌ゲノムの改変、及びゲノムが改変された好熱菌の製造を行う。以下では、実施例１と異なる構成について説明する。
本例の導入工程は、第１ポリヌクレオチドと標的配列を改変するための第２ポリヌクレオチドとを好熱菌細胞に導入する工程である。第２ポリヌクレオチドは、ユーザーにより任意に設計される。例えば、第２ポリヌクレオチドは、標的配列の切断部位の上流領域及び下流領域に相補的に結合して、切断部位の間に塩基が挿入されるように設計されてもよいし、標的配列の切断部位の上流領域及び下流領域を相同組換えによって置換されるように設計されてもよい。第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドと共に好熱菌細胞に導入されてもよいし、第１ポリヌクレオチドとは別のタイミングで好熱菌細胞に導入されてもよい。第２ポリヌクレオチドの配列長は、特に限定されないが、１０００ｂｐ～１００００ｂｐ、好ましくは、１５００ｂｐ～５０００ｂｐ、より好ましくは、２０００ｂｐ～３０００ｂｐである。
このように、本例のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、第２ポリヌクレオチドの所定のＤＮＡ配列が内在性ＲＮＡヌクレアーゼにより切断された標的配列に挿入される。以下、具体的に説明する。
（７）内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用したＧ３ＰＤプロモーター挿入株の作製
第２ポリヌクレオチドとして挿入する遺伝子を、Ｙ７２株のゲノムからＰＣＲにより取得したｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤ）遺伝子のプロモーターを含む上流約０．３ｋｂｐとした（配列番号１４）。このＧ３ＰＤ遺伝子のプロモーターをａｌｄｈ遺伝子の上流１０００ｂｐとａｌｄｈ遺伝子で挟み込んだＤＮＡ断片を第２ポリヌクレオチドとした。
第２ポリヌクレオチドとして挿入する遺伝子を、Ｙ７２株のゲノムからＰＣＲにより取得したｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤ）遺伝子のプロモーターを含む上流約０．３ｋｂｐとした（配列番号１４）。このＧ３ＰＤ遺伝子のプロモーターをａｌｄｈ遺伝子の上流１０００ｂｐとａｌｄｈ遺伝子で挟み込んだＤＮＡ断片を第２ポリヌクレオチドとした。
具体的に、まずＹ７２株の全ＤＮＡを鋳型にＹ７２Ｇ３ＰＤｐｒｏ－Ｆ（配列番号４２）とＹ７２Ｇ３ＰＤ－ｐｒｏ－Ｒ－ＯＥ（配列番号４３）のプライマーセット及びＹ７２－ａｌｄｈ－Ｆ－ＯＥ（配列番号４４）とＹ７２ａｌｄｈ－Ｒ（配列番号４５）のプライマーセットを用いて、表２５の反応液組成で、表２６に示す条件でＰＣＲを行った。得られた２つのＰＣＲ産物をＹ７２Ｇ３ＰＤｐｒｏ－Ｆ（配列番号４２）とＹ７２ａｌｄｈ－ｉｎ－Ｒ（配列番号４６）のプライマーセットを用いて、ＳＯＥ－ＰＣＲにより一つのＤＮＡ断片Ｂとした。
具体的には、表２７の反応液組成と表２９の条件でＰＣＲを行った後、表２７のＰＣＲ産物にプライマーを加えた表２８の反応液を作製し、表３０の条件で再度ＰＣＲを行ってＤＮＡ断片Ｂを得た。このＤＮＡ断片Ｂと、Ｙ７２株の全ＤＮＡを鋳型にＹ７２ａｌｄｈ－１０００ｕｐ－ｉｎ－Ｆ（配列番号４７）とＹ７２ａｌｄｈｕｐ－Ｇ３ＰＤ－ｉｎ－Ｒ（配列番号４８）のプライマーセットを用いて表２５の反応液組成で、表３０の条件でＰＣＲをして得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｍａ１により切断されたｐＵＣ１９に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） を用いて、クローニングし、ｐＵＣ１９－Ｇ３ＰＤ－ａｌｄｈを得た。
このｐＵＣ１９－Ｇ３ＰＤ－ａｌｄｈを鋳型に、Ｙ７２ａｌｄｈ－１０００ｕｐ－Ｆ（配列番号３９）とＹ７２ａｌｄｈ－Ｒ（配列番号４５）のプライマーセットを用いて、表２５の反応液組成で、表３０の条件でＰＣＲを行い、第２ポリヌクレオチドを得た。これらのＰＣＲで使用した試薬は、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）である。
図７に示すように、本例のスペーサー配列はaldh遺伝子の開始コドン（ＧＴＧ）を含むように設計した（配列番号４４）。これにより、第１ポリヌクレオチドが組み込まれたＹ７２－ｋｍ株では、内在性のＲＮＡヌクレアーゼにより標的配列であるaldh遺伝子の所定の位置が切断され、第１ポリヌクレオチドと共導入されたドナーＤＮＡ（第２ポリヌクレオチド）が切断された部位に挿入される。本例に用いた第１ポリヌクレオチドは、上記実施例１と同様の方法で作製し、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドをＹ７２株に共導入した。
ドナーＤＮＡが挿入された目的の変異株についてスクリーニングを行った。スクリーニングの方法は上述した通りである。ウラシル非含有の寒天培地に形成された複数のコロニーから１２株をピックし、各株についてコロニーＰＣＲを行った。
図８（Ａ）に示すように、ドナーＤＮＡ非挿入株では１．０ｋｂｐ、ドナーＤＮＡ挿入株では１．３ｋｂｐにバンドが出現するようにプライマーを設計した。具体的に、ピックアップしたコロニーを２０μlのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁し、９８℃で１０分間熱処理したサンプルをＰＣＲの鋳型とした。Ｙ７２ａｌｄｈ－ｓｑ－Ｆ（配列番号４１）とＹ７２ａｌｄｈ―６００ｄｎ―Ｒ（配列番号４０）のプライマーセットを用いて表１９に示す反応液組成で、表２０に示す条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで使用した試薬は、ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）である。
その結果、１２株のうちレーン１０の株が元の１．０ｋｂｐから０．３ｋｂｐ長い１．３ｋｂｐになっており、目的の変異株であることが確認された。このように、本例の好熱菌のゲノム改変方法によって、モーレラ属細菌のゲノムの標的部位にドナーＤＮＡを挿入できることが確認された。加えて、第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドをモーレラ属細菌に導入することにより、ゲノム中の標的配列に所望のドナーＤＮＡが導入されたモーレラ属細菌を製造できる。
（８）特徴
（８－１）特徴１
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法は、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含む。導入された第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより標的配列を改変する。
（８－１）特徴１
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法は、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含む。導入された第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより標的配列を改変する。
本実施形態によると、内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを利用するため、モーレラ属細菌のような比較的温度が高い環境下で生育する好熱菌に対しても、ゲノム編集により標的配列の改変を行うことができる。このように好熱菌に対して比較的精度の高いゲノム改変を行うことができる。
（８－２）特徴２
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入しない。このことにより、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを用意する必要がないため、好熱菌のゲノム編集を比較的簡便に行うことができる。
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入しない。このことにより、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを用意する必要がないため、好熱菌のゲノム編集を比較的簡便に行うことができる。
（８－３）特徴３
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、ＰＡＭ配列は、標的配列の５’末端に位置し、かつ、５’－ＴＴＡ－３’を含む。このことにより、好熱菌であるモーレラ属細菌のＹ７２株のゲノム編集による標的配列の改変効率を確実に高めることができる。
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、ＰＡＭ配列は、標的配列の５’末端に位置し、かつ、５’－ＴＴＡ－３’を含む。このことにより、好熱菌であるモーレラ属細菌のＹ７２株のゲノム編集による標的配列の改変効率を確実に高めることができる。
（８－４）特徴４
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、導入工程において、第１ポリヌクレオチドと標的配列を改変するための第２ポリヌクレオチドとを好熱菌細胞に導入する。これにより、内在性ＲＮＡヌクレアーゼにより切断された標的配列の所定の箇所に第２ポリヌクレオチドの一部を挿入できる。その結果、目的遺伝子のノックインを行うことができる。
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、導入工程において、第１ポリヌクレオチドと標的配列を改変するための第２ポリヌクレオチドとを好熱菌細胞に導入する。これにより、内在性ＲＮＡヌクレアーゼにより切断された標的配列の所定の箇所に第２ポリヌクレオチドの一部を挿入できる。その結果、目的遺伝子のノックインを行うことができる。
（８－５）特徴５
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、第１ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子により、第１ポリヌクレオチドがゲノム中に組み込まれたポジティブの変異株をスクリーニングできる。その結果、例えば寒天培地上に生えてくるネガティブ株のコロニー数を抑えることができ、比較的簡便に目的の変異株を取得できる。
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、第１ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子により、第１ポリヌクレオチドがゲノム中に組み込まれたポジティブの変異株をスクリーニングできる。その結果、例えば寒天培地上に生えてくるネガティブ株のコロニー数を抑えることができ、比較的簡便に目的の変異株を取得できる。
（８－６）特徴６
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、導入工程において、第１ポリヌクレオチドは好熱菌細胞のゲノムの所定位置に導入される。第１ポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれるため、比較的安定してｃｒＲＮＡを誘導できる結果、内在性ＲＮＡヌクレアーゼを長期的に発現させることができる。
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法では、導入工程において、第１ポリヌクレオチドは好熱菌細胞のゲノムの所定位置に導入される。第１ポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれるため、比較的安定してｃｒＲＮＡを誘導できる結果、内在性ＲＮＡヌクレアーゼを長期的に発現させることができる。
（９）その他の実施形態
上記実施形態については、以下のような構成としてもよい。
上記実施形態については、以下のような構成としてもよい。
第１ポリヌクレオチドは、リーダー配列とＣＲＩＳＰＲアレイとから構成されてもよい。例えば、第１ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端にかけて、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続されたＤＮＡ配列のみから構成されてもよい。また、第１ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端にかけて、リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続されたＤＮＡ配列と、マーカー遺伝子とから構成されてもよい。
第２ポリヌクレオチドの塩基配列の長さは特に限定されず、所定の遺伝子配列の全てを含む長さであってもよい。この場合、該所定の遺伝子を好熱菌ゲノム内に導入することができる結果、導入された遺伝子を発現できる。このように導入する遺伝子を選択することできるため、所望の有価物を生産する好熱菌を製造することができる。
導入工程において、所定の発現ベクターに付加した第１ポリヌクレオチドを好熱菌に導入してもよい。これにより、第１ポリヌクレオチドはゲノム内に組み込まれず、一過性にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを誘導できる。
第１ポリヌクレオチドを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムを改変するゲノム編集キットとしてもよい。この場合、該キットは、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含まない。このキットを使用することで、ユーザーは簡便に好熱菌のゲノム編集を行うことができる。
加えて、前記キットに含まれる第１ポリヌクレオチドのスペーサー配列は、５’－ＴＴＡ－３’を含むＰＡＭ配列に基づいて設計されてもよい。このことにより、Ｙ７２株に対する本キットによるゲノム編集効率を確実に向上できる。
加えて、前記キットに含まれる第１ポリヌクレオチドには、マーカー遺伝子を含んでもよい。このことにより、目的のポジティブの変異株とネガティブの株とのスクリーニングを比較的簡便に行うことができる。
以上説明したように、本発明は、好熱菌のゲノム改変方法、ゲノム改変好熱菌の製造方法、及び好熱菌のゲノム編集キットについて有用である。
Claims (12)
- ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムの改変方法であって、
リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入する導入工程を含み、
好熱菌細胞に導入された前記第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより、好熱菌ゲノムの標的配列を改変することを特徴とする好熱菌ゲノムの改変方法。 - 外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを好熱菌細胞に導入しないことを特徴とする請求項１に記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 前記スペーサー配列は、前記好熱菌ゲノム中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列に基づいて決定され、
前記ＰＡＭ配列は、前記標的配列の５’末端に位置し、かつ、５’－ＴＴＡ－３’を含むことを特徴とする請求項２に記載の好熱菌ゲノムの改変方法。 - 前記導入工程は、前記第１ポリヌクレオチドと前記標的配列を改変するための第２ポリヌクレオチドとを前記好熱菌細胞に導入することを特徴とする請求項２または３に記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 前記第１ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項２～４のいずれか１つに記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 前記導入工程において、前記第１ポリヌクレオチドは前記好熱菌のゲノムの所定位置に導入されることを特徴とする請求項１～５のいずれか１つに記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 前記導入工程において、前記第１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが好熱菌細胞に導入されることを特徴とする請求項１～５のいずれか１つに記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 前記好熱菌は、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌であることを特徴とする請求項１～７のいずれか１つに記載の好熱菌ゲノムの改変方法。
- 請求項１～８のいずれか１つに記載の好熱菌ゲノムの改変方法による好熱菌の製造方法。
- ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる好熱菌ゲノムを改変するゲノム編集キットであって、
リーダー配列、第１リピート配列、スペーサー配列、及び第２リピート配列が順に接続された構造を有する第１ポリヌクレオチドを備え、かつ、外来性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含まず、
好熱菌細胞に導入された前記第１ポリヌクレオチドにより誘導される内在性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより、好熱菌ゲノムの標的配列を改変することを特徴とするゲノム編集キット。 - 前記スペーサー配列は、前記好熱菌ゲノム中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列に基づいて決定され、
前記ＰＡＭ配列は、前記標的配列の５’末端に位置し、かつ、５’－ＴＴＡ－３’を含むことを特徴とする請求項１０に記載のゲノム編集キット。 - 前記第１ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のゲノム編集キット。
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