CN112538470B

CN112538470B - 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112538470B
Application number: CN202011457521.1A
Authority: CN
Inventors: 马立新; 王亚平; 刘洋; 姜小满
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112538470A; WO2022121301A1

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用，所述原核生物来源的Argonaute蛋白来源于中温原核生物kurthia massiliensis，所述原核生物来源的Argonaute蛋白命名为KmAgo。本发明的多肽、核酸、表达载体、组合物、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，因此可有效地应用于生物技术的许多领域，比如核酸检测、基因编辑和基因修饰，为基于原核生物来源的Argonaute多肽的基因编辑、修饰及分子检测提供了一种新的工具。

Description

一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用。

背景技术

目前，真核生物来源的Argonaute蛋白（简称eAgos）能够在常温条件下催化RNA向导（gRNA）引导的RNA切割反应，并在体内的RNA干扰（RNA interference，RNAi）途径中扮演关键角色。原核生物来源的Argonaute蛋白（简称pAgos）相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。早期研究主要集中于高温生物来源的pAgos，除了Marinitoga piezophila来源的MpAgo偏爱利用5’末端羟基化（5’OH）的RNA向导（gDNA）切割靶单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）和靶RNA之外，其余高温来源的pAgos都偏爱利用5’末端磷酸化（5’P）的gDNA切割靶ssDNA和/或靶RNA。高温生物来源的pAgos在中温条件下都只有低水平的gDNA引导的靶ssDNA和/或靶RNA切割活性，这限制了基于pAgos的RNA编辑技术的应用开发。最近的研究开始集中于中温生物来源的pAgos，以期找到能够在中温条件下有效切割靶DNA和/或靶RNA的pAgos。几乎所有已经表征的中温pAgos都偏爱在中温下催化gDNA引导的靶DNA切割，RNA切割活性不强。Natronobacterium gregory来源的NgAgo可以在常温下在gDNA的引导下切割靶RNA，但它的切割位点不确定，且并未证明能切割具有高级结构的RNA。此外，尽管eAgos被认为自pAgos进化而来，但是目前表征的pAgos并不能像eAgos一样在中温下催化gRNA引导的靶RNA切割反应。

长期以来，人们广泛关注靶向RNA的可编程核酸内切酶，因为这类酶可以应用于RNA结构功能研究、核酸检测领域、RNA纳米技术和RNA治疗学等领域。早期使用的的方法都存在一定的局限性，例如需要大量重新设计或针对每个靶标的额外选择性进化。新近发展的CRISPR/Cas核酸酶正迅速应用到核酸检测领域和病毒清除领域。但CRISPR/Cas核酸酶需要RNA向导，而RNA向导必须在体外转录和纯化，或者需要大量购买。此外，该类核酸酶尚未显示出识别结构化的RNA元件的功能。有的eAgos能够在gDNA的引导下在中温切割几乎所有类型的RNA，但大多数动植物细胞内存在RNAi途径，这些eAgos可能会干扰细胞本身的RNAi功能，这阻碍了将eAgos应用于细胞内的RNA编辑。原核生物体内不存在RNAi途径，因此pAgos可能不会影响细胞本身的RNAi功能。

RNA编辑领域仍然存在对能在常温条件下发挥作用并能应用于动植物细胞的RNA编辑的pAgos蛋白的迫切需求。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：RNA编辑是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程。RNA编辑与生物细胞发育和分化有关，是基因表达调控的一种重要方式。现有技术没有能在常温条件下有效靶向切割各类RNA并能应用于动植物细胞的RNA编辑的pAgos蛋白。通用的RNAi技术需要使用双链RNA（dsRNA），化学合成dsRNA价格高、定制周期长，体外转录dsRNA价格相对低廉，但操作困难、耗时，shRNA表达质粒方式基因干扰效果持久、经济，但制备耗时、存在非特异性基因抑制等。基于CRISPR的技术也需要用到长的RNA向导，存在和RNAi技术一样的问题，此外CRISPR相关蛋白（如Cas13a）依赖于靶位点附近的特殊基序来识别并结合靶，这限制了可以编辑的范围。最近发现CRISPR相关蛋白还存在极强的非特异性“附带切割”活性，这令人担忧其可能的脱靶反应。

解决以上问题及缺陷的意义为：一般认为pAgos可能不会干扰动植物细胞内的RNAi途径，DNA向导相对RNA合成周期短、便宜，pAgos不用依赖于靶位点附近的特殊基序来识别和结合靶RNA，这使得编辑RNA的任意位点成为可能。此外，pAgos的蛋白大小比大约只有eAgos的四分之三，CRISPR相关蛋白的二分之一，可能更易于转染进入细胞。总之，能够特异性切割各类RNA的pAgos是用于 RNA编辑的一种新型、有效的工具，将极大的促进RNA编辑领域的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用。

本发明是这样实现的，一种原核生物来源的Argonaute蛋白，所述原核生物来源的Argonaute蛋白来源于中温原核生物kurthia massiliensis，所述原核生物来源的Argonaute蛋白命名为KmAgo；

所述原核生物来源的Argonaute蛋白即pAgo；所述pAgo由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO.1具有至少50％同一性的氨基酸序列构成。

进一步，所述pAgo与如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

进一步，所述pAgo在10至80 ℃，优选地32至44 ℃的温度范围内具有核酸酶活性。

进一步，所述pAgo有利地且优选地在37 ℃下具有核酸酶活性。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为9至50个核苷酸，更优选地为12至30个核苷酸，甚至更优选地为15至20个核苷，如16、18或20个核苷酸。

进一步，所述pAgo复合物的RNA向导的长度为10至30个核苷酸，更优选地为12至25个核苷酸，甚至更优选为12至18个核苷酸，如13、15或18个核苷酸。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA没有高级结构；或，有高级结构。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是双链RNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是体外转录的RNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是病毒基因组RNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是信使RNA即mRNA和细胞内的其他RNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端磷酸化的ssDNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端羟基化的ssDNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端磷酸化的RNA。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的核酸酶活性需要存在至少一种选自Mn²⁺，Mg² ⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Zn²⁺和Ni²⁺或其中任意组合的阳离子。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的阳离子是Mn²⁺。

进一步，所述pAgo以及pAgo复合物的pAgo是提取的；或，是合成的。

进一步，所述pAgo靶DNA是ssDNA。

进一步，所述pAgo靶DNA是双链DNA。

本发明的另一目的在于提供一种编码所述pAgo的多核苷酸。

本发明的另一目的在于提供一种基于所述原核生物来源的Argonaute蛋白的体外切割RNA的方法，所述体外切割RNA的方法包括：

步骤一，基于pAgo和ssDNA向导形成 pAgo-向导复合物；

步骤二，令所得的pAgo-向导复合物与靶RNA接触，所述靶RNA具有与所述向导序列大部分互补的核苷酸序列，所述pAgo-向导复合物在特定位点切割靶RNA。

本发明的另一目的在于提供一种基于所述基于所述原核生物来源的Argonaute蛋白的细胞内切割靶RNA的方法，所述细胞内切割靶RNA的方法包括：

（1）将pAgo与ssDNA向导混合； pAgo和向导形成pAgo-向导复合物；

（2）通过转化、转染或转导将pAgo-向导复合物转入细胞；向导的序列与细胞内的一个RNA大部分互补配对。

进一步，所述细胞内切割靶RNA的方法发生在原位细胞中，可为活体组织、器官或包括人在内的动物。

本发明的另一目的在于提供一种基于原核生物来源的Argonaute蛋白的位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法，所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法包括：

将含有pAgo多核苷酸序列的表达载体导入细胞，并同时或不同时导入一个或多个ssDNA向导，在细胞内表达所述pAgo。

进一步，所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法发生于分离的细胞中。

进一步，所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法发生在原位细胞中，可为活体组织、器官或包括人在内的动物。

进一步，所述pAgos由一个表达载体编码。

进一步，所述含有pAgo多核苷酸序列的表达载体包含在病毒载体中。

进一步，所述细胞为原核生物细胞。

进一步，所述细胞为真核生物细胞。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述表达载体的病毒载体。

进一步，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述pAgo和ssDNA向导的试剂盒。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明涉及能在核酸链的引导下切割靶核苷酸序列的原核生物来源的Argonaute（pAgo）多肽。本发明还提供了包含编码所述多肽的核酸的表达载体，以及用于以序列特异性方式切割和编辑靶核酸的组合物、试剂盒和方法。本发明的多肽、核酸、表达载体、组合物、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，因此可有效地应用于生物技术的许多领域，比如核酸检测、基因编辑和基因修饰，为基于原核生物来源的Argonaute多肽的基因编辑、修饰及分子检测提供了一种新的工具。

本发明蛋白对单链DNA（single-stranded ssDNA）向导或RNA向导具有结合活性，并且具有对靶RNA和/或DNA的核酸酶活性，从而当与靶RNA和/或DNA序列具有大部分配对的ssDNA向导和/或RNA向导与pAgo结合形成pAgo-向导复合物时，并且当pAgo-向导复合物与靶RNA和/或DNA缔合时，靶RNA和/或DNA发生位点特异性切割。

本发明能在与单链DNA（ssDNA）向导和/或RNA向导形成复合物时切割靶DNA和/或RNA。可以通过选择具有特定核苷酸序列的DNA向导和/或RNA向导来调节位点特异性。本发明还涉及将pAgo-向导复合物用于遗传材料的位点特异性修饰，该遗传材料可以是从细胞中提取的也可以是在细胞内的。因此，本发明涉及一种用于RNA编辑技术的pAgo蛋白。

本发明用到的pAgo能够使用长度为18 nt的DNA向导特异性切割含有高度二级结构的RNA，这使得切割各类RNA成为可能。并且DNA向导相对于RNA合成周期短、价格低廉，能极大地节省成本。此外，本发明用到的pAgo不用依赖靶位点附近的特殊基序来识别和结合靶，DNA向导设计方便，不用考虑位点限制。本发明用到的pAgo切割活性强，严格依赖于向导和靶的互补配对发挥切割活性，不存在CRISPR相关蛋白的非特异性“附带切割”活性，特异性更好。进一步地，将pAgo的活性位点进行突变，能够得到完全丧失切割活性的pAgo，可以融合其它效应蛋白，进一步拓展了其应用。一般认为pAgos可能不会干扰动植物细胞内的RNAi途径，这使得采用本发明的技术进行RNA编辑可能对动植物细胞的内源途径影响最小。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的部分已表征Argonaute蛋白的进化树示意图。

图2是本发明实施例提供的十七个已表征Ago蛋白的序列比对示意图。

图3是本发明实施例提供的SDS-PAGE凝胶分析KmAgo纯度示意图。

图4是本发明实施例提供的用于测试的靶DNA、靶RNA、ssDNA向导和ssRNA向导的序列示意图。

图5是本发明实施例提供的检测KmAgo切割靶ssDNA示意图。

图6是本发明实施例提供的检测KmAgo切割靶RNA示意图。

图7是本发明实施例提供的测定不同Mn²⁺浓度靶RNA / DNA向导产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶示意图。

图8是本发明实施例提供的测定不同Mn²⁺浓度靶RNA / RNA向导产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶的示意图。

图9是本发明实施例提供的测定不同温度靶RNA / DNA向导产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶的示意图。

图10是本发明实施例提供的测定不同温度靶RNA / RNA向导产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶的示意图。

图11是本发明实施例提供的测试靶向具有高级结构的靶RNA的DNA向导设计示意图及HIV-1 ΔDIS 5′UTR的序列的示意图。

图12是本发明实施例提供的测试具有高级结构的靶RNA / DNA向导切割产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的原核生物来源的Argonaute蛋白来源于中温原核生物kurthia massiliensis，所述原核生物来源的Argonaute蛋白命名为KmAgo；

优选地，所述pAgo与如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

所述pAgo在10至80 ℃，优选地32至44 ℃的温度范围内具有核酸酶活性。

所述pAgo有利地且优选地在37 ℃下具有核酸酶活性。

本发明还提供一种利用所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为9至50个核苷酸，更优选地为12至30个核苷酸，甚至更优选地为15至20个核苷，如16、18或20个核苷酸。

优选地，所述pAgo复合物的RNA向导的长度为10至30个核苷酸，更优选地为12至25个核苷酸，甚至更优选为12至18个核苷酸，如13、15或18个核苷酸。

所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA没有高级结构；或，有高级结构。

所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是双链RNA。

优选地，所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是体外转录的RNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是病毒基因组RNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的靶RNA是信使RNA即mRNA和细胞内的其他RNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端磷酸化的ssDNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端羟基化的ssDNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端磷酸化的RNA。

所述pAgo以及pAgo复合物的核酸酶活性需要存在至少一种选自Mn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Zn²⁺和Ni²⁺或其中任意组合的阳离子。

优选地，所述pAgo以及pAgo复合物的阳离子是Mn²⁺。

所述pAgo以及pAgo复合物的pAgo是提取的；或，是合成的。

所述pAgo靶DNA是ssDNA。

所述pAgo靶DNA是双链DNA。

本发明还提供一种编码所述pAgo的多核苷酸。

本发明还提供一种基于所述原核生物来源的Argonaute蛋白的体外切割RNA的方法，所述体外切割RNA的方法包括：

步骤一，基于pAgo和ssDNA向导形成 pAgo-向导复合物；

所述细胞内切割靶RNA的方法发生在原位细胞中，可为活体组织、器官或包括人在内的动物。

本发明还提供一种基于原核生物来源的Argonaute蛋白的位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法，所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法包括：

所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法发生于分离的细胞中。

所述位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法发生在原位细胞中，可为活体组织、器官或包括人在内的动物。

所述pAgos由一个表达载体编码。

所述含有pAgo多核苷酸序列的表达载体包含在病毒载体中。

所述细胞为原核生物细胞。

所述细胞为真核生物细胞。

本发明还提供一种包含所述表达载体的病毒载体。

所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

本发明还提供一种包含所述pAgo和ssDNA向导的试剂盒。

下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。

实施例1 KmAgo表达和纯化

转化pET28a-KmAgo质粒至大肠杆菌BL21(DE3)，单菌落接种到含有50 mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.8时，移至18 ℃摇床过夜。6000 rpm离心10 min收集菌体，用Buffer A（20 mM Tris–HCl pH 7.5,500 mM NaCl, 10 mM imidazole）洗菌后，将菌体重悬于Buffer A，添加终浓度1 mM的PMSF，高压破碎。18000 rpm离心30 min，收集上清。上清过滤后，进行Ni-NTA纯化。

10 mM咪唑和20 mM咪唑各洗9个柱体积（分3次加入），50 mM、80 mM、100 mM、150mM、200 mM、250 mM、300 mM、1 M各洗3个柱体积，取样进行SDS-PAGE检测。收集含有高纯度目的蛋白的洗脱组分，超滤换液至Buffer B（20 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl，1 mMDTT）。用20 mM HEPES pH 7.5将NaCl浓度稀释至125 mM后，进行肝素柱(HiTrap HeparinHP，GE Healthcare)纯化。肝素柱预先用Buffer C (20 mM HEPES pH 7.5，125 mM NaCl和1mM DTT)平衡，通过升高NaCl的浓度洗脱KmAgo。经肝素纯化的蛋白用分子筛(Superdex 20016/600 column，GE Healthcare)纯化，分子筛预先用Buffer D(20 mM HEPES pH7.5，500mM NaCl和1 mM DTT)平衡。收集纯化的蛋白并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定纯度（图3）。将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在-80 ℃。

图2显示了催化DEDX四联体所在的区域，以及KmAgo和其他Ago的序列一致性。图3显示了经过Ni-NTA柱和肝素柱，并最终使用分子筛对KmAgo进行纯化之后，凝胶分析KmAgo的结果。通过http://www.expasy.org/计算，KmAgo的预期大小为82 kDa。

实施例2 测试KmAgo的切割活性

为了评估KmAgo能够裂解RNA / DNA向导和RNA / DNA靶的哪些组合，对所有可能的组合进行了活性测定。裂解试验均在37 ℃下以4：2：1（pAgo：向导：靶）摩尔比进行。将800nM KmAgo与400 nM向导放在含有10 mM HEPES-NaOH pH 7.5、100 mM NaCl，5 mM MnCl₂和5％甘油的反应缓冲液中混合，并在37 ℃孵育10分钟以用于向导加载。将核酸靶添加至200nM。37℃反应1 h后，通过将样品与2x RNA上样染料（95％甲酰胺，18 mM EDTA和0.025％SDS和0.025％溴酚蓝）混合并在95°C加热5分钟来终止反应。裂解产物通过20％变性PAGE解析，用SYBR Gold（Invitrogen）染色，用Gel Doc^TM XR+（Bio-Rad）可视化。

在没有KmAgo的情况下进行孵育的DNA/RNA（引导/靶）对照测定中未观察到产物带（34nt），表明产物带的形成是KmAgo核酸酶活性的结果。KmAgo可以利用5’磷酸化的DNA向导和5’羟基化的DNA向导切割靶DNA和RNA，也可以利用5’磷酸化的RNA切割靶DNA和靶RNA（图5和图6）。

图4箭头表示预测的切割位点。图5 KmAgo可以在结合ssDNA向导和RNA向导之后切割靶ssDNA。图6 KmAgo可以在结合ssDNA向导和RNA向导之后切割靶RNA。

实施例3 KmAgo可以在极低的Mn²⁺浓度下切割靶RNA

接下来的活性测定集中于寻找15 min内KmAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的Mn²⁺浓度范围。Mn²⁺浓度范围设置为0-10 mM，向导为5’磷酸化的DNA时，Mn2+浓度为0.01 mM时，就可以高效切割靶RNA（图7）；向导为5’磷酸化的RNA时，Mn2+浓度大于0.5 mM时，可以有效切割靶RNA（图8）。

图7在添加靶之前，将DNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。在0.05-10 mM之间出现34 nt产物带，表明有效反应。

图8在添加靶之前，将RNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。在0.05-10 mM之间出现34 nt产物带，表明有效反应。

实施例4 KmAgo可以在中温下切割RNA

接下来的活性测定集中于寻找15 min内KmAgo表现出向导引导的靶RNA裂解的温度范围。温度范围设置为25-80 ℃，向导为5’磷酸化的DNA时，温度为25-75 ℃时可以切割靶RNA，其中30-55 ℃最好（图9）；向导为5’磷酸化的RNA时，温度为25-50 ℃时可以切割靶RNA，其中37-45 ℃最好（图10）。

图9在添加靶之前，将DNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。在25-75 ℃之间出现34 nt产物带，表明有效反应。

图10在添加靶之前，将DNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。在25-50 ℃之间出现34 nt产物带，表明有效反应。

实施例5 KmAgo可以在中温下切割具有高级结构的靶RNA

现有技术HIV-1 ΔDIS 5'UTR是高度结构化的RNA（图11）。使用T7 RNA聚合酶和带有T7启动子序列的合成DNA模板体外转录HIV-1 ΔDIS 5'UTR。用于切割测定的转录物经DNase I处理并凝胶纯化。本发明设计了11个gDNA（长度为18 nt）来指导KmAgo在不同的位点切割。在所有位点的预期位置都检测到切割产物，尽管程度不同（图12），这表明即使在高度结构化的RNA中，KmAgo-gDNA复合物也会切割靶RNA序列。

图11在添加靶之前，将DNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。在25-50 ℃之间出现34 nt产物带，表明有效反应。

图12在添加靶之前，将DNA向导与KmAgo在室温下孵育10分钟。所有反应都出现预测条带，表明有效反应。

实施例6：

本发明发现了一种来源于中温原核生物kurthia massiliensis的Argonaute蛋白，并命名为KmAgo。

本发明的第一方面涉及提供一种原核生物来源的Argonaute（pAgo）蛋白，其包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO.1具有至少50％同一性的氨基酸序列，该蛋白对单链DNA（single-stranded ssDNA）向导或RNA向导具有结合活性，并且具有对靶DNA和/或靶RNA的核酸酶活性，从而当与靶RNA和/或DNA序列具有大部分配对的ssDNA向导和/或RNA向导与pAgo结合形成pAgo-向导复合物时，并且当pAgo-向导复合物与靶RNA和/或DNA缔合时，靶DNA和/或RNA发生位点特异性切割。

本发明的第二方面涉及提供一种pAgo，其包含如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列，或包含优选地在严格条件下可与SEQ ID NO.2所示序列杂交的多核苷酸序列，该pAgo对单链DNA（single-stranded ssDNA）向导或RNA向导具有结合活性，并且具有对靶DNA和/或RNA的核酸酶活性，从而当与靶RNA和/或DNA具有实质互补性的ssDNA向导和/或RNA向导与pAgo结合形成pAgo-向导复合物时，并且当pAgo-向导复合物与靶RNA和/或DNA缔合时，靶RNA和/或DNA发生位点特异性切割。

本发明的第三方面涉及提供一种体外切割RNA的方法，其步骤如下：提供如本发明所述的pAgo和ssDNA向导和/或RNA向导，向导和所述pAgo形成 pAgo-向导复合物；使所得的pAgo-向导复合物与靶RNA接触，所述靶RNA具有与所述向导序列大部分互补的核苷酸序列，所述pAgo-向导复合物在特定位点切割靶RNA。

优选地，本发明中的pAgos的长度是737个氨基酸，也可能是一段更长或更短的连续氨基酸。氨基酸个数（更长或更短）可能是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，或250。

因此，上述连续氨基酸的定义是包括小于本发明所述pAgo全长（737个氨基酸），但保留了与向导形成pAgo-向导复合物和对靶RNA的位点特异性切割活性的功能片段。

当使用本发明的第一方面和第二方面中的pAgo时，优选地它们是相同的，但不必一定是相同的。

ssDNA向导和/或RNA向导与靶RNA基本互补，这意味着该向导要么与靶RNA包含的相同长度的序列完全互补，要么存在许多错配（通常是分离的，也可能是连续的）。错配的数目可能是1、2、3、4或5等。

此pAgo可能与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

可选地，本发明的pAgo在5’末端或3’末端或两个末端均包含核定位序列（nuclearlocalisation sequence，NLS）。预计本发明中的pAgo在5’末端或3’末端或两个末端具有多个NLS。

在优选的实施方案中，pAgo在10至80 ℃，优选地32至44 ℃的温度范围内具有核酸酶活性。有利地且优选地，本发明的pAgo在37 ℃下具有核酸酶活性。

优选地，形成pAgo复合物的ssDNA向导的长度为9至50个核苷酸，更优选地为12至30个核苷酸，甚至更优选地为15至20个核苷酸，比如16、18或20个核苷酸。

优选地，形成pAgo复合物的RNA向导的长度为10至30个核苷酸，更优选地为12至25个核苷酸，甚至更优选地为12至18个核苷酸，比如13、15或18个核苷酸。

在一些实施方案中，靶RNA是没有高级结构地。在其他实施方案中，靶RNA是有高级结构地。其他可能的靶RNA包括双链RNA，体外转录的RNA，病毒基因组RNA，信使RNA（mRNA）和细胞内的其他RNA。

向导可以是5’末端磷酸化的ssDNA和/或RNA，也可以是羟基化的ssDNA。向导可以包含末端5’-三磷酸酯。

优选地，本发明的pAgo的核酸酶活性需要存在至少一种选自Mn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Zn²⁺和Ni²⁺或其中任意组合的阳离子。特别优选的阳离子是Mn²⁺。所用阳离子的浓度范围可以从约0.01 mM至约2000 mM变化。特别优选地，范围是约0.05 mM至约20 mM。

本发明的第四方面提供了一种能在细胞内切割靶RNA的方法，包括以下步骤：

1）将本发明定义的pAgo与ssDNA向导和/或RNA向导混合；

2）pAgo和向导形成pAgo-向导复合物；

3）通过转化、转染或转导将pAgo-向导复合物转入细胞；

4）优选地，向导的序列与细胞内的一个RNA大部分互补配对。

本发明的第五方面提供了一种位点特异性修饰细胞的遗传材料的方法，将一个含有本发明所述pAgo多核苷酸序列的表达载体导入细胞，并同时或不同时导入一个或多个ssDNA向导，从而在细胞内表达本发明所述的pAgo。

在一些实施案例中，位点特异性修饰方法发生在分离的细胞中。在其他的实施案例中，本发明中的方法可能发生在原位细胞中，可能是活体组织、器官或包括人在内的动物。本方法包含的pAgo可能由一个表达载体编码。在其他此类方法中，一个或多个pAgo可能由两个表达载体编码。在一些实施案例中，本发明中的方法可能包含一个编码所有pAgos的表达载体。本发明的一些方法中该表达载体可能包含在病毒载体中，比如慢病毒载体或逆转录病毒载体。

本发明所述的方法可能用在原核生物细胞中。在其他实施案例中，本发明所述的方法可能用在真核生物细胞中。

本发明的第六方面提供了试剂盒。试剂盒1包含了本发明所述的pAgo，以及至少一条ssDNA向导和/或RNA向导。试剂盒2包含了本发明所述的表达载体和ssDNA向导和/或RNA向导。可选地，试剂盒3包含了一个本发明所述的病毒载体和一个编码ssDNA向导和/或RNA向导的病毒载体。

本发明的第七方面涉及提供一种pAgo蛋白，其包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO.1具有至少50％同一性的氨基酸序列，该蛋白对单链DNA（single-stranded ssDNA）向导或RNA向导具有结合活性，对靶DNA和靶RNA没有核酸酶活性，从而当与靶RNA或靶DNA具有大部分配对的ssDNA向导和/或RNA向导与pAgo结合形成pAgo-向导复合物时，并且当pAgo-向导复合物与靶RNA缔合时，靶RNA或靶DNA发生位点特异性阻碍。

通过突变对pAgo蛋白的催化活性必不可少的一个或多个氨基酸残基来造成核酸酶活性，特别是核酸内切酶活性缺失。也就是说，至少突变一个位于进化保守的氨基酸四联体（DEDD / H）中的氨基酸。因此，突变可能是pAgo蛋白中以下任意一个或多个氨基酸序列部分中的单个氨基酸变化：

FIGIDVSHE

ILAGEKIDD

TIHRDGFWR

IHYADLSAT

更特别地，氨基酸变化是在以上一个或多个突出显示的残基处的单个变化。优选地，单个突变是非保守取代，例如从D到A，或从E到A。因此，除了D到E或E到D以外的任何替换都是可能的。

除了替换以外，一个或多个突出显示的残基可以被简单地删除，可选地，可以连续或不连续地删除序列基序内的一个或多个氨基酸。可以整体删除一个或多个序列基序。可以进行上述更改的任何组合，例如一个基序非保守变化，其他三个基序缺失。

本发明中的核酸酶缺陷型pAgo的结构特征还可以包括如上文关于具有核酸酶活性pAgos所定义的任何结构变化。例如，与参考序列相比的序列一致性范围，就氨基酸结构域而言的pAgo的组成以及就氨基酸而言的总长度。向导的定义与本发明中具有核酸酶活性pAgos所用的向导相似。

在本发明的第七方面中，pAgo-向导复合物不具有核酸酶活性，这意味着有利地存在一种通过特异性序列识别来阻断靶DNA或RNA中的特定位点的方法，靶可以是单链和双链。这样的位点特异性阻断提供了阻断目标基因转录的精确手段，或者阻断、破坏或干扰参与基因表达调节的特异性位点。

因此，本发明进一步提供了一种位点特异性靶向阻断靶DNA或靶RNA的体外方法，包括以下步骤：提供如本发明所述的无核酸酶活性的pAgo和ssDNA向导和/或RNA向导，向导和所述pAgo形成 pAgo-向导复合物；使所得的pAgo-向导复合物与靶RNA或靶DNA接触，所述靶具有与所述向导序列大部分互补的核苷酸序列，所述pAgo-向导复合物结合在靶上与向导大部分互补的区域。

另外，本发明提供了一种位点特异性阻断细胞中靶多核苷酸的方法，步骤包括：混合本发明定义的核酸酶失活pAgo和ssDNA向导，所述pAgo和所述向导形成pAgo-向导复合物；将pAgo-向导复合物转入细胞，比如通过转化、转染或显微注射，并且向导序列与靶DNA或RNA包含的一段DNA或RNA序列基本互补。

另外，本发明包括一种在细胞中对靶DNA或靶RNA进行位点特异性靶向阻断的方法，该方法包括以下步骤：

1）用编码如上所述的核酸酶无活性pAgo的表达载体转染、转化或转导细胞；

2）转染、转化或转导第一个ssRNA向导序列和第二个ssRNA向导序列;

3）其中至少一个向导序列与靶DNA或靶RNA中包含的DNA或RNA序列基本互补，并且在细胞中表达产生的pAgo和RNA向导形成能阻断特定位点pAgo-向导复合物。

有利地，使用本发明的无核酸酶活性pAgos的位点特异性阻断靶多核苷酸方法可以靶向破坏基因表达，和/或基因表达的控制元件，如启动子或增强子。上述位点特异性阻断靶DNA或靶RNA的各种方法中，特别优选或任选的方面参照本发明定义的核酸酶活性pAgos。

实施例7：

Sequence ID NO.1 KmAgo氨基酸序列

Met Glu Ala Tyr Ile Thr Glu Met Val Ser Arg Glu Arg Ala Asn Glu

Leu Glu Val Tyr Val Tyr Val Phe Pro Arg Lys Gln Ser Asp Asn Asn

Tyr Glu Gly Val Tyr His Ile Met Arg Ala Trp Gln Arg Ala Asn Asp

Leu Pro Leu Ala Tyr Asn Gln His Thr Ile Met Ala Phe Ser Pro Val

Arg His Met Cys Gly Tyr Thr Pro Met Glu Thr Gln Lys Arg His Ile

Asn Ile Asp Ser Pro Phe Glu Arg Ala Leu Leu Glu Arg Leu Ile Lys

Asn Ser Leu Ile Phe Thr Ala Glu Arg His Leu His Ala Lys Arg Val

Gly His Ala Leu Arg Leu Asn Gln Val Gln Gln Ile Arg Gln Val Ile

Ile Tyr Glu Ala Ile Glu Leu Tyr Val Asn Ile Ile Glu Asn Arg Ile

Ser Ile Gly Phe His Leu Thr His Gln Phe Glu Tyr Val Tyr Thr Leu

Gln Ser Met Ile Glu Gln Gly Lys Thr Ile Arg Pro Gly Met Arg Val

Val His Ser Asn Gly Arg Gln His Tyr Thr Tyr Thr Val Glu Asn Val

Ala Thr Tyr Gly Val Thr Asp Arg Cys Pro Leu Leu Gln Thr Ser Ile

Tyr Gln Tyr Tyr Val Glu Lys Gly Ala Gln His Ile Leu Arg Thr Phe

Thr Arg Ser Thr Arg Val Ile His Val Arg Thr Lys Glu Gln Arg Leu

Ser Tyr Ala Ala Thr Leu Leu Lys Pro Leu Cys Thr Phe Glu Thr Met

Gln Pro Gln Asp Val Leu Asn Val Ser Lys Cys Ile Lys Leu Ser Ala

Ser Lys Arg Met Lys Cys Thr Tyr Arg Trp Ile Gln Gln Leu Arg Ala

Gln Tyr Arg His Leu Thr Phe Ala Pro Asn Pro Phe Thr Ile Ala Gln

Asn Gly Tyr Lys Leu Asp Gln Leu Ser Thr Pro Lys Val His Phe His

Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Ser Gly Met Lys Thr Gly Lys Leu Tyr

Lys Gly Gly Asn Ile Lys Ile Ser Val Leu Phe Asp Glu Asp Phe Tyr

Leu Lys His His Ile Thr Lys Lys Asp Ile Tyr Gln Phe Ile Ala Val

Leu Gln Lys Ile Ala Ile Ala Gln Gly Val Asn Met Thr Ile Ser Thr

Ser Thr Lys Ser Ile Thr Gly Lys Phe Thr Asp Asp Phe Phe His His

Phe Thr Glu Glu Val Glu Ala Leu Gln Pro Ile Phe Ala Gln Thr Thr

Val Leu Ala Phe Ile Thr Ser Thr His Leu Ser Asn Lys Lys Thr Arg

Ser Tyr Gln Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Gly Gly Lys Trp Asp Ile Ala

Ser Gln Val Ile Thr Glu Lys Thr Ile Glu Ala Phe Gln Lys Ile Leu

His Lys His Gly Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Asn Asp Glu Gln His Cys

Leu Arg Val Ile Asp Val Leu Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Tyr Thr Val

Met Asn Ile Leu Leu Gly Val Tyr Val Lys Ser Gly Ile Gln Pro Trp

Ile Leu Ala Asn Thr Thr His Ser Asp Cys Phe Ile Gly Ile Asp Val

Ser His Glu Asn Gly Asn Ser Ala Ala Gly Met Met Asn Val Ile Gly

Ser Gln Gly His Leu Ile Gln Gln Ala Pro Leu Asn Gly Ile Leu Ala

Gly Glu Lys Ile Asp Asp Thr Leu Leu Ala Asn Leu Leu Lys Gln Met

Ile Lys Ala Tyr His Thr Gln Phe Gln Arg Phe Pro Lys His Ile Thr

Ile His Arg Asp Gly Phe Trp Arg Glu His Thr Ala Leu Val Glu Lys

Lys Pro Asn Arg Arg Met Ala Phe Phe Asn Ser Val Asp Asn Thr Phe

Ser Thr Arg Gln Gly Thr Val Tyr Gln Arg Gly Asn Glu Ala Phe Leu

Cys Ala Thr Asn Pro Gln Gln Lys Val Gly Met Ala Gln Pro Ile Lys

Ile His Gln Val Thr Lys Thr Leu Pro Phe Ser His Ile Ile Glu Asp

Val Tyr Asn Leu Ser Phe Leu His Ile His Ala Met Asn Lys Met Arg

Leu Pro Ala Thr Ile His Tyr Ala Asp Leu Ser Ala Thr Ala Tyr Gln

Arg Gly Gln Val Met Pro Arg Ser Gly Asn Gln Thr Asn Leu Pro Phe

Val

Sequence ID NO.2 KmAgo多核苷酸序列

atggaagcttacatcaccgagatggtgtccagagaaagagctaacgagttggaggtttacgtctacgtgttcccaagaaagcagtccgacaacaactacgagggtgtctaccacattatgagagcttggcaaagagccaacgacttgccattggcttacaaccagcacaccatcatggctttctcaccagttagacacatgtgcggttacaccccaatggaaactcagaagagacacatcaacatcgactccccattcgagagagctttgttggagagactgatcaagaactccttgatcttcactgccgagagacacttgcatgctaagagagttggtcacgccttgagattgaaccaggttcagcaaatcaggcaggtcatcatctacgaggctatcgagttgtacgtcaacatcatcgagaacaggatctccatcggtttccacttgactcaccaattcgagtacgtctacaccctgcagtccatgattgagcagggtaagactatcagaccaggtatgagagttgtccactccaacggtagacagcactacacttacaccgttgagaacgttgctacctacggtgttactgacagatgtcctttgttgcagacctccatctaccagtactacgttgagaagggtgctcagcacatcttgagaactttcaccagatccaccagagtcatccacgttaggaccaaagagcagagattgtcctacgctgctaccttgttgaagccattgtgtaccttcgagactatgcagccacaggacgttttgaacgtttccaagtgcatcaagttgtccgcctccaagagaatgaagtgcacctacagatggattcagcagttgagagcccagtacagacacttgactttcgccccaaatccattcactatcgcccagaacggttacaagttggaccagttgtctaccccaaaggtccacttccatagagactacgctactgttgtctccggtatgaagaccggtaagttgtacaaaggtggtaacatcaagatctccgtcctgttcgatgaggacttctacttgaagcaccacatcaccaagaaggatatctaccaattcattgccgtcctgcagaagatcgctattgctcagggtgttaacatgaccatctccacctccactaagtccatcactggtaagttcaccgacgatttcttccaccacttcaccgaagaggttgaagccttgcaacctatcttcgctcagactactgttctggccttcatcacttctacccacctgtccaacaagaaaaccaggtcctaccaattgctgaagcagtactttggtggtaagtgggacattgcttcccaggttatcaccgaaaagactatcgaggccttccaaaagatcctgcacaagcacggtctgaagaacttttacccaaacgacgagcagcactgcttgagagttattgacgtcttgaagaacgagtccttctactacaccgtcatgaacatcctgctgggtgtttacgttaagtccggtattcagccatggatcttggctaacactactcactccgactgcttcatcggtattgacgtttctcacgagaacggtaactctgctgctggtatgatgaacgttattggttcccagggtcacttgatccaacaggctccattgaacggtattttggccggtgaaaagatcgacgacaccttgttggccaatctgttgaagcagatgatcaaggcctaccacactcagttccagagattcccaaagcacatcactatccaccgtgacggtttttggagagaacacactgctttggtcgagaagatcatgtctcactacgagatcacctacgacatcgtcgagatcatcaaaaagccaaacagaaggatggccttcttcaactccgttgacaacactttctccaccagacagggtactgtttaccagagaggtaacgaggctttcctgtgtgctacaaacccacagcaaaaggttggtatggctcagccaatcaagattcaccaggttaccaagaccttgccattctctcacattatcgaggacgtgtacaacctgtccttcttgcacattcacgccatgaacaagatgagattgccagccactattcactacgctgacttgtctgctactgcttaccaacgtggtcaggttatgcctagatctggtaaccagaccaacctgccattcgtttaa

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 721

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Ala Tyr Ile Thr Glu Met Val Ser Arg Glu Arg Ala Asn Glu

1 5 10 15

Leu Glu Val Tyr Val Tyr Val Phe Pro Arg Lys Gln Ser Asp Asn Asn

20 25 30

Tyr Glu Gly Val Tyr His Ile Met Arg Ala Trp Gln Arg Ala Asn Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Ala Tyr Asn Gln His Thr Ile Met Ala Phe Ser Pro Val

50 55 60

Arg His Met Cys Gly Tyr Thr Pro Met Glu Thr Gln Lys Arg His Ile

65 70 75 80

Asn Ile Asp Ser Pro Phe Glu Arg Ala Leu Leu Glu Arg Leu Ile Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Ile Phe Thr Ala Glu Arg His Leu His Ala Lys Arg Val

100 105 110

Gly His Ala Leu Arg Leu Asn Gln Val Gln Gln Ile Arg Gln Val Ile

115 120 125

Ile Tyr Glu Ala Ile Glu Leu Tyr Val Asn Ile Ile Glu Asn Arg Ile

130 135 140

Ser Ile Gly Phe His Leu Thr His Gln Phe Glu Tyr Val Tyr Thr Leu

145 150 155 160

Gln Ser Met Ile Glu Gln Gly Lys Thr Ile Arg Pro Gly Met Arg Val

165 170 175

Val His Ser Asn Gly Arg Gln His Tyr Thr Tyr Thr Val Glu Asn Val

180 185 190

Ala Thr Tyr Gly Val Thr Asp Arg Cys Pro Leu Leu Gln Thr Ser Ile

195 200 205

Tyr Gln Tyr Tyr Val Glu Lys Gly Ala Gln His Ile Leu Arg Thr Phe

210 215 220

Thr Arg Ser Thr Arg Val Ile His Val Arg Thr Lys Glu Gln Arg Leu

225 230 235 240

Ser Tyr Ala Ala Thr Leu Leu Lys Pro Leu Cys Thr Phe Glu Thr Met

245 250 255

Gln Pro Gln Asp Val Leu Asn Val Ser Lys Cys Ile Lys Leu Ser Ala

260 265 270

Ser Lys Arg Met Lys Cys Thr Tyr Arg Trp Ile Gln Gln Leu Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Arg His Leu Thr Phe Ala Pro Asn Pro Phe Thr Ile Ala Gln

290 295 300

Asn Gly Tyr Lys Leu Asp Gln Leu Ser Thr Pro Lys Val His Phe His

305 310 315 320

Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Ser Gly Met Lys Thr Gly Lys Leu Tyr

325 330 335

Lys Gly Gly Asn Ile Lys Ile Ser Val Leu Phe Asp Glu Asp Phe Tyr

340 345 350

Leu Lys His His Ile Thr Lys Lys Asp Ile Tyr Gln Phe Ile Ala Val

355 360 365

Leu Gln Lys Ile Ala Ile Ala Gln Gly Val Asn Met Thr Ile Ser Thr

370 375 380

Ser Thr Lys Ser Ile Thr Gly Lys Phe Thr Asp Asp Phe Phe His His

385 390 395 400

Phe Thr Glu Glu Val Glu Ala Leu Gln Pro Ile Phe Ala Gln Thr Thr

405 410 415

Val Leu Ala Phe Ile Thr Ser Thr His Leu Ser Asn Lys Lys Thr Arg

420 425 430

Ser Tyr Gln Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Gly Gly Lys Trp Asp Ile Ala

435 440 445

Ser Gln Val Ile Thr Glu Lys Thr Ile Glu Ala Phe Gln Lys Ile Leu

450 455 460

His Lys His Gly Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Asn Asp Glu Gln His Cys

465 470 475 480

Leu Arg Val Ile Asp Val Leu Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Tyr Thr Val

485 490 495

Met Asn Ile Leu Leu Gly Val Tyr Val Lys Ser Gly Ile Gln Pro Trp

500 505 510

Ile Leu Ala Asn Thr Thr His Ser Asp Cys Phe Ile Gly Ile Asp Val

515 520 525

Ser His Glu Asn Gly Asn Ser Ala Ala Gly Met Met Asn Val Ile Gly

530 535 540

Ser Gln Gly His Leu Ile Gln Gln Ala Pro Leu Asn Gly Ile Leu Ala

545 550 555 560

Gly Glu Lys Ile Asp Asp Thr Leu Leu Ala Asn Leu Leu Lys Gln Met

565 570 575

Ile Lys Ala Tyr His Thr Gln Phe Gln Arg Phe Pro Lys His Ile Thr

580 585 590

Ile His Arg Asp Gly Phe Trp Arg Glu His Thr Ala Leu Val Glu Lys

595 600 605

Lys Pro Asn Arg Arg Met Ala Phe Phe Asn Ser Val Asp Asn Thr Phe

610 615 620

Ser Thr Arg Gln Gly Thr Val Tyr Gln Arg Gly Asn Glu Ala Phe Leu

625 630 635 640

Cys Ala Thr Asn Pro Gln Gln Lys Val Gly Met Ala Gln Pro Ile Lys

645 650 655

Ile His Gln Val Thr Lys Thr Leu Pro Phe Ser His Ile Ile Glu Asp

660 665 670

Val Tyr Asn Leu Ser Phe Leu His Ile His Ala Met Asn Lys Met Arg

675 680 685

Leu Pro Ala Thr Ile His Tyr Ala Asp Leu Ser Ala Thr Ala Tyr Gln

690 695 700

Arg Gly Gln Val Met Pro Arg Ser Gly Asn Gln Thr Asn Leu Pro Phe

705 710 715 720

Val

<210> 2

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaagctt acatcaccga gatggtgtcc agagaaagag ctaacgagtt ggaggtttac 60

gtctacgtgt tcccaagaaa gcagtccgac aacaactacg agggtgtcta ccacattatg 120

agagcttggc aaagagccaa cgacttgcca ttggcttaca accagcacac catcatggct 180

ttctcaccag ttagacacat gtgcggttac accccaatgg aaactcagaa gagacacatc 240

aacatcgact ccccattcga gagagctttg ttggagagac tgatcaagaa ctccttgatc 300

ttcactgccg agagacactt gcatgctaag agagttggtc acgccttgag attgaaccag 360

gttcagcaaa tcaggcaggt catcatctac gaggctatcg agttgtacgt caacatcatc 420

gagaacagga tctccatcgg tttccacttg actcaccaat tcgagtacgt ctacaccctg 480

cagtccatga ttgagcaggg taagactatc agaccaggta tgagagttgt ccactccaac 540

ggtagacagc actacactta caccgttgag aacgttgcta cctacggtgt tactgacaga 600

tgtcctttgt tgcagacctc catctaccag tactacgttg agaagggtgc tcagcacatc 660

ttgagaactt tcaccagatc caccagagtc atccacgtta ggaccaaaga gcagagattg 720

tcctacgctg ctaccttgtt gaagccattg tgtaccttcg agactatgca gccacaggac 780

gttttgaacg tttccaagtg catcaagttg tccgcctcca agagaatgaa gtgcacctac 840

agatggattc agcagttgag agcccagtac agacacttga ctttcgcccc aaatccattc 900

actatcgccc agaacggtta caagttggac cagttgtcta ccccaaaggt ccacttccat 960

agagactacg ctactgttgt ctccggtatg aagaccggta agttgtacaa aggtggtaac 1020

atcaagatct ccgtcctgtt cgatgaggac ttctacttga agcaccacat caccaagaag 1080

gatatctacc aattcattgc cgtcctgcag aagatcgcta ttgctcaggg tgttaacatg 1140

accatctcca cctccactaa gtccatcact ggtaagttca ccgacgattt cttccaccac 1200

ttcaccgaag aggttgaagc cttgcaacct atcttcgctc agactactgt tctggccttc 1260

atcacttcta cccacctgtc caacaagaaa accaggtcct accaattgct gaagcagtac 1320

tttggtggta agtgggacat tgcttcccag gttatcaccg aaaagactat cgaggccttc 1380

caaaagatcc tgcacaagca cggtctgaag aacttttacc caaacgacga gcagcactgc 1440

ttgagagtta ttgacgtctt gaagaacgag tccttctact acaccgtcat gaacatcctg 1500

ctgggtgttt acgttaagtc cggtattcag ccatggatct tggctaacac tactcactcc 1560

gactgcttca tcggtattga cgtttctcac gagaacggta actctgctgc tggtatgatg 1620

aacgttattg gttcccaggg tcacttgatc caacaggctc cattgaacgg tattttggcc 1680

ggtgaaaaga tcgacgacac cttgttggcc aatctgttga agcagatgat caaggcctac 1740

cacactcagt tccagagatt cccaaagcac atcactatcc accgtgacgg tttttggaga 1800

gaacacactg ctttggtcga gaagatcatg tctcactacg agatcaccta cgacatcgtc 1860

gagatcatca aaaagccaaa cagaaggatg gccttcttca actccgttga caacactttc 1920

tccaccagac agggtactgt ttaccagaga ggtaacgagg ctttcctgtg tgctacaaac 1980

ccacagcaaa aggttggtat ggctcagcca atcaagattc accaggttac caagaccttg 2040

ccattctctc acattatcga ggacgtgtac aacctgtcct tcttgcacat tcacgccatg 2100

aacaagatga gattgccagc cactattcac tacgctgact tgtctgctac tgcttaccaa 2160

cgtggtcagg ttatgcctag atctggtaac cagaccaacc tgccattcgt ttaa 2214

Claims

1.一种原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，所述Argonaute蛋白来源于中温原核生物kurthiamassiliensis，所述Argonaute蛋白简称pAgo，所述Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为9至50个核苷酸。

2.如权利要求1所述的原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为12至30个核苷酸。

3.如权利要求1所述的原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为15至20个核苷。

4.如权利要求3所述的原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，所述pAgo复合物的ssDNA向导的长度为16、18或20个核苷酸。

5.如权利要求1所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo在10至80℃具有核酸酶活性。

6.如权利要求5所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo在37℃下具有核酸酶活性。

7.如权利要求1-6任一项所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo以及pAgo复合物的靶RNA没有高级结构；或，有高级结构；或，为双链RNA；或，为体外转录的RNA；或，为病毒基因组RNA；或，为信使RNA；或，为细胞内的其他RNA。

8.如权利要求7所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo以及pAgo复合物的向导是5’末端磷酸化的ssDNA；或，5’末端羟基化的ssDNA；或，5’末端磷酸化的RNA。

9.如权利要求8所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo以及pAgo复合物的核酸酶活性需要存在至少一种阳离子选自Mn2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Fe2+，Co2+，Zn2+和Ni2+组成的组。

10.如权利要求9所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo以及pAgo复合物的pAgo是提取的；或，是合成的。

11.如权利要求10所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物，其特征在于，pAgo靶DNA是ssDNA或双链DNA中的一种。

12.一种编码如权利要求11所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物的多核苷酸。

13.一种基于如权利要求4所述原核生物来源的Argonaute蛋白形成的pAgo复合物的体外切割RNA的方法，其特征在于，所述体外切割RNA的方法包括：

步骤一，基于pAgo和ssDNA向导形成pAgo-向导复合物；

14.一种包含如权利要求12所述多核苷酸的表达载体。

15.一种包含如权利要求14所述表达载体的病毒载体。

16.如权利要求14所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

17.一种包含如权利要求9所述pAgo复合物的试剂盒。