CN114606215A

CN114606215A - 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114606215A
Application number: CN202210082114.XA
Authority: CN
Inventors: 马立新; 何如怡; 孙宝彤; 王飞; 王亚平; 李忠臣; 颜光波
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114606215B; WO2023138082A1

Abstract

本发明公开了一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用，所述Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与如SEQ ID NO.1所示序列有至少50％的序列一致性；本发明首次证明了真核Argonaute蛋白对DNA的特异性切割活性，为真核Argonaute与DNA的相互作用研究提供了实验证明；同时，本发明使用的多肽、核酸、表达载体、组合物、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性操作，可有效地应用于生物技术的许多领域，为基于真核生物来源的Argonaute多肽的基因编辑、修饰及分子检测提供了一种新的工具。

Description

一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用。

背景技术

真核Argonaute(简称eAgo)在真核生物的RNA干扰(RNA interference,RNAi)途径中起着关键作用，是RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)的主要功能核心，可以与作为互补的RNA靶标特异性识别向导小的单链RNA分子结合，或者通过一些eAgos酶固有的核酸酶活性直接切割靶标，或者招募其他沉默蛋白来作用于靶标，使转录受到抑制。因此，eAgos可以在转录水平调控基因表达，保护宿主免受RNA病毒的入侵，并通过减少转座子的移动性来保持基因组的完整性。最近也有研究表明，一些AGO蛋白除了在典型的RNAi通路中的作用外，还可以通过其它机制调节基因表达，戚益军研究组之前研究发现AGO1也存在于细胞核中，这意味着AGO1可能在细胞核内也有重要功能，但并未解释其具体机制。目前，大多数文献只报道了eAgo在体外特异性的RNA切割的活性，如hAgo2和KpAgo，并未有文献报道eAgo对DNA的特异性切割活性。

长期以来，人们广泛关注eAgo在RNAi途径中的重要作用，并在高等动植物和酵母细胞中均发现了具有高RNase活性的eAgo，但是对真核Argonaute和DNA的相互作用并没有详细的探究，虽然有研究发现真核来源的Argonaute蛋白可以以单链DNA作为向导靶向切割RNA，但并未发现其对DNA的切割活性。同时，关于Argonaute蛋白在基因编辑上的应用，由于来自高等动植物的真核Argonaute蛋白可能会参与受体细胞内的RNAi途径无法实现有效基因编辑，因此目前并未有利用真核Argonaute蛋白进行基因编辑。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种真核生物来源的Argonaute蛋白，并发现了该Argonaute蛋白具有对DNA的切割活性，有望应用于哺乳动物细胞基因编辑。

一方面，本发明提供了一种真核生物来源的Argonaute蛋白(以下简称eAgo蛋白)，所述蛋白为如下任一：

A1).氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；A2).与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白质。

具体的，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白来源于嗜热毁丝霉真核微生物(Thermothelomyces thermophilus)，将其命名为TteAgo蛋白。

优选地，所述eAgo蛋白可以是人工合成的，也可以是提取的天然蛋白。

优选地，所述eAgo蛋白在10～60℃具有核酸酶活性；进一步地，所述eAgo蛋白在25～55℃具有核酸酶活性；更进一步地，所述eAgo蛋白在37℃具有核酸酶活性。

优选地，所述eAgo蛋白也可能通过突变失去核酸酶活性。

第二方面，本发明提供了编码所述eAgo蛋白的核酸分子。

具体地，所述核酸分子为如下任一：

B1).核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；B2).在严格条件下与SEQ IDNO.3所示的DNA分子杂交且编码所述eAgo蛋白的DNA分子；B3).与B1)或B2)限定的DNA序列具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％的序列一致性且编码所述eAgo蛋白的DNA分子。

第三方面，本发明提供了一种eAgo复合物，由所述eAgo蛋白与向导分子复合形成，所述向导分子为ssDNA向导或RNA向导。

优选地，所述向导分子为5’末端磷酸化的RNA向导，或5’末端羟基化的RNA向导，或5’末端磷酸化的ssDNA向导，或5’末端羟基化的ssDNA向导。

优选地，所述ssDNA向导的长度为12至40个核苷酸；更加优选地，所述ssDNA向导的长度为12至30个核苷酸；最优地，所述ssDNA向导的长度为15至20个核苷酸，如16、17或18个核苷酸。

第四方面，当本发明提供了所述eAgo或eAgo复合物具有核酸酶活性时，其能够在体内或体外环境中特异性切割靶核酸，所述靶核酸为靶RNA或靶DNA。

需要说明的是，所述靶RNA没有高级结构，或有高级结构，或为双链RNA，或为体外转录的RNA，或为病毒基因组RNA，或为信使RNA即mRNA，或为细胞内的其他RNA。所述靶DNA为合成的单链DNA，或为双链DNA；可以是细胞基因组DNA，还可以是细胞内的其他DNA。

优选地，所述eAgo或eAgo复合物在二价金属阳离子溶液中具有核酸酶活性，所述阳离子为Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺中的至少一种阳离子。

更为优选地，所述阳离子为Mn²⁺和/或Mg²⁺。

最优地，所述阳离子为Mn²⁺。

优选地，所述eAgo或eAgo复合物的核酸酶活性具有单碱基或/和双碱基专一性。

具体的，所述eAgo或eAgo复合物在体内或体外特异性切割靶RNA或靶DNA中的应用可分为如下四种类型：

(1)所述eAgo或eAgo复合物在体外切割靶RNA，其应用过程可为：将eAgo与向导分子混合，形成eAgo复合物，所述向导分子为ssDNA或RNA；令eAgo复合物与靶RNA接触，所述靶RNA含有与所述向导分子序列大部分互补的核苷酸序列，所述eAgo-向导复合物在特定位点切割靶RNA。

(2)所述eAgo或eAgo复合物在体外切割靶DNA，其应用过程可为：将eAgo与RNA向导混合，形成eAgo复合物；令eAgo复合物与靶DNA接触，所述靶DNA含有与所述RNA向导序列大部分互补的核苷酸序列，所述eAgo-向导复合物在特定位点切割靶DNA。

(3)所述eAgo或eAgo复合物在细胞内切割靶RNA，其应用过程可为：将eAgo与向导分子混合，形成eAgo复合物，所述向导分子为ssDNA向导或RNA向导；通过转化、转染或转导将eAgo复合物转入细胞，细胞内的一个RNA(即靶RNA)含有与所述向导分子序列大部分互补的核苷酸序列。

(4)所述eAgo或eAgo复合物在细胞内切割靶DNA，其应用过程可为：将eAgo与RNA向导混合，形成eAgo复合物；通过转化、转染或转导将eAgo复合物转入细胞，细胞内的一个DNA(即靶DNA)含有与所述RNA向导序列大部分互补的核苷酸序列。

需要说明的是，靶RNA或靶DNA含有与RNA向导或ssDNA向导序列互补的核苷酸序列，这意味着所述向导分子要么与靶RNA或靶DNA包含的相同长度的序列完全互补，要么存在许多错配(通常是分离的，也可能是连续的)，错配的数目可能是1、2、3、4或5等。

优选地，所述靶RNA或靶DNA含有与所述RNA向导或ssDNA向导序列至少12个碱基互补的核苷酸序列。

优选地，在所述细胞内切割靶RNA或靶DNA时，所述细胞为原位细胞。

第五方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有第二方面提供的核酸分子。

进一步地，本发明第六方面提供了所述表达载体在位点特异性修饰细胞的遗传材料中的应用。

优选地，所述应用的方法为：将表达载体导入细胞，并同时或不同时导入一个或多个RNA向导，或导入一个或多个DNA向导；在细胞内表达一种或多种所述eAgo蛋白。

优选地，多种eAgo蛋白由一个表达载体编码。

优选地，所述表达载体包含在病毒载体中；更加优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。

优选地，所述细胞为分离的细胞。

优选地，所述细胞为原位细胞，具体可为活体组织、器官或包括人在内的动物细胞。

优选地，所述细胞为真核生物细胞。

第七方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含eAgo蛋白、至少一个ssDNA向导和/或RNA向导。

第八方面，本发明提供了另一种试剂盒，所述试剂盒包括所述表达载体、至少一个ssDNA向导和/或RNA向导。

需要说明的是，试剂盒中ssDNA向导或RNA向导的选取参照eAgo复合物。

本发明的有益效果为：

本发明提供了能在核酸链的引导下切割靶核苷酸序列的真核生物来源的Argonaute(eAgo)多肽，并证明了来自真菌嗜热毁丝霉的TteAgo不仅具有切割RNA的活性也具有切割DNA的活性，提出了eAgos在DNA靶向编辑上的应用潜力。

本发明提供了包含编码所述多肽的核酸的表达载体，以及用于以序列特异性方式切割和编辑靶核酸的组合物、试剂盒和应用方法。本发明的多肽、核酸、表达载体、组合物、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，因此可有效地应用于生物技术的许多领域，比如核酸检测、基因编辑和基因修饰等，为基于真核生物来源的Argonaute多肽的基因编辑、修饰及分子检测提供了一种新的工具。

本发明提供的蛋白对RNA向导和单链DNA(ssDNA)向导有结合活性，并且具有对靶RNA和靶DNA的核酸酶活性，从而当与靶RNA或靶DNA序列具有大部分配对的RNA向导或ssDNA向导与eAgo结合形成eAgo-向导复合物时，并且当eAgo-向导复合物与靶RNA或靶DNA缔合时，靶RNA或靶DNA发生位点特异性切割。且可以通过选择具有特定核苷酸序列的RNA或ssDNA向导来调节位点特异性。

本发明用到的eAgo能够使用长度为16-18nt的RNA和/或DNA向导特异性切割靶RNA和/或靶DNA，特别是在以ssDNA作为向导切割RNA时也具有很高的活性，而DNA向导相对于RNA合成周期短、价格低廉，能极大地节省成本。

此外，本发明用到的eAgo不用依赖靶位点附近的特殊基序来识别和结合靶，DNA向导设计方便，不用考虑位点限制。

本发明用到的eAgo切割活性强，严格依赖于向导和靶的互补配对发挥切割活性，不存在CRISPR相关蛋白的非特异性“附带切割”活性，特异性更好。进一步地，将eAgo的活性位点进行突变，能够得到完全丧失切割活性的eAgo，可以融合其它效应蛋白，进一步拓展了其应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的部分已表征Ago蛋白的进化树示意图；

图2是本发明提供的十四个已表征Ago蛋白的序列比对示意图；

图3是实施例1中TteAgo蛋白的SDS-PAGE凝胶图，其中，泳道1为总蛋白，泳道2为破菌上清，泳道3为200mM咪唑洗脱液，泳道4和泳道5均为Im7孵育后琼脂糖珠，泳道6和泳道7为3C蛋白酶酶切后的上清；

图4是实施例2中用于测试的RNA向导、DNA向导、靶RNA、靶DNA的示意图，以及TteAgo切割靶RNA和靶DNA的产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图5是实施例3中不同长度的向导介导TteAgo切割靶RNA或靶DNA的产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，A至C依次为不同长度的RNA向导切割靶RNA、不同长度的DNA向导切割靶RNA、不同长度的RNA向导切割靶DNA的凝胶电泳图；

图6是实施例4中不同金属离子条件下向导介导TteAgo切割靶RNA或靶DNA产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图7是实施例4中不同Mn²⁺或Mg²⁺离子浓度条件下向导介导TteAgo切割靶RNA和靶DNA产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图8是实施例5中不同温度条件下RNA向导介导TteAgo切割靶RNA和靶DNA产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图9是实施例6中单碱基和双碱基突变的RNA向导、单碱基突变的DNA向导的示意图；

图10是实施例6中单碱基和双碱基突变的RNA向导、单碱基突变的DNA向导介导TteAgo切割靶RNA或靶DNA的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种真核生物来源的eAgo蛋白，所述eAgo蛋白为以下任一：

i)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质，该蛋白质来源于嗜热毁丝霉真核微生物Thermothelomyces thermophilus，命名为TteAgo蛋白，编码TteAgo蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示。

ii)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50％的序列一致性且具有相同功能的蛋白质；优选地，至少80％；更优地，至少90％；最佳至少95％的序列一致性。编码该类型蛋白的核酸分析的序列为：在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的DNA分子杂交的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示序列具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％的序列一致性的核苷酸序列。

优选地，所述eAgo蛋白对RNA向导和ssDNA向导具有结合活性，并且具有对靶RNA和靶DNA的核酸酶活性，从而当与靶RNA或DNA序列具有大部分配对的RNA向导或ssDNA向导与所述eAgo蛋白结合形成eAgo复合物时，并且当eAgo-向导复合物与靶RNA或DNA缔合时，靶DNA或RNA能够发生位点特异性切割。

所述向导分子具体可以是5’末端磷酸化的RNA和/或ssDNA，也可以是羟基化的RNA和/或ssDNA；向导分子可以包含末端5’-三磷酸酯。

优选地，所述ssDNA向导的长度12至30个核苷酸，甚至优选地为15至20个核苷酸，比如16、17或18个核苷酸。

优选地，所述eAgo蛋白在25～65℃的温度范围内具有核酸酶活性；有利地且优选地，本发明的eAgo蛋白在37℃下具有核酸酶活性。

优选地，所述eAgo蛋白的核酸酶活性的发挥需要阳离子的存在，所述阳离子为Fe² ⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺中的任意一种或任意组合的；特别优选地，所述阳离子为Mn²⁺和Mg²⁺。所述阳离子的浓度范围可以从约0.01mM至约2000mM变化；特别优选地，范围是约0.05mM至约20mM。

在一些实施例中，所述eAgo蛋白的5’末端和/或3’末端具有多个核定位序列(nuclear localisation sequence，NLS)。

在一些实施方案中，靶RNA是没有高级结构地。在其他实施方案中，靶RNA是有高级结构地。其他可能的靶RNA包括双链RNA，体外转录的RNA，病毒基因组RNA，信使RNA(mRNA)和细胞内的其他RNA。

具体的说，本发明中所述eAgo蛋白的长度可以是SEQ ID NO.1所示的1082个氨基酸，也可能是一段更长或更短的连续氨基酸。氨基酸个数(更长或更短)可能是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，...(连续数字),和/或1082。

上述连续氨基酸的定义是包括或小于本发明所述eAgo蛋白全长(1082个氨基酸)，但保留了与向导分子形成eAgo-向导复合物和对靶RNA和/或靶DNA的位点特异性切割活性的功能片段。

所述具有核酸酶活性的eAgo蛋白与eAgo复合物可以在体内或体外环境中特异性切割靶RNA或靶DNA，所述体内为细胞内。

本发明还提供了一种位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法，具体为：将一个含有编码所述eAgo蛋白的多核苷酸序列的表达载体导入细胞，并同时或不同时导入一个或多个RNA和/或ssDNA向导，从而在细胞内表达所述eAgo蛋白。

在一些实施案例中，位点特异性修饰方法发生在分离的细胞中；在其他的实施案例中，本发明中的方法可能发生在原位细胞中，可能是活体组织、器官或包括人在内的动物。

所述位点特异性修饰方法的eAgo蛋白可能由一个表达载体编码，在其他此类方法中，一个或多个eAgo蛋白可能由两个表达载体编码；在一些实施案例中，所述一个表达载体可以编码所有eAgos蛋白。

所述位点特异性修饰方法中所述的表达载体可能包含在病毒载体中，如慢病毒载体或逆转录病毒载体。

所述位点特异性修饰方法可能用在真核生物细胞中。

本发明提供的试剂盒包括以下三种：

试剂盒一包含：本发明所述eAgo蛋白，以及RNA向导和/或ssDNA向导；

试剂盒二包含：含有编码所述eAgo蛋白的多核苷酸序列的表达载体，RNA向导和/或ssDNA向导；

试剂盒三包含：包含所述表达载体的病毒载体，一个编码RNA向导和/或ssDNA向导的病毒载体。

当本发明所述eAgo蛋白对RNA向导或ssDNA向导具有结合活性，但对靶DNA和靶RNA没有核酸酶活性时，与靶RNA或靶DNA具有大部分配对的RNA向导或ssDNA向导与eAgo蛋白结合形成eAgo复合物时，并且当所述eAgo-向导复合物与靶RNA或靶DNA缔合时，靶RNA或靶DNA发生位点特异性阻碍。

所述没有核酸酶活性的eAgo蛋白的制备方法可以为：通过突变对eAgo蛋白的催化活性必不可少的一个或多个氨基酸残基来造成新的核酸酶活性，特别是核酸内切酶活性缺失。也就是说，至少突变一个位于进化保守的氨基酸四联体(DEDD)中的氨基酸。因此，突变可能是TteAgo蛋白中以下任意一个或多个氨基酸序列部分中的单个氨基酸变化：

FVGYDVTHP

KSRVEQVGGVIFRDGVSE

AYYADLVAA

更特别地，氨基酸变化是在以上一个或多个突出显示的残基处的单个变化。优选地，单个突变是非保守取代，例如从D到A，或从E到A。因此，除了D到E或E到D以外的任何替换都是可能的。

除了替换以外，一个或多个突出显示的残基可以被简单地删除；可选地，可以连续或不连续地删除氨基酸序列内的一个或多个氨基酸，也可以整体删除一个或多个序列基序。可以进行上述更改的任何组合，例如一个基序非保守变化，其他三个基序缺失。本发明中的核酸酶缺陷型eAgo的结构特征还可以包括如上文关于具有核酸酶活性eAgos所定义的任何结构变化。例如，与参考序列相比的序列一致性范围，就氨基酸结构域而言的eAgo的组成以及就氨基酸而言的总长度。向导的定义与本发明中具有核酸酶活性eAgos所用的向导相似。

对于不具备核酸酶活性的eAgo复合物，这意味着有利地存在一种通过特异性序列识别来阻断靶DNA或RNA中的特定位点的方法，靶可以是单链和双链。这样的位点特异性阻断提供了阻断目标基因转录的精确手段，或者阻断、破坏或干扰参与基因表达调节的特异性位点。

故，本发明提供了一种位点特异性靶向阻断细胞中靶核酸的方法，包括以下步骤：混合无核酸酶活性的eAgo与RNA向导或ssDNA向导，形成eAgo复合物；将eAgo复合物转入细胞(如通过转化、转染、纤维注射等方式)，所述向导序列与靶核酸包含的一段核苷酸序列基本互补。

基于此，在细胞内对靶核酸进行位点特异性靶向阻断的方法还可以采用如下步骤：用含有编码所述无核酸酶活性eAgo的表达载体转染、转化或转导细胞；转染、转化或转导第一个RNA向导或ssDNA向导序列和第二个ssRNA向导或ssDNA向导序列；其中至少一个向导分子的序列与靶核酸中包含的核苷酸序列基本互补，并且在细胞中表达产生的eAgo和向导分子形成能阻断特定位点eAgo复合物。

优选地，使用所述无核酸酶活性eAgos的位点特异性阻断靶多核苷酸方法可以靶向破坏基因表达和/或基因表达的控制元件，如启动子或增强子。

上述位点特异性阻断靶DNA或靶RNA的各种方法中，特别优选或任选的方面参照本发明定义的核酸酶活性eAgos。

实施例1TteAgo表达和纯化

转化pET28a-CL7-TteAgo质粒至大肠杆菌BL21(DE3)，单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.8时，移至18℃摇床上，IPTG诱导过夜。6000rpm离心10min收集菌体，用Buffer A(20mM Tris–HClpH 7.4、500mM NaCl、10mM imidazole)洗菌后，将菌体重悬于Buffer A，添加终浓度1mM的PMSF，高压破碎。18000rpm离心30min，收集上清。上清过滤后，进行Ni-NTA纯化。其中，CL7-TteAgo融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CL7-TteAgo融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

用含有10mM咪唑的BufferA洗10个柱体积(分3次加入)，然后用含有200mM咪唑洗5个柱体积，取样进行SDS-PAGE检测。收集200mM咪唑的洗脱液(含有较高纯度目的蛋白)，与活化的偶联有Im7蛋白的琼脂糖珠孵育，融合表达的TteAgo-CL7融合蛋白会与Im7蛋白特异性结合，将融合蛋白特异性结合在琼脂糖珠上，通过高盐(1M NaCl)和低盐(100mM NaCl)反复洗脱(10次)除去杂蛋白，然后用3C蛋白酶进行切割获得纯的目的蛋白，收集纯化的蛋白并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定纯度并超滤换液至Buffer B(20mM Tris–HCl pH 7.4、500mMNaCl、1mM TCEP)。将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在-80℃。

图2显示了催化DEDX四联体所在的区域，以及TteAgo和其他Ago的序列一致性。图3显示了经过Ni-NTA柱和和分子筛对TteAgo进行纯化之后，凝胶分析TteAgo的结果。通过http://www.expasy.org/计算，TteAgo的预期大小约为118kDa。

实施例2TteAgo的切割活性

为了评估TteAgo能够裂解RNA/DNA向导和RNA/DNA靶的哪些组合，本实施例对所有可能的组合进行了活性测定。

裂解试验均在37℃下以5:2:1(TteAgo:向导:靶)摩尔比进行。将1uM TteAgo与400nM向导放在含有10mM HEPES-NaOH(pH 7.5)、100mM NaCl，5mM MnCl₂和5％甘油的反应缓冲液中混合，并在37℃孵育10分钟以用于向导加载。添加核酸靶至终浓度为200nM。37℃反应1h后，通过将样品与2x RNA上样染料(95％甲酰胺、18mM EDTA、0.025％SDS和0.025％溴酚蓝)混合并在95℃加热5分钟来终止反应。裂解产物通过20％变性TBE-PAGE解析，用SYBR Gold(Invitrogen)染色，用Gel Doc^TM XR+(Bio-Rad)可视化。

图4中的A、B两幅图是用于测试的RNA向导、DNA向导、靶RNA、靶DNA的示意图，箭头表示预测的切割位点。图4中C、D图为TteAgo切割靶RNA和靶DNA的产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳图，从图中可知：①在没有TteAgo的情况下进行孵育的DNA/RNA(引导/靶)对照测定中未观察到产物带(34nt)，表明产物带的形成是TteAgo核酸酶活性的结果；②TteAgo可以利用5’磷酸化的RNA向导、5’羟基化的RNA向导、5’磷酸化的DNA向导和5’羟基化的DNA向导切割靶RNA；③TteAgo可以利用5’磷酸化的RNA向导和5’羟基化的RNA向导切割靶DNA。

另外，对TteAgo催化四联体DEDD的第1个和第3个氨基酸D突变为氨基酸A，该双突变体DM记为TteAgo-DM，从图4C和4D可知，TteAgo-DM失去了DNA向导切割靶RNA和靶DNA的活性。

实施例3向导分子长度对切割效果的影响

参照实施例2的实验方法，采用不同长度的RNA向导或DNA向导与TteAgo结合，验证其切割靶RNA或靶DNA的活性。

检测结果如图5所示，图5中A图为12～30nt长度的5’磷酸化RNA向导条件下，30min内TteAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的情况；图5中B图为12～30nt长度的5’磷酸化DNA向导条件下，30min内TteAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的情况；图5中C图为12～30nt长度的5’磷酸化RNA向导条件下，60min内TteAgo表现出向导引导的靶ssDNA裂解的情况。从图5可知，RNA向导长度的范围为12-25nt、DNA向导长度的范围为12-30nt时可以有效的切割靶RNA；RNA向导长度的范围为12-30nt时可以有效的切割靶ssDNA。

实施例4金属离子对切割效果的影响

(1)金属离子种类的影响

参照实施例2的实验方法，在反应缓冲液中采用不同二价金属离子，包括Fe²⁺，Co² ⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺等，验证阳离子对切割靶RNA或靶DNA的活性的影响。

检测结果如图6所示，可知阳离子为Mn²⁺、Mg²⁺、Co²⁺或/和Ni²⁺时，TteAgo结合RNA向导或DNA向导可以有效切割靶RNA(图6A、6B、6C、6D)；阳离子为Mn²⁺条件下，TteAgo结合RNA向导可以有效切割靶DNA(图6E、6F)。

(2)金属离子浓度的影响

选取Mn²⁺和Mg²⁺，寻找15min内TteAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的Mn²⁺或Mg²⁺浓度范围。

检测结果如图7所示：Mn²⁺和Mg²⁺浓度范围设置为0～10mM，向导为5’磷酸化的RNA时，Mn²⁺浓度和Mg²⁺浓度在0.05mM至10mM范围内时，都可以高效切割靶RNA(图7A和7B)；Mn²⁺和Mg²⁺浓度范围设置为0～10mM，向导为5’磷酸化的DNA时，Mn²⁺浓度在2.5mM至10mM范围内时，而Mg浓度在1mM至10mM范围内时，可以切割靶RNA(图7C和7D)；而Mn²⁺浓度在1mM至50mM范围内，向导为5’磷酸化的RNA时，可以有效切割靶DNA(图7E和7F)。

实施例5温度对切割效果的影响

参照实施例2的实验方法，寻找15min内TteAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的温度范围。结果如图8B和8D所示，5’磷酸化的RNA向导、5’羟基化的RNA向导在温度为25～70℃时可以切割靶RNA，其中37～60℃最好。

采用同样的方法，寻找60min内TteAgo表现出向导引导的靶DNA裂解的温度范围。结果如8A和8C所示，5’磷酸化的RNA向导、5’羟基化的RNA向导在温度为30～60℃时可以切割靶DNA，其中37～45℃最好。

实施例6

参照实施例2的实验方法，探究向导分子单碱基或双碱基突变对TteAgo切割靶RNA或靶DNA的影响，具体如下：

(1)RNA向导单碱基或/和双碱基突变对TteAgo切割靶RNA的影响

合成单个碱基或者双碱基突变的RNA向导(m1,m2,m3,m4,m5,m6,m7,

m8,m9,m10,m11,m12,m13,m14,m15,m16,m17,m18,m7m8,m8m9,m9m10,m10m11,m11m12,m12m13,m13m14，具体突变情况如图9所示)，上述RNA向导分别介导TteAgo切割靶RNA，结果如图10中A图所示：当RNA向导第11位和第12位碱基同时突变时，TteAgo对靶RNA的切割活性最弱。

(2)DNA向导单碱基突变对TteAgo切割靶RNA的影响

合成单个碱基突变的DNA向导(m1,m2,m3,m4,m5,m6,m7,m8,m9,m10,m11,m12,m13,m14,m15,m16,m17,m18，具体突变情况如图9所示)，上述DNA向导分别介导TteAgo切割靶RNA，结果如图10中B图所示：当DNA向导第8位、第9位、第11位或第12位碱基突变时，TteAgo对靶RNA的切割活性最弱。

(3)RNA向导单碱基突变对TteAgo切割靶DNA的影响

分别合成单个碱基突变的RNA向导(m1,m2,m3,m4,m5,m6,m7,m8,m9,m10,m11,m12,m13,m14,m15,m16,m17,m18，具体突变情况如图9所示)，上述RNA向导分别介导TteAgo切割靶DNA，结果如图10中C图所示：当RNA向导第3位至第17位出现单个碱基突变时，TteAgo对靶DNA的切割活性显著减弱。

综上所述，本发明提供的真核生物来源的Argonaute蛋白对RNA向导和ssDNA向导有结合活性，同时具有对靶RNA和靶DNA的均具有核酸酶活性，而且本发明的eAgo蛋白能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰。故其可有效地应用于生物技术的许多领域，比如核酸检测、基因编辑和基因修饰等。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北大学

<120> 一种真核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

<130> 2022.1.18

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1082

<212> PRT

<213> TteAgo氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Asp Ser Arg Gly Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gln Ala Gly Glu Gly Phe Arg Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Arg Gly Gly Tyr Pro Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Asp Gly Tyr

35 40 45

Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Glu Phe Arg Gly Gly Arg Gly

50 55 60

Gly Arg Gly Asp Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly

65 70 75 80

Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val Phe Leu Gly Ala Gly

85 90 95

Pro Ser Ile Pro Ala Pro Asp Ala Ala Val Thr Glu Leu Glu Asp Arg

100 105 110

Trp Ile Glu Lys His Gly Ile Gln Ser Arg Thr Thr Gly Ala Ser Glu

115 120 125

Leu Glu Ser Lys Met Ala Asp Leu Ser Leu Gly Thr Ile Ser Met Pro

130 135 140

Lys Arg Pro Gly Phe Gly Thr Gly Gly Asn Pro Val Val Leu Trp Ala

145 150 155 160

Asn Tyr Phe Asn Val Asn Leu Lys Leu Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Asp

165 170 175

Leu Arg Val Ile Ser Lys Lys Leu Thr Lys Glu Gln Asp Asp Ala Leu

180 185 190

Ser Lys Gln Gln Glu Ser Ala Ser Lys Lys Ala Lys Gly Lys Pro Lys

195 200 205

Gln Ala Ser Gly Gln Gln Pro Asn Ala Pro Lys Asp Ala Arg Glu Ala

210 215 220

Lys Gly Lys Lys Leu Ser Glu Val Ile Lys Leu Ala Leu Asp Arg Leu

225 230 235 240

Pro Gly Glu Pro Ala Ile Ala Thr Glu Tyr Lys Gln Gln Leu Val Thr

245 250 255

Thr Glu Lys Leu Gln Val Pro Pro Asp Gly Leu Met Gln Val Glu Leu

260 265 270

Ala Glu Pro Gly Arg Asn Pro Glu Thr Trp Tyr Val Arg Phe Asp Gly

275 280 285

Pro Ser Ser Ile Asn Ile Ala Gly Leu Met Asp Tyr Val Arg Ser Leu

290 295 300

Glu Asp Lys Asn Asp Gly Val Phe Pro Lys Phe Pro Glu Glu Ile Asp

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ile Val Leu Gly His Thr Ala Arg Ala Asn Leu Asn Thr

325 330 335

Ala Ala Ile Gly Ser Ser Arg Phe Phe Ala Ile Asp Gln Ala Arg Lys

340 345 350

Asp Gln Ala Ser Met Pro Pro Asp Ser Arg Ile Glu Ile Leu Arg Gly

355 360 365

Tyr Val Gln Ser Val Arg Pro Ala Thr Gly Arg Leu Leu Leu Asn Thr

370 375 380

Asn Val Thr His Ala Val Phe Arg Lys Ala Val Lys Leu Asp Glu Leu

385 390 395 400

Phe Gln Lys Cys Gly Leu Ala Asn Leu His Leu Pro Gln Gln Arg Pro

405 410 415

Asn His Ala Leu Arg Thr Leu Asp Gly Leu Asn Lys Phe Leu Ala Lys

420 425 430

Ser Arg Ile Glu Cys Lys Val Pro Gly Glu Arg Pro Gly Glu Phe Phe

435 440 445

Lys Ile Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Ala Thr Thr Lys Asp Gly Lys

450 455 460

Asp Glu Asp Gln Lys Pro Glu Phe Thr Glu Ser Gly Phe Arg Phe Gly

465 470 475 480

Thr Pro Ala Thr Val Arg Phe Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Asp Leu Gly

485 490 495

Ala Lys Pro Pro Pro Gly Leu Ser Phe Asp Thr Met Val Leu Val Ser

500 505 510

Asp Tyr Tyr Lys Ala Arg Tyr Gly Ile Arg Ala Asp Pro Gly Leu Pro

515 520 525

Leu Ile Asn Val Gly Thr Ala Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Leu Ala Glu

530 535 540

Phe Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gln Pro Leu Lys Ala Arg Leu Ser Pro

545 550 555 560

Gln Glu Gln Asp Ala Met Ile Arg Phe Ala Cys Arg Pro Pro Pro Glu

565 570 575

Asn Ala Leu Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Glu Leu Leu Ala Leu Asp

580 585 590

Asn Asn Met Leu Leu Asp Lys Phe Gly Ile Thr Val Asp Lys His Leu

595 600 605

Ile Thr Val Lys Gly Arg Glu Leu Pro Pro Pro Ala Val Gly Tyr Leu

610 615 620

Arg Gly Asn Ser Ile Glu Arg Val Thr Pro Glu Asn Gly Gly Trp Leu

625 630 635 640

Met Lys Gly Val Lys Val Cys Lys Ser Gly Arg Arg Ile Ala Asn Trp

645 650 655

Ala Phe Leu Val Ile Gly Lys Ala Arg Pro Pro Ile Asp Phe Gly Thr

660 665 670

Ile Lys Ser Ala Val Gly Gly Phe Ala Arg Phe Leu Asn Asn Asn Met

675 680 685

Gly Ile Asp Met Asn Met Gln Pro Val Pro Ala Asn Gly Tyr Gln Thr

690 695 700

Ala Gly Thr Ser Glu Glu Asp Leu Arg Asn Ala Phe Arg Thr Ile Ser

705 710 715 720

Lys Gln Lys Pro Gln Pro Glu Phe Ile Leu Val Leu Leu Pro Asp Lys

725 730 735

Asp Ala Thr Thr Tyr Asn Ile Val Lys Lys Leu Gly Asp Val Glu Tyr

740 745 750

Gly Ile Thr Thr Val Cys Val Arg Gln Glu Met Leu Thr Lys Glu Gln

755 760 765

Gly Gln Met Gly Tyr Phe Ala Asn Val Gly Leu Lys Val Asn Leu Lys

770 775 780

Phe Gly Gly Ile Asn His Arg Val Arg Asp Glu Thr Gly Leu Val Asp

785 790 795 800

Lys Thr Met Phe Val Gly Tyr Asp Val Thr His Pro Thr Asn Leu Pro

805 810 815

Gly Gly Ala Gly Asp Asn Ala Pro Ser Leu Val Gly Leu Val Ala Ser

820 825 830

Val Asp Asn Ser Leu Ala Gln Trp Pro Ala Val Thr Trp Glu Asn Lys

835 840 845

Ser Arg Val Glu Gln Val Gly Gly Lys Thr Asp Glu Gly Gln Phe Ile

850 855 860

Ala His Phe Lys Asp Arg Leu Arg Leu Trp Gln Lys His Asn Ser Asn

865 870 875 880

Arg Leu Pro Glu Asn Ile Val Ile Phe Arg Asp Gly Val Ser Glu Gly

885 890 895

Gln Phe Ser Met Val Leu Glu Lys Glu Leu Pro Asn Ile Arg Gln Ala

900 905 910

Cys Gln Glu Thr Tyr Pro Ala Arg Pro Asn Ala Gln Pro Arg Leu Ser

915 920 925

Leu Ile Val Ser Val Lys Arg His Gln Thr Arg Phe Tyr Pro Thr Asp

930 935 940

Arg Asn His Ile His Pro Arg Ser Lys Ser Pro Lys Glu Gly Thr Val

945 950 955 960

Val Asp Arg Gly Val Thr Asn Val Arg Tyr Trp Asp Phe Phe Leu Gln

965 970 975

Ala His Ala Ser Leu Gln Gly Thr Ala Arg Pro Ala His Tyr Thr Val

980 985 990

Leu Leu Asp Glu Ile Phe Arg His Lys Phe Gly Pro Asn Ala Ala Asp

995 1000 1005

Ala Leu Glu Thr Leu Thr His Asn Met Cys Tyr Ala Tyr Gly Arg

1010 1015 1020

Ala Thr Lys Ala Val Ser Ile Cys Pro Pro Ala Tyr Tyr Ala Asp

1025 1030 1035

Leu Val Ala Ala Arg Ala Arg Ile His Lys Ser Glu Leu Phe Glu

1040 1045 1050

Asn Val Gln Ser Leu Ala Ser Ser Glu Gln Ser Ser Val Ser Arg

1055 1060 1065

Arg Lys Val His Asp Arg Leu Lys Asp Thr Met Tyr Tyr Ile

1070 1075 1080

<210> 2

<211> 1231

<212> PRT

<213> CL7-TteAgo融合蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met His His His His His His Gln Gln Arg Pro Ser Lys Ser Asn Glu

1 5 10 15

Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys Pro Val Asn Asn Lys Trp Leu

20 25 30

Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Val Pro Asp Arg Ile Ala

35 40 45

Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu Ser Phe Asp Asp Phe Arg Glu

50 55 60

Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro Glu Leu Ser Lys Gln Phe

65 70 75 80

Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val Gly Lys Ala Pro Lys Thr

85 90 95

Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg Thr Ser Phe Glu Leu Asn His

100 105 110

Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly Val Tyr Asp Met Asp Asn Ile

115 120 125

Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile Asp Ile Glu Gly Leu Glu Val

130 135 140

Leu Phe Gln Gly Pro Met Ser Asp Ser Arg Gly Arg Gly Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gln Ala Gly Glu Gly

165 170 175

Phe Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Pro Gly Gly Gly Arg Gly

180 185 190

Gly Gly Asp Gly Tyr Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Glu Phe

195 200 205

Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Asp Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Gly Ala Gly Pro Ser Ile Pro Ala Pro Asp Ala Ala Val Thr

245 250 255

Glu Leu Glu Asp Arg Trp Ile Glu Lys His Gly Ile Gln Ser Arg Thr

260 265 270

Thr Gly Ala Ser Glu Leu Glu Ser Lys Met Ala Asp Leu Ser Leu Gly

275 280 285

Thr Ile Ser Met Pro Lys Arg Pro Gly Phe Gly Thr Gly Gly Asn Pro

290 295 300

Val Val Leu Trp Ala Asn Tyr Phe Asn Val Asn Leu Lys Leu Gly Ala

305 310 315 320

Val Tyr Arg Tyr Asp Leu Arg Val Ile Ser Lys Lys Leu Thr Lys Glu

325 330 335

Gln Asp Asp Ala Leu Ser Lys Gln Gln Glu Ser Ala Ser Lys Lys Ala

340 345 350

Lys Gly Lys Pro Lys Gln Ala Ser Gly Gln Gln Pro Asn Ala Pro Lys

355 360 365

Asp Ala Arg Glu Ala Lys Gly Lys Lys Leu Ser Glu Val Ile Lys Leu

370 375 380

Ala Leu Asp Arg Leu Pro Gly Glu Pro Ala Ile Ala Thr Glu Tyr Lys

385 390 395 400

Gln Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Leu Gln Val Pro Pro Asp Gly Leu

405 410 415

Met Gln Val Glu Leu Ala Glu Pro Gly Arg Asn Pro Glu Thr Trp Tyr

420 425 430

Val Arg Phe Asp Gly Pro Ser Ser Ile Asn Ile Ala Gly Leu Met Asp

435 440 445

Tyr Val Arg Ser Leu Glu Asp Lys Asn Asp Gly Val Phe Pro Lys Phe

450 455 460

Pro Glu Glu Ile Asp Ala Leu Gly Ile Val Leu Gly His Thr Ala Arg

465 470 475 480

Ala Asn Leu Asn Thr Ala Ala Ile Gly Ser Ser Arg Phe Phe Ala Ile

485 490 495

Asp Gln Ala Arg Lys Asp Gln Ala Ser Met Pro Pro Asp Ser Arg Ile

500 505 510

Glu Ile Leu Arg Gly Tyr Val Gln Ser Val Arg Pro Ala Thr Gly Arg

515 520 525

Leu Leu Leu Asn Thr Asn Val Thr His Ala Val Phe Arg Lys Ala Val

530 535 540

Lys Leu Asp Glu Leu Phe Gln Lys Cys Gly Leu Ala Asn Leu His Leu

545 550 555 560

Pro Gln Gln Arg Pro Asn His Ala Leu Arg Thr Leu Asp Gly Leu Asn

565 570 575

Lys Phe Leu Ala Lys Ser Arg Ile Glu Cys Lys Val Pro Gly Glu Arg

580 585 590

Pro Gly Glu Phe Phe Lys Ile Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Ala Thr

595 600 605

Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Asp Gln Lys Pro Glu Phe Thr Glu Ser

610 615 620

Gly Phe Arg Phe Gly Thr Pro Ala Thr Val Arg Phe Tyr Leu Arg Lys

625 630 635 640

Pro Lys Asp Leu Gly Ala Lys Pro Pro Pro Gly Leu Ser Phe Asp Thr

645 650 655

Met Val Leu Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Ala Arg Tyr Gly Ile Arg Ala

660 665 670

Asp Pro Gly Leu Pro Leu Ile Asn Val Gly Thr Ala Gly Lys Pro Ile

675 680 685

Tyr Ile Leu Ala Glu Phe Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gln Pro Leu Lys

690 695 700

Ala Arg Leu Ser Pro Gln Glu Gln Asp Ala Met Ile Arg Phe Ala Cys

705 710 715 720

Arg Pro Pro Pro Glu Asn Ala Leu Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Glu

725 730 735

Leu Leu Ala Leu Asp Asn Asn Met Leu Leu Asp Lys Phe Gly Ile Thr

740 745 750

Val Asp Lys His Leu Ile Thr Val Lys Gly Arg Glu Leu Pro Pro Pro

755 760 765

Ala Val Gly Tyr Leu Arg Gly Asn Ser Ile Glu Arg Val Thr Pro Glu

770 775 780

Asn Gly Gly Trp Leu Met Lys Gly Val Lys Val Cys Lys Ser Gly Arg

785 790 795 800

Arg Ile Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Ile Gly Lys Ala Arg Pro Pro

805 810 815

Ile Asp Phe Gly Thr Ile Lys Ser Ala Val Gly Gly Phe Ala Arg Phe

820 825 830

Leu Asn Asn Asn Met Gly Ile Asp Met Asn Met Gln Pro Val Pro Ala

835 840 845

Asn Gly Tyr Gln Thr Ala Gly Thr Ser Glu Glu Asp Leu Arg Asn Ala

850 855 860

Phe Arg Thr Ile Ser Lys Gln Lys Pro Gln Pro Glu Phe Ile Leu Val

865 870 875 880

Leu Leu Pro Asp Lys Asp Ala Thr Thr Tyr Asn Ile Val Lys Lys Leu

885 890 895

Gly Asp Val Glu Tyr Gly Ile Thr Thr Val Cys Val Arg Gln Glu Met

900 905 910

Leu Thr Lys Glu Gln Gly Gln Met Gly Tyr Phe Ala Asn Val Gly Leu

915 920 925

Lys Val Asn Leu Lys Phe Gly Gly Ile Asn His Arg Val Arg Asp Glu

930 935 940

Thr Gly Leu Val Asp Lys Thr Met Phe Val Gly Tyr Asp Val Thr His

945 950 955 960

Pro Thr Asn Leu Pro Gly Gly Ala Gly Asp Asn Ala Pro Ser Leu Val

965 970 975

Gly Leu Val Ala Ser Val Asp Asn Ser Leu Ala Gln Trp Pro Ala Val

980 985 990

Thr Trp Glu Asn Lys Ser Arg Val Glu Gln Val Gly Gly Lys Thr Asp

995 1000 1005

Glu Gly Gln Phe Ile Ala His Phe Lys Asp Arg Leu Arg Leu Trp

1010 1015 1020

Gln Lys His Asn Ser Asn Arg Leu Pro Glu Asn Ile Val Ile Phe

1025 1030 1035

Arg Asp Gly Val Ser Glu Gly Gln Phe Ser Met Val Leu Glu Lys

1040 1045 1050

Glu Leu Pro Asn Ile Arg Gln Ala Cys Gln Glu Thr Tyr Pro Ala

1055 1060 1065

Arg Pro Asn Ala Gln Pro Arg Leu Ser Leu Ile Val Ser Val Lys

1070 1075 1080

Arg His Gln Thr Arg Phe Tyr Pro Thr Asp Arg Asn His Ile His

1085 1090 1095

Pro Arg Ser Lys Ser Pro Lys Glu Gly Thr Val Val Asp Arg Gly

1100 1105 1110

Val Thr Asn Val Arg Tyr Trp Asp Phe Phe Leu Gln Ala His Ala

1115 1120 1125

Ser Leu Gln Gly Thr Ala Arg Pro Ala His Tyr Thr Val Leu Leu

1130 1135 1140

Asp Glu Ile Phe Arg His Lys Phe Gly Pro Asn Ala Ala Asp Ala

1145 1150 1155

Leu Glu Thr Leu Thr His Asn Met Cys Tyr Ala Tyr Gly Arg Ala

1160 1165 1170

Thr Lys Ala Val Ser Ile Cys Pro Pro Ala Tyr Tyr Ala Asp Leu

1175 1180 1185

Val Ala Ala Arg Ala Arg Ile His Lys Ser Glu Leu Phe Glu Asn

1190 1195 1200

Val Gln Ser Leu Ala Ser Ser Glu Gln Ser Ser Val Ser Arg Arg

1205 1210 1215

Lys Val His Asp Arg Leu Lys Asp Thr Met Tyr Tyr Ile

1220 1225 1230

<210> 3

<211> 3246

<212> DNA

<213> TteAgo多核苷酸序列

<400> 3

atgagcgata gccgtggtcg tggttatggt ggtggtcgcg gtggtggccg tggcggtcgt 60

ggtggtcaag ccggtgaagg ttttcgcggt ggcggtggac gtggtggtta tcctggcgga 120

ggacgcggag gtggtgatgg ctatcgcgga ggtagaggtg gtggcggagg tgaatttcgt 180

ggcggaagag gtggtagagg cgattttaga ggcggacgag gcggaggcgg tcgcggaggt 240

cgtggtggat atggtggtag cggtccggat gtttttttag gtgcaggtcc gagcattccg 300

gcaccggatg cagcagttac cgaactggaa gatcgttgga ttgaaaaaca tggtattcag 360

agccgtacca ccggtgcaag tgaactggaa agcaaaatgg cagatctgag cctgggcacc 420

attagcatgc cgaaacgtcc tggttttggt acaggtggta atccggttgt tctgtgggca 480

aattacttta acgtgaatct gaaactgggt gccgtgtatc gttatgatct gcgtgttatt 540

agcaagaaac tgaccaaaga acaggatgat gcactgagca aacagcaaga aagcgcaagc 600

aaaaaagcaa aaggtaaacc gaaacaggca agcggtcagc agccgaatgc accgaaagat 660

gcacgtgaag ccaaaggcaa aaaactgagc gaagttatta aactggcact ggatcgtctg 720

cctggtgaac cggcaattgc aaccgaatat aaacagcagc tggttaccac cgaaaaactg 780

caggttccgc ctgatggtct gatgcaggtt gaactggcag aaccgggtcg taatccggaa 840

acctggtatg ttcgttttga tggtccgagt agcattaata tcgcaggtct gatggattat 900

gttcgtagcc tggaagataa aaacgatggt gtgtttccga aattcccgga agaaattgat 960

gccctgggta ttgttctggg tcataccgca cgtgcaaatc tgaatacagc agcaattggt 1020

agcagccgtt tttttgcaat tgatcaggca cgtaaagatc aggcaagcat gccaccggat 1080

agccgtattg aaattctgcg tggctatgtt cagagcgttc gtccggcaac cggtcgtctg 1140

ctgctgaata caaatgttac ccatgccgtt tttcgtaaag ccgttaaact ggatgaactg 1200

tttcagaaat gtggtctggc aaatctgcat ctgccgcagc agcgtccgaa tcatgcactg 1260

cgtaccctgg atggcctgaa caaatttctg gcaaaaagtc gcattgaatg caaagttccg 1320

ggtgaacgcc ctggtgaatt tttcaaaatc cagcgtggta tggcaggtct ggccaccaca 1380

aaagatggta aagatgaaga tcagaagccg gaatttaccg aaagcggttt tcgctttggt 1440

acaccggcaa cagttcgctt ttatctgcgt aaacctaaag atctgggtgc aaaaccgcct 1500

cctggtctga gctttgatac catggttctg gttagcgatt attacaaagc ccgttatggt 1560

attcgtgcag atccgggtct gccgctgatt aatgttggca ccgcaggcaa accgatttat 1620

atcctggcag aattttgtac cctgctgcct ggtcagccgc tgaaagcacg tctgagtccg 1680

caagagcagg atgcaatgat tcgttttgca tgtcgtccgc cacctgaaaa tgccctgagc 1740

gttaccacct cagcacgtga actgctggcc ctggataata acatgctgct ggataaattt 1800

ggcatcaccg ttgataaaca tctgattacc gttaaaggtc gcgaactgcc tcctccggca 1860

gttggctatc tgcgtggtaa tagtattgaa cgtgttacac cggaaaatgg tggttggctg 1920

atgaaaggtg ttaaagtttg taaaagcggt cgtcgtattg caaattgggc atttctggtt 1980

attggtaaag cccgtccgcc tattgatttt ggtacgatta aaagcgcagt tggtggtttt 2040

gcccgttttc tgaataacaa tatgggcatc gatatgaaca tgcagccggt tccggcaaat 2100

ggttatcaga ccgcaggtac aagcgaagaa gatctgcgca acgcatttcg taccattagt 2160

aaacagaaac cgcagcctga atttattctg gttctgctgc cagataaaga tgcaaccacc 2220

tataacatcg tgaaaaaact gggagatgtg gaatatggta ttaccaccgt ttgtgttcgt 2280

caagaaatgc ttacaaaaga acaaggtcag atgggctatt ttgcaaatgt tggtctgaaa 2340

gtgaacctga aatttggtgg cattaatcat cgtgttcgtg atgaaaccgg tctggttgat 2400

aaaaccatgt ttgttggtta tgatgtgacc catccgacca atctgccagg tggtgccggt 2460

gataatgcac cgtcactggt tggtctggtg gcaagcgttg ataattcact ggcacagtgg 2520

cctgcagtta cctgggaaaa caaaagccgt gttgaacagg ttggtggtaa aaccgatgaa 2580

ggccagttta ttgcccattt taaagatcgc ctgcgtctgt ggcagaaaca taatagcaat 2640

cgcctgccgg aaaacattgt gatttttcgt gatggtgtta gcgaaggtca gtttagcatg 2700

gtgctggaaa aagaactgcc gaacattcgt caggcatgtc aagaaaccta tccggcacgt 2760

ccgaatgcgc agcctcgtct gtcactgatt gttagcgtta aacgtcatca gacccgtttc 2820

tatccgaccg atcgtaatca tattcatccg cgtagcaaaa gcccgaaaga aggcaccgtt 2880

gttgatcgtg gtgttaccaa tgttcgttat tgggattttt ttctgcaggc acatgcaagc 2940

ctgcagggca ccgcacgtcc ggcacattat accgttctgc tggacgaaat ttttcgccat 3000

aaattcggtc cgaacgcagc agatgcactg gaaaccctga cacataatat gtgctatgcc 3060

tatggtcgtg caaccaaagc agttagcatt tgtccgcctg catattatgc cgatctggtt 3120

gcagcacgtg cccgtattca taaatcagaa ctgtttgaaa acgttcagag cctggcaagc 3180

agcgaacaga gcagcgttag ccgtcgtaaa gttcatgatc gtctgaaaga taccatgtat 3240

tatatc 3246

<210> 4

<211> 3696

<212> DNA

<213> CL7-TteAgo融合蛋白多核苷酸序列

<400> 4

atgcaccatc atcatcatca tcagcagcgg ccaagcaaaa gcaatgaacc gggtaaagca 60

accggtgaag gtaaaccggt taataacaaa tggctgaaca atgccggtaa agatctgggt 120

agtccggttc cggatcgtat tgcaaataaa ctgcgtgata aagaattcga gagcttcgat 180

gattttcgtg aaaccttttg ggaagaagtt agcaaagatc ctgaactgag caaacagttt 240

agccgcaata acaatgatcg tatgaaagtt ggtaaagcac cgaaaacacg tacccaggat 300

gttagcggta aacgtacctc atttgaactg aatcatcaga aaccgattga acagaatggt 360

ggcgtttatg atatggataa cattagcgtt gttaccccga aacgcaacat tgatattgaa 420

ggcttggagg ttttgttcca gggtccaatg agcgatagcc gtggtcgtgg ttatggtggt 480

ggtcgcggtg gtggccgtgg cggtcgtggt ggtcaagccg gtgaaggttt tcgcggtggc 540

ggtggacgtg gtggttatcc tggcggagga cgcggaggtg gtgatggcta tcgcggaggt 600

agaggtggtg gcggaggtga atttcgtggc ggaagaggtg gtagaggcga ttttagaggc 660

ggacgaggcg gaggcggtcg cggaggtcgt ggtggatatg gtggtagcgg tccggatgtt 720

tttttaggtg caggtccgag cattccggca ccggatgcag cagttaccga actggaagat 780

cgttggattg aaaaacatgg tattcagagc cgtaccaccg gtgcaagtga actggaaagc 840

aaaatggcag atctgagcct gggcaccatt agcatgccga aacgtcctgg ttttggtaca 900

ggtggtaatc cggttgttct gtgggcaaat tactttaacg tgaatctgaa actgggtgcc 960

gtgtatcgtt atgatctgcg tgttattagc aagaaactga ccaaagaaca ggatgatgca 1020

ctgagcaaac agcaagaaag cgcaagcaaa aaagcaaaag gtaaaccgaa acaggcaagc 1080

ggtcagcagc cgaatgcacc gaaagatgca cgtgaagcca aaggcaaaaa actgagcgaa 1140

gttattaaac tggcactgga tcgtctgcct ggtgaaccgg caattgcaac cgaatataaa 1200

cagcagctgg ttaccaccga aaaactgcag gttccgcctg atggtctgat gcaggttgaa 1260

ctggcagaac cgggtcgtaa tccggaaacc tggtatgttc gttttgatgg tccgagtagc 1320

attaatatcg caggtctgat ggattatgtt cgtagcctgg aagataaaaa cgatggtgtg 1380

tttccgaaat tcccggaaga aattgatgcc ctgggtattg ttctgggtca taccgcacgt 1440

gcaaatctga atacagcagc aattggtagc agccgttttt ttgcaattga tcaggcacgt 1500

aaagatcagg caagcatgcc accggatagc cgtattgaaa ttctgcgtgg ctatgttcag 1560

agcgttcgtc cggcaaccgg tcgtctgctg ctgaatacaa atgttaccca tgccgttttt 1620

cgtaaagccg ttaaactgga tgaactgttt cagaaatgtg gtctggcaaa tctgcatctg 1680

ccgcagcagc gtccgaatca tgcactgcgt accctggatg gcctgaacaa atttctggca 1740

aaaagtcgca ttgaatgcaa agttccgggt gaacgccctg gtgaattttt caaaatccag 1800

cgtggtatgg caggtctggc caccacaaaa gatggtaaag atgaagatca gaagccggaa 1860

tttaccgaaa gcggttttcg ctttggtaca ccggcaacag ttcgctttta tctgcgtaaa 1920

cctaaagatc tgggtgcaaa accgcctcct ggtctgagct ttgataccat ggttctggtt 1980

agcgattatt acaaagcccg ttatggtatt cgtgcagatc cgggtctgcc gctgattaat 2040

gttggcaccg caggcaaacc gatttatatc ctggcagaat tttgtaccct gctgcctggt 2100

cagccgctga aagcacgtct gagtccgcaa gagcaggatg caatgattcg ttttgcatgt 2160

cgtccgccac ctgaaaatgc cctgagcgtt accacctcag cacgtgaact gctggccctg 2220

gataataaca tgctgctgga taaatttggc atcaccgttg ataaacatct gattaccgtt 2280

aaaggtcgcg aactgcctcc tccggcagtt ggctatctgc gtggtaatag tattgaacgt 2340

gttacaccgg aaaatggtgg ttggctgatg aaaggtgtta aagtttgtaa aagcggtcgt 2400

cgtattgcaa attgggcatt tctggttatt ggtaaagccc gtccgcctat tgattttggt 2460

acgattaaaa gcgcagttgg tggttttgcc cgttttctga ataacaatat gggcatcgat 2520

atgaacatgc agccggttcc ggcaaatggt tatcagaccg caggtacaag cgaagaagat 2580

ctgcgcaacg catttcgtac cattagtaaa cagaaaccgc agcctgaatt tattctggtt 2640

ctgctgccag ataaagatgc aaccacctat aacatcgtga aaaaactggg agatgtggaa 2700

tatggtatta ccaccgtttg tgttcgtcaa gaaatgctta caaaagaaca aggtcagatg 2760

ggctattttg caaatgttgg tctgaaagtg aacctgaaat ttggtggcat taatcatcgt 2820

gttcgtgatg aaaccggtct ggttgataaa accatgtttg ttggttatga tgtgacccat 2880

ccgaccaatc tgccaggtgg tgccggtgat aatgcaccgt cactggttgg tctggtggca 2940

agcgttgata attcactggc acagtggcct gcagttacct gggaaaacaa aagccgtgtt 3000

gaacaggttg gtggtaaaac cgatgaaggc cagtttattg cccattttaa agatcgcctg 3060

cgtctgtggc agaaacataa tagcaatcgc ctgccggaaa acattgtgat ttttcgtgat 3120

ggtgttagcg aaggtcagtt tagcatggtg ctggaaaaag aactgccgaa cattcgtcag 3180

gcatgtcaag aaacctatcc ggcacgtccg aatgcgcagc ctcgtctgtc actgattgtt 3240

agcgttaaac gtcatcagac ccgtttctat ccgaccgatc gtaatcatat tcatccgcgt 3300

agcaaaagcc cgaaagaagg caccgttgtt gatcgtggtg ttaccaatgt tcgttattgg 3360

gatttttttc tgcaggcaca tgcaagcctg cagggcaccg cacgtccggc acattatacc 3420

gttctgctgg acgaaatttt tcgccataaa ttcggtccga acgcagcaga tgcactggaa 3480

accctgacac ataatatgtg ctatgcctat ggtcgtgcaa ccaaagcagt tagcatttgt 3540

ccgcctgcat attatgccga tctggttgca gcacgtgccc gtattcataa atcagaactg 3600

tttgaaaacg ttcagagcct ggcaagcagc gaacagagca gcgttagccg tcgtaaagtt 3660

catgatcgtc tgaaagatac catgtattat atctga 3696

Claims

1.一种真核生物来源的Argonaute蛋白，其特征在于，所述Argonaute蛋白为如下任一所示蛋白：

A1).氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；

A2).与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50％的序列一致性且具有相同功能的蛋白。

2.一种编码权利要求1所述Argonaute蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下任一所示：

B1).核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

B2).在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的DNA分子杂交且编码权利要求1所述Argonaute蛋白的DNA分子；

B3).与B1)或B2)限定的DNA序列具有至少50％序列一致性且编码权利要求1所述Argonaute蛋白的DNA分子。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2或3任一所述核酸分子。

5.一种eAgo复合物，其特征在于，由权利要求1所述Argonaute蛋白与向导分子复合形成，所述向导分子为ssDNA向导或RNA向导。

6.根据权利要求5所述的eAgo复合物，其特征在于，所述向导分子为5’末端磷酸化的RNA向导或5’末端羟基化的RNA向导。

7.根据权利要求5所述的eAgo复合物，其特征在于，所述向导分子为5’末端磷酸化的ssDNA向导或5’末端羟基化的ssDNA向导，且所述ssDNA向导的长度为12至30个核苷酸。

8.如权利要求5～7任意一项所述eAgo复合物在细胞内或体外特异性切割靶核酸中的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白具有核酸酶活性。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述eAgo复合物在体内或体外特异性切割靶核酸的方法具体为：令所述eAgo复合物与靶核酸接触，所述靶核酸含有与所述向导分子至少12个碱基互补的核苷酸序列，所述eAgo复合物特异性切割靶核酸。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白在10～65℃具有核酸酶活性。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白在二价金属阳离子的溶液中具有核酸酶活性，所述二价金属阳离子为Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述二价金属阳离子为Mn²⁺和/或Mg²⁺。

13.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白的核酸酶活性具有单碱基和/或双碱基专一性。

14.权利要求4所述表达载体在位点特异性修饰细胞的遗传材料中的应用。

15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述Argonaute蛋白，以及至少一个ssDNA向导和/或RNA向导。

16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述表达载体，以及至少一个ssDNA向导和/或RNA向导。