CN108796036B - 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 - Google Patents

基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含向导ssDNAs，基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)和荧光报告核酸。本发明的核酸检测方法灵敏度高、特异性好、通量高，可广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。

Description

基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。
背景技术
核酸检测技术广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。快速、廉价和灵敏的核酸检测可广泛应用于病原体检测、基因分型、病程监测等方面。
一些传统的核酸检测方法(qPCR、测序、核酸印记等)虽然已经有广泛应用，然而，仍存在一些缺点。例如qPCR和高通量测序等存在耗时长，费用高，设计原理复杂等缺点。此外，对于数量极其微少的待检测核酸，本领域尚缺乏令人满意的检测方法。
目前，利用基因编辑酶作为核酸检测的方法有利用C2C2酶介导的旁系剪切效应对目标RNA进行检测。但是尚缺乏对目标DNA(尤其是微量DNA)进行快速、有效检测的方法。
因此，本领域迫切需要开发针对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种基于对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：
(a)向导ssDNA对；
(b)基因编辑酶Pyrococcus furiosus(PfAgo)；和
(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。
在另一优选例中，所述的向导ssDNA对包括有义链向导ssDNA和反义链向导ssDNA。
在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子。
在另一优选例中，所述的向导ssDNA的长度为n个碱基，且n≥14。
在另一优选例中，所述的n≤100，较佳地≤80，更佳地≤60。
在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt，较佳地16-40nt。
在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的数量为一对或多对。
在另一优选例中，所述PfAgo酶来源于古菌Pyrococcus furiosus。
在另一优选例中，所述的PfAgo包括野生型和突变型的PfAgo。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。
在另一优选例中，所述的检测体系还包括用于对靶标核酸分子进行扩增的引物。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子(或其扩增产物)被所述PfAgo酶切割后，产生次级向导ssDNA。
在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列是互补的。
在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列互补结合后，引导所述PfAgo酶对所述荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号(如荧光)。
在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-1000拷贝/微升或103-1010拷贝/微升，较佳地100-1000拷贝/微升，更佳地1-100拷贝/微升。
在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1fM-200pM，较佳地1-1000fM，更佳地1-100fM，最佳地1-20fM。
在另一优选例中，所述基因编辑酶的工作温度为87-99℃。
在另一优选例中，所述的检测体系中，所述荧光报告核酸的浓度为100-1000nM。
在另一优选例中，所述的检测体系中，所述荧光报告核酸与所述靶标核酸分子的摩尔比为103：1至108：1，较佳地104：1至107：1。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA(包括cDNA)、双链DNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告核酸的5’端、3’端。
在另一优选例中，所述的荧光报告核酸的长度为9-100nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)本发明第一方面所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和
(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标核酸分子的方法。
在另一优选例中，所述试剂盒还可以包括缓冲液。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导ssDNA；
(b)第二容器以及位于第二容器的酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)；和
(c)第三容器以及位于第三容器的荧光报告核酸。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
(d)第四容器以及位于第四容器的用于酶进行酶切的缓冲液。
在另一优选例中，所述的用于酶进行酶切的缓冲液含有MnCl2。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第五容器以及位于第五容器的用于扩增靶标核酸分子的引物或引物对；
(g)任选的第六容器以及位于第六容器的用于扩增反应的聚合酶；和
(h)任选的第七容器以及位于第七容器的用于扩增反应的扩增缓冲液。
在本发明的第三方面，提供了一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：
(a)提供本发明第一方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；和
(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；
(c)对所述第一反应溶液进行荧光检测，从而获得荧光信号值；
其中，所述第一反应溶液中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。
在另一优选例中，所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。
在另一优选例中，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增和滚环扩增。
在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、低温PCR。
在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺失、和/或插入。
在另一优选例中，在步骤(b)中所述荧光检测采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。
在本发明的第四方面，提供了一种核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述酶Pyrococcus furiosus Argonaute来源于古菌Pyrococcus furiosus；或是其具备相同或相似功能的同源类似物。
在另一优选例中，所述的PfAgo包括野生型和突变型的PfAgo。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明基因编码酶的第一次切割示意图，其中针对同一条DNA链设计一对向导ssDNAs，其对应的剪切位点由黑色箭头标出，pfAgo酶作用后形成一个平末端。
图2显示了本发明基因编码酶的第二次切割示意图，其中由初级向导ssDNAs引导的特异性切割产生了次级向导ssDNAs。
图3显示了本发明检测方法的步骤和原理。
图4显示了核酸检测体系的特异性及灵敏度。
图5显示了本发明一个实施例中的核酸检测体系的多重性实验结果。其中
图5A采用CON1-1b-FAM报告核酸分子(无模板)；
图5B采用CON1-1b-FAM报告核酸分子(CON1-1b模板)；
图5C采用CON1-1b-FAM报告核酸分子(JFH-1 2a模板)；
图5D采用JFH-1 2a-VIC报告核酸分子(无模板)；
图5E采用JFH-1 2a-VIC报告核酸分子(JFH-1 2a模板)；
图5F采用JFH-1 2a-VIC报告核酸分子(CON1-1b模板)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种针对目标DNA的检测限低、灵敏度高、操作简便、检测成本低、耗时短、通量高的核酸检测方法。本发明方法利用PfAgo酶的特性，即在首次由初级向导ssDNA(guide ssDNA)介导剪切后，在合适的反应温度(如约90-98度)下，断裂的5’核酸片段可再次被PfAgo酶利用去剪切与之互补的荧光报告核酸链。结果表明，本发明方法不仅可以对痕量核酸分子进行快速地而高通量地检测，而且可以准确地给出检测结果，从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明检测体系”、“基于Argonaute蛋白的核酸检测体系”可互换使用，指本发明第一方面中所述的检测体系。
如本文所用，术语“本发明检测方法”、“基于Argonaute蛋白的核酸检测方法”可互换使用，指本发明第二方面中所述的检测方法。
如本文所用，术语“基因编辑酶Pyrococcus furiosus”、“核酸酶Pyrococcusfuriosus”、“PfAgo酶”可互换使用，指本发明第一方面中所述的酶。
如本文所用，术语“二次切割”指在本发明检测方法中，在初级向导ssDNAs存在下，本发明Ago酶对目标核酸序列进行剪切，形成新的5’磷酸化的核酸序列(次级向导ssDNAs)；然后，次级向导ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切。这种先针对目标核酸序列进行特异性切割(第一次切割)，后对荧光报告核酸进行特异性切割(第二次切割)，被定义为“二次切割”。在本发明中，第一次切割和第二次切割都是特异性切割。
Ago酶
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是基因编辑酶，例如Ago酶。
在本发明中，优选的Ago酶是PfAgo酶，其来自于古菌Pyrococcus furiosus，基因长度2313bp，氨基酸序列由770个氨基酸组成。
PfAgo酶的酶切特性为：该酶可利用5’磷酸化的寡聚核苷酸作为向导ssDNA指导该酶对目标核酸序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssDNA的第10与11位核苷酸对应的目标核酸(ssDNA)之间的磷酸二酯键。
通常，PfAgo酶的优选工作温度为95±2度。
向导ssDNA对
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是向导ssDNA对。
在本发明中，优选的向导ssDNAs均为长度为14-24nt(如16nt)的寡聚核苷酸，其5’第一个核苷酸均为磷酸化修饰的胸腺嘧啶(T)。
如图1所示，针对同一条DNA链的一对向导ssDNAs结合于靶标核酸分子，其对应的剪切位点由黑色箭头标出，pfAgo酶作用后形成一个平末端。
报告核酸分子
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是携带报告分子的报告核酸。
优选的报告分子是荧光分子或荧光基团。一种优选的报告核酸分子是分别携带荧光基团和淬灭基团的核酸分子。例如，在5’端标记荧光基团(F)，3’端标记淬灭基团(Q)。图2中示出了一个荧光报告核酸，其长度为17nt，5’端标记荧光基团(F)，3’端标记淬灭基团(Q)。
在本发明中，荧光报告核酸是根据次级向导ssDNAs的产生位置所决定的；由初级向导ssDNAs对目标核酸序列进行剪切，形成新的5’磷酸化的核酸序列，称之为次级向导ssDNAs，荧光报告核酸覆盖次级向导ssDNAs的相应位置(例如1-16位碱基)。
检测体系
本发明提供了用于检测靶标核酸分子的检测体系，它包括：
(a)向导ssDNA对；
(b)基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)；和
(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。
检测方法
在本发明还提供了基于基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)的核酸检测方法。
为了便于理解，本发明人提供了本发明检测方法的原理。应理解，本发明的保护范围并不受所述原理的限制。
参见图2和图3。在本发明方法中，基于PfAgo酶的剪切活性，可根据目标核酸序列的不同设计出一系列向导ssDNAs,这些向导ssDNAs靶向于待检测核酸并介导PfAgo酶对目的片段进行剪切以形成新的次级向导ssDNA。次级向导ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切，从而达到对目标核酸的检测。
在本发明中，根据向导ssDNAs的设计要求，可通过特殊设计使PfAgo酶可以选择性地对存在部分位点存在差异的核酸序列进行选择性剪切，从而实现分型检测。
在本发明中，当用于区分不同分型，在向导ssDNAs设计时，将不同分型对应的突变位点置于向导ssDNAs的第10、11两位，由于pfAgo酶的选择特异性，连续两点突变时可抑制剪切活性，从而达到了对不同分型的检测。
在优选例中，本发明中提供了用于核酸检测的引物、向导ssDNAs及荧光报告核酸，例如，分别用于检测目标基因PIK3CA E545K、或用于检测HCV病毒的两种分型JFH-1 2a和CON1-1b。
在本发明中，可以在PfAgo酶的剪切体系中同时加入多种目标待检核酸和向导ssDNAs，结合带有不同荧光基团的报告核酸，能达到对目的核酸的多重检测。
本发明方法非常适合用于检测痕量核酸。通过结合PCR以及具有特定序列的向导ssDNA对，本发明可以检测低至fM浓度的靶核酸。
在一个优选例中，本发明检测方法包括如下步骤：
步骤1：针对不同的目标待检核酸序列设计扩增引物、特异性的寡核苷酸向导ssDNAs和荧光报告核酸；
步骤2：采集待检样本，提取含目标序列的核酸复合物；
步骤3：将获取的待检样本作为模板加入不同扩增引物对进行预扩增反应；
步骤4：在步骤3预扩增反应体系中加入特异性的寡核苷酸向导ssDNAs、与之相应的荧光报告核酸及PfAgo酶在95度持续保温的条件下进行特异性剪切；
步骤5：对步骤4的体系进行quantitativereal-timePCR定量分析；
步骤6：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
在本发明中，所用于扩增反应的扩增引物，其Tm值通常60±3度左右，扩增片段大小约为90-120bp。优选地，扩增引物设计时应避开待检测区段。
试剂盒
本发明还提供了用于一种用于本发明检测方法的试剂盒。
典型地，所述的试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导ssDNA；
(b)第二容器以及位于第二容器的基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)；和
(c)第三容器以及位于第三容器的荧光报告核酸。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
(d)第四容器以及位于第四容器的用于基因编辑酶进行酶切的缓冲液。
在另一优选例中，所述的用于基因编辑酶进行酶切的缓冲液含有MnCl2。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第五容器以及位于第五容器的用于扩增靶标核酸分子的引物或引物对；
(g)任选的第六容器以及位于第六容器的用于扩增反应的聚合酶；和
(h)任选的第七容器以及位于第七容器的用于扩增反应的扩增缓冲液。
应用
本发明特别适合检测微量靶标核酸分子，以及多重检测，具有广泛的应用性。
在本发明中，靶标核酸分子可以是DNA，也可以是RNA。当靶标核酸分子是RNA时，可通过逆转录转变为DNA再进行检测。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。
本发明在疾病监控方面，可对疾病做到预测、预防等积极主动管理，做到早期发现早期治疗，或提早预测提早预防。由于本发明的检测灵敏度非常高，适合进行早期诊断，对症下药，节省患者治疗时间，提高治疗成功率。本发明减少高额医疗成本浪费，和争取治疗黄金时机。
在环境监控方面，本发明可便捷、快速的对环境污染物中的核酸分子进行准确鉴定，提供有效的环境检测数据。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的基于基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)的核酸检测方法充分发挥了该酶的特性剪切特性，使之成为一种特异性高的检测手段；
2)本发明所述的反应体系中可同时加入多种待检测的目标核酸以及对应的初级向导ssDNAs和荧光报告核酸，实现单管多重检测；
3)本发明所述的核酸检测方法具有较高的灵敏度，对核酸的检测限为aM-fM级别；
4)本发明所述的核酸检测方法具有很好的特异性，能够区分不同分型的核酸序列；
5)本发明所述的核酸检测方法操作便捷，设计简单，价格低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列信息
实施例中涉及3组目标基因富集及扩增寡核酸序列如下表所示。
Figure GDA0003203458860000101
Figure GDA0003203458860000102
Figure GDA0003203458860000111
实施例1
检测试剂的制备和检测方法
在本实施例中，提供了用于本发明基于基因编辑酶Pyrococcus furiosusArgonaute(PfAgo)的核酸检测方法的试剂盒及其使用方法。
1.1检测试剂和试剂盒
在本实施例中，以检测PIK3CA基因的E545K突变为例子，相应的特异性目标核酸序列为5’-CTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGGATCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCTGTTCTTTGTCATTTTCCCT-3’，SEQ ID No.：1。
基于本发明方法，相应的检测试剂包括以下：
(1)、扩增引物F-primer和R-primer，具体序列如下：
F-primer：5’-CTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCC-3’(SEQ ID No.2)
R-primer：5’-AGGGAAAATGACAAAGAACAGCTC-3’(SEQ ID No.3)
(2)、特异性向导ssDNAs对，包括有义链向导ssDNA和无义链向导ssDNA,具体序列如下：
有义链向导ssDNA:5’P-TTCTCCTGCTCAGTGA-3’(SEQ ID No.4)
无义链向导ssDNA:5’P-TGAAATCACTGAGCAG-3’(SEQ ID No.5)
(3)、与次级向导ssDNA相应的荧光报告核酸，具体序列如下：
荧光报告核酸：5’FAM(荧光基团)-CTCGTCCTCTTTCTAAA-BHQ1(淬灭基团)3’(SEQID No.6)。
(4)、扩增反应酶制剂：例如AceQ qPCR Probe Master Mix(Vazyme)。
(5)、MnCl2溶液：10mM MnCl2溶液
1.2检测方法
本发明的基于基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)的核酸检测方法的示意图如图3所示，具体操作步骤如下：
(1)、所述的扩增引物F-primer和R-primer干粉用超纯水溶解制成10uM的储存液；所述的有义链向导ssDNA和无义链向导ssDNA干粉用超纯水溶解制成100uM的储存液；所述的荧光报告核酸干粉用超纯水溶解制成10uM的储存液；
(2)、用AceQ qPCR Probe Master Mix(2X)酶制剂与超纯水、扩增引物制成扩增反应预混液(扩增引物终浓度为500nM)；
(3)、将待检测样品加入扩增反应预混液，反应体系为20uL；
(4)、将扩增体系放入PCR仪中进行扩增反应(95度预变性5min，95度变性15sec，60度延伸15sec，30个循环)；
(5)、扩增反应结束后，向步骤(4)中加入PfAgo酶、MnCl2、有义链向导ssDNA和无义链向导ssDNA、荧光报告核酸，使之成为25uL反应体系(PfAgo酶终浓度为200nM,MnCl2终浓度为500uM,向导ssDNAs终浓度为2uM,荧光报告核酸终浓度为400nM)；
(6)、将步骤(5)中的反应体系放置在荧光定量PCR仪上进行检测(95度保温30分钟，每分钟检测一次荧光信号)。
实施例2
针对不同浓度的待检核酸进行检测
按10倍稀释法的原则对特异性目标核酸(SEQ ID NO.：1)进行稀释，分别稀释成200pM、20pM、2pM、200fM、20fM、2fM和0fM的标准母液。将不同浓度的核酸标准母液分别加入到实施例1所述的反应体系中，按步骤进行加样反应，并通过荧光定量PCR检测对应荧光基团波长处的荧光信号值。
结果如图4A-4H所示。其中，图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G中的目标核酸的浓度分别为0fM、2fM、20fM、200fM、2pM、20pM、200pM，图4H为非目标核酸(体系中加入20ng)。
非目标核酸为抽提自正常人血清的总DNA。结果表明，即使在体系中加入20ng的无关的非目标核酸，仍不会产生阳性结果。
结果表明，本发明的方法可最低检测至fM级别的目标核酸分子。另外，对于非目标核酸，即使加入检测体系的成分，也不会产生阳性信号，因此本发明方法的特异性非常高。
实施例3.
特异性试验及多重检测
配置浓度为200pM的不同类型目标核酸溶液，分别为HCV病毒的两种分型JFH-1 2a和CON1-1b。
需要说明的是，这两种分型的区别仅在于：序列上存在连续两点差异。
配置多重混合检测体系：将2对特异性扩增引物同时加入到检测扩增体系中，将目标检测核酸按如下4组加入到检测扩增体系中：(1)空白对照；(2)JFH-12a；(3)CON1-1b；(4)JFH-1 2a和CON1-1b。(图5中分别验证了荧光报告核酸的特异性，在一个反应体系中互相不影响)
扩增反应结束后将PfAgo酶,MnCl2,2组特异性的ssDNAs,2对带有不同荧光基团的荧光报告核酸(JFH-1 2a型对应VIC荧光，CON1-1b型对应FAM荧光)加入到同一反应管中，按实施例1中的反应步骤进行检测。
结果如图5A-5F所示。结果表明：当检测目标核酸为空白对照时，无荧光信号值产生；当检测目标核酸为JFH-1 2a时，只有VIC荧光产生；当检测目标核酸为CON1-1b时，只有FAM荧光产生；当检测目标核酸为JFH-1 2a和CON1-1b时，FAM和VIC两种荧光同时产生。由此说明本发明核酸检测方法可用于单管的多重检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
<130> P2018-0430
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtgactcc atagaaaatc tttctcctgc tcagtgattt cagagagagg atctcgtgta 60
gaaattgctt tgagctgttc tttgtcattt tccct 95
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtgactcc atagaaaatc tttctcc 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agggaaaatg acaaagaaca gctc 24
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctcctgct cagtga 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaaatcact gagcag 16
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgtcctct ttctaaa 17
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggtgagta caccggaatt gc 22
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagtcttgc gggggc 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcccaaatc tccagg 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatgcctgga gatttg 16
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtctcgcgg gggcacgccc aaatctccag 30
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccggtgagta caccggaatt gc 22
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcagtcttgc gggggc 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcccaaatg gccggg 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tatgcccggc catttg 16
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggataaacc cactgtatgc ccggccattt 30

Claims (8)

1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：
(a) 向导ssDNA对，所述的向导ssDNA对包括有义链向导ssDNA和反义链向导ssDNA，所述的向导ssDNA的长度为14-60nt，并且所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子；
(b) 基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute；和
(c) 荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA；
所述的靶标核酸分子被所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶切割后，产生次级向导ssDNA；所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列是互补的；所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列互补结合后，引导所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶对所述荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导ssDNAs的长度为16-40nt。
3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。
4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。
5.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i) 权利要求1所述的检测体系；和
(ii) 使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标核酸分子的方法。
6.一种非诊断性和非治疗性的检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 提供权利要求1所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；
(b) 将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；和
(c) 对所述第一反应溶液进行荧光检测，从而获得荧光信号值；
其中，所述第一反应溶液中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子；
所述温度为87-99℃。
7.一种核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂；
所述二次切割指在向导 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute对靶标核酸分子进行剪切，形成次级向导 ssDNA，次级向导 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引导Pyrococcus furiosus Argonaute对与次级向导 ssDNA互补的荧光报告核酸进行剪切。
8.一种核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂盒；
所述二次切割指在向导 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute对靶标核酸分子进行剪切，形成次级向导 ssDNA，次级向导 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引导Pyrococcus furiosus Argonaute对与次级向导 ssDNA互补的荧光报告核酸进行剪切。
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