CN110331202A - 一种用于检测brac1基因snp的试剂盒与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法，所述试剂盒包括(1)SNP位点的上下游引物组：分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；(2)DNA guides：分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；(3)不同荧光基团标记的分子信标：如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；(4)DNA编辑酶PfAgo；该方法特异性强，灵敏度高。

Description

一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种用于检测BRAC1基因 SNP的试剂盒与方法。
背景技术
1990年，研究者发现了一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，命名为乳腺癌1号基因，英文简称BRCA1。1994年，又发现另外一种与乳腺癌有关的基因，称为BRCA2。实际上，BRCA1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病人的两侧乳房都确癌，且同时患有卵巢癌。研究表明BRCA1基因上具有单核苷酸多态性SNP位点，而BRCA1基因的多态性会影响卵巢癌等肿瘤疾病的易感性。
SNP(Single nucleotide polymorphism)即单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的80％以上。在遗传学分析中，SNP作为一类遗传标记得到广泛应用，主要是因为SNP具有密度高、富有代表性、遗传稳定性和易实现自动化分析等特点。SNP作为第三代遗传标记已经广泛应用于基因作图、疾病相关性分析、群体遗传学及药物研究等领域，人类许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。
目前对已知SNP检测的方法主要有双向等位特异法、基因芯片法、荧光定量PCR技术等。(1)双向等位特异法(Bi-PASA)，该方法是在等位特异PCR 法的基础上发展而来，通过设计引物的3’端与一条待测等位基因的序列互补而与另一条不互补来区分SNP，虽然操作简单成本低，但是对引物设计要求高难以实现高通量检测。(2)基因芯片法是一种高通量SNP分析法，根据核苷酸的碱基配对原则设计探针使其只与完全互补的序列杂交而不与含有单个碱基错配的序列杂交，但这种方法对样品质量要求高，芯片设计制造昂贵。(3)荧光定量PCR技术(TaqMan技术)TaqMan探针基于杂交原理，是按常规方式进行体外基因扩增，在反应体系中加入针对位点及侧翼序列设计的探针，该探针只有一个碱基的差异，分别对应于不同的等位基因，并用荧光标记探针。该方法优点在于反应在过程中进行，无需分离或洗脱过程，从而减少了污染的可能性：扩增产物分析简便、快捷、准确、无需电泳，提高了实验速度，缺点是所设计的探针仅有一个碱基的差异，检测结果存在假阳性。
一个理想的检测SNP的方法应该具备以下优点：①操作简便、迅速；②分析费用低，特殊试剂用量少；③即使不纯的样品也可得到可靠的结果；④数据分析简单。目前报道的SNP检测方法中，尽管有些方法成本低，但速度慢，操作复杂对样品质量要求高；有些方法可自动化高通量分析，但制备探针成本高，准确性低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法，该方法操作简单，成本低，准确性高以及灵敏度高的SNP检测方法。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，所述试剂盒包括SNP位点的上下游引物组；DNA guides、不同荧光基团标记的分子信标、以及DNA编辑酶PfAgo；
所述SNP位点的上下游引物组包括以下A、B中至少一个：
A、rs12516位点的上、下游引物组：rs12516位点的上、下游引物分别如 SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示；
B、rs16941位点的上、下游引物组：rs16941位点的上、下游引物分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示；
所述DNA guides包括以下C、D中至少一个：
C、针对rs12516位点的3条DNA guides包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、 SEQ IDNO.9所示的序列；
D、针对rs16941位点的3条DNA guides包括如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQID NO.12所示的序列；
所述不同荧光基团标记的分子信标包括以下E、F中至少一个：
E、针对rs12516位点T/C的分子信标分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14 所示；
F、针对rs16941位点A/G的分子信标分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16 所示；
其中，所述针对rs12516位点、rs16941位点的分子信标的5’端均标记有荧光基团和3’端均标记有猝灭基团。
本发明的目的之二在于提供一种用于检测BRAC1基因SNP的方法，包括如下步骤：
步骤1、准备含有不同HPV亚型的待检测离体样品并提取核酸得到待测样品模板；
步骤2、采用所述SNP位点的上下游引物组对步骤1所得的待测样品模板进行PCR得到PCR扩增产物；
步骤3、将所述的DNA guides、不同分子信标、DNA编辑酶PfAgo与步骤 2所得的PCR扩增产物混合，进行酶切反应；
步骤4、将上述反应产物用荧光光度计测得不同荧光基团得发光情况，从而判断待检测样品中BRAC1基因SNP的碱基组成，从而实现SNP检测。
本发明具有的有益效果是：
本发明提供用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法，首先通过普通引物PCR扩增得到包含SNP位点的DNA产物，根据待检测样品的特点该产物可能是含有一种碱基类型(如rs12516T/T或者rs12516C/C)，也可能是含有两种及以上碱基类型(如rs2516T/C)。通过PfAgo的单碱基专一性和切割DNA 的特点，设计两条及以上分别与两种及以上碱基类型完全匹配的分子信标，然后利用磷酸化处理的单链DNA guides介导PfAgo酶切，若PCR产物中只有一种碱基则会出现只有一条分子信标的荧光值大于空白对照(不加待检测物)，若 PCR产物中有两种碱基则会出现两条分子信标的荧光值均大于空白对照(不加待检测物)。该方法具有特异性强，灵敏度高(本发明的检测方法最低可以检测到0.1％的碱基类型)，对原始材料要求低，操作简单、快速、准确等特点。
附图说明
图1是本发明实施例所采用检测的BRAC1基因上两个SNP位点在人类染色体上的分布图；
图2是本发明实施例2提供的对PfAgo单碱基专一性的检测示意图；(A) 图为序列结果和(B)图为位点结果；
图3是本发明提供的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法对SNP分型检测的原理示意图；
图4是本发明实施例1提供的分别对(A)rs12516和(B)rs16941的PCR 产物的电泳检测结果；其中(A)图是对rs12516的扩增结果；(B)图是对rs16941 的扩增结果；(A)图和(B)图中泳道1-7是分别对7组临床血清样品直接扩增得到的扩增产物；
图5是本发明实施例2提供的阳性对照标准品的检测结果图(A)为对 rs12516(T>C)的检测结果图，(B)为对rs16941(A>G)的检测结果图；
图6是本发明实施例3提供的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法对SNP灵敏度的检测结果；(A)和(B)图所使用样品为高rs12516(T)背景下不同含量的rs12516(C)，其含量分别为0，0.1％，1％和10％；其中(A) 图为对阳性标准品rs12516(T)的检测结果；(B)图为对阳性标准品rs12516 (C)的检测结果；(C)和(D)图所使用样品为高rs16941(A)背景下不同含量的rs16941(G)，其含量分别为0，0.1％，1％和10％；(C)图为对阳性标准品rs16941(A)的检测结果；(D)图为对阳性标准品rs16941(G)的检测结果；
图7是本发明实施例4提供的临床样品(血清)的检测结果；其中图(A) 为对rs12516(T>C)的检测结果图，(B)为对rs16941(A>G)的检测结果图。
具体实施方式
实施例1用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法
本发明提供的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒包括三种：
一、针对rs12516位点(T/C)的SNP检测试剂盒
1、针对rs12516位点(T/C)的SNP检测试剂盒包括：
(1)rs12516位点的上、下游引物组：分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 所示；以及PCR扩增所需的其他常规溶液比如2×Taq-Mix或者为表1中的2× Phanta Blood BufferV2、Phanta Blood Super-Fidelity DNA polimerase、dNTPs；
(2)rs12516位点的3条DNA guides：gf(rs12516位点)如SEQ ID NO.7、 gr(rs12516位点)如SEQ ID NO.8、gt(rs12516位点)如SEQ ID NO.9所示；
使用前需要用5’磷酸基团修饰所述3条DNA guides：
由于PfAgo蛋白是由5’磷酸基团修饰的DNA guide引导切割靶DNA，本发明所述实施例中所有的DNA guides均用T4多核苷酸激酶处理使其5’端带上磷酸基团，T4多核苷酸激酶反应体系为：
表1-ssDNA磷酸化修饰反应体系配置
(3)rs12516位点T/C的分子信标包括：分子信标MB-rs12516(T)如SEQ ID NO.13、分子信标MB-rs12516(C)如SEQ ID NO.14所示；并用荧光基团进行修饰，本实施例中筛选得到的特异性分子信标序列及修饰基团为：
MB-rs12516T：5’-6-FAM-CGCACCcccccTagtgtgcaagggcGGTGCG-BHQ1-3’
MB-rs12516C：5’-6-FAM-CGCACCcccccCagtgtgcaagggcGGTGCG-BHQ1-3’
所述荧光基团在特定激发波长和发射波长分别为，FAM：496nm；BHQ1： 518nm。需要说明的是，这里虽选用FAM、BHQ1；但荧光基团是可进行调整的。
(4)以及DNA编辑酶PfAgo。
2、所述试剂盒的使用方法：
步骤1、选择临床血清样品直接作为模板，采用所述rs12516位点的上、下游引物组对所述模板进行PCR扩增，得到PCR产物；
采用所述rs12516位点的上、下游引物组利用诺唯赞Blood Direct PCR Kit V2(PD103-02)试剂盒对血清样品直接进行扩增得到包括待检测位点的DNA片段，具体操作详见说明书。所述PCR扩增的反应体系(以50ul/反应为例)为：
表2-PCR体系配置
PCR扩增程序为：95℃，5min预变性；95℃，15S变性，56～72℃，15S 退火，72℃，30S延伸；35个循环；72℃，5min。
对经PCR扩增后得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，泳道1-7是分别对7组临床血清样品直接扩增得到的扩增产物；其中(A)是对 rs12516位点的扩增结果。
步骤2、将步骤1所得PCR产物分成两组进行酶切反应：
(1)含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系：将上述rs12516位点的 3条DNAguides和分子信标MB-rs12516(T)与步骤1所得PCR产物混合，加入所述DNA编辑酶PfAgo，进行酶切反应；所述反应体系为：
表3-PfAgo酶切体系
反应条件为95℃，30min-1h。
(2)含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系：将上述rs12516位点的 3条DNAguides和分子信标MB-rs12516(C)与步骤1所得PCR产物混合，加入所述DNA编辑酶PfAgo，进行酶切反应，反应体系同上；
相应地，上述两个反应体系分别设置一组空白对照组：除不加待检测物(即不加步骤1所得PCR产物，或将步骤1所得PCR产物替换为DEPC处理的水)，其他成分及含量分别与上述两个反应体系相同。
步骤3、用荧光光度计测得荧光值然后减去空白对照的荧光值得到去除背景的相对荧光值；检测各两种不同碱基的分子信标分别在激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照(不加靶DNA)的荧光值后得到待测样品的相对荧光值的结果；本试剂盒的结果判读方法如下：
(1)若对含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值，而在对含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系中测得的荧光值小于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为T/T；
(2)若对含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系中测得的荧光值小于其空白对照的荧光值，而在对含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为C/C；
(3)若对含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值，并且在对含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系中测得的荧光值也大于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为T/C。
二、针对rs16941位点(A/G)的SNP检测试剂盒
1、针对rs16941位点(A/G)的SNP检测试剂盒包括：
(1)rs16941位点的上、下游引物组：分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4 所示；以及PCR扩增所需的其他常规溶液同上；
(2)rs16941位点的3条DNA guides：gf(rs16941位点)如SEQ ID NO.10、 gr(rs16941位点)如SEQ ID NO.8、gt(rs16941位点)如SEQ ID NO.9所示；
使用前需要用T4多核苷酸激酶处理使所述3条DNA guides5’端带上磷酸基团，T4多核苷酸激酶反应体系如表1所示。
(3)rs16941位点A/G的分子信标包括：分子信标MB-rs16941(A)如SEQ ID NO.13，分子信标MB-rs16941(G)如SEQ ID NO.14所示；并用荧光基团进行修饰，本实施例中筛选得到的特异性分子信标序列及修饰基团为：
MB-rs16941G：5’-6-FAM-CGCACCtaaagGagccagctcaagcGGTGCG-BHQ1-3’
MB-rs16941A：5’-6-FAM-CGCACCtaaagAagccagctcaagcGGTGCG-BHQ1-3’
(4)以及DNA编辑酶PfAgo。
2、所述试剂盒的使用方法为：
步骤1、选择临床血清样品直接作为模板，采用所述rs16941位点的上下游引物组对所述模板进行PCR扩增得到PCR产物；所述PCR扩增的反应体系(以 50ul/反应为例)同上述表2。PCR扩增程序同上。
对经PCR扩增后得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，泳道1-7是分别对7组临床血清样品直接扩增得到的扩增产物；其中(B)是对 rs16941位点的扩增结果。
步骤2、将步骤1所得PCR产物分成两组进行酶切反应，具体为：
(1)含有分子信标MB-rs16941(A)的反应体系：将上述rs16941位点的 3条DNAguides与分子信标MB-rs16941(A)与步骤1所得PCR产物混合，加入所述DNA编辑酶PfAgo，进行酶切反应；所述反应体系同表3。
(2)含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系：将上述rs16941位点的 3条DNAguides与分子信标MB-rs16941(G)与步骤1所得PCR产物混合，加入所述DNA编辑酶PfAgo，进行酶切反应；反应体系同表3，反应条件同上。
相应地，上述两个反应体系分别设置一组空白对照组：除不加待检测物(即不加步骤1所得PCR产物，或将步骤1所得PCR产物替换为DEPC处理的水)，其他成分及含量分别与上述两个反应体系相同。
步骤3、用荧光光度计测得荧光值然后减去空白对照的荧光值得到去除背景的相对荧光值；检测各两种不同碱基的分子信标分别在激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照(不加靶DNA)的荧光值后得到待测样品的相对荧光值的结果；本试剂盒的结果判读方法如下：
(1)若对含有分子信标MB-rs16941(A)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值，而在对含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系中测得的荧光值小于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为A/A；
(2)若对含有分子信标MB-rs16941(A)的反应体系中测得的荧光值小于其空白对照的荧光值，而在对含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为G/G；
(3)若对含有分子信标MB-rs16941(A)的反应体系中测得的荧光值大于其空白对照的荧光值，并且在对含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系中测得的荧光值也大于其空白对照的荧光值则说明带该检测样品在rs12516位点的基因型为A/G。
三、同时针对rs12516位点(T/C)以及rs16941位点(A/G)的SNP检测试剂盒
1、所述同时针对rs12516位点(T/C)以及rs16941位点(A/G)的SNP检测试剂盒包括：
rs12516位点的上、下游引物组以及PCR扩增所需的常规溶液；针对rs12516 位点的3条DNA guides；针对rs12516位点T/C的分子信标；
rs16941位点的上、下游引物组以及PCR扩增所需的常规溶液；针对rs16941 位点的3条DNA guides；针对rs16941位点A/G的分子信标；
以及DNA编辑酶PfAgo；
2、该试剂盒的使用方法即将上述两种试剂盒联合起来使用即可。
(1)分别采用两个反应体系，反应体系A用所述rs12516位点的上、下游引物组对模板进行PCR扩增，反应体系B用所述rs1694位点的上下游引物组对模板进行PCR扩增；或者采用一个反应体系C，加所述rs12516位点的上、下游引物组、以及所述rs1694位点的上下游引物组同时对模板进行PCR扩增，得到PCR扩增混合物。
(2)反应体系A得到的PCR产物分成两份，分别进行酶切反应：含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系、含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系；
反应体系B得到的PCR产物分成两份，分别进行酶切反应：含有分子信标 MB-rs16941(A)的反应体系、含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系；
注意：若是采用一个反应体系C，即将反应体系C得到的PCR扩增混合物分成4份进行酶切反应：含有分子信标MB-rs12516(C)的反应体系、含有分子信标MB-rs12516(T)的反应体系、含有分子信标MB-rs16941(A)的反应体系、含有分子信标MB-rs16941(G)的反应体系；
若是采用一个反应体系C，且分子信标MB-rs12516(C)、分子信标 MB-rs12516(T)、含有分子信标MB-rs16941(A)、分子信标MB-rs16941(G) 所标记的荧光基团和猝灭基团的设置均不同(所述有机荧光染料为FAM、VIC、 HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。)的情况下(不同荧光基团在不同的激发光下有发射光谱)，即可将反应体系C得到的PCR扩增混合物加所述4个分子信标、所有的DNA guides、以及DNA编辑酶PfAgo进行一次酶切反应；判读时，首先通过不同荧光基团在相应的光谱下得发光情况区分待检测样品中rs16941位点和rs12516位点；再通过上述方法判断rs12516位点的基因型(T、或C或TC)以及rs16941位点的基因型(A或G 或AG)。
步骤3、用荧光光度计测得荧光值然后减去空白对照的荧光值得到去除背景的相对荧光值；判读方法同上。
实施例2PfAgo单碱基专一性分析
1、人工合成17条16nt的DNA guide(g1-g17)和分子信标MB-ssDNA1(简称g0)：5’-6-FAM-CGCACCatgatcaacacccactGGTGCG-BHQ1-3’(如SEQ ID NO.17所示)，其中g1为与MB-ssDNA1完全匹配的DNA guide，g2-g17为分别有一个碱基与MB-ssDNA1不匹配的DNAguides，具体如表4所示。
表4
序列(5’-3’) 序列(5’-3’)
g1 agtgggtgttgatcat(如SEQ ID NO.18所示) g10 agtgggtgAtgatcat(如SEQ ID NO.27所示)
g2 Tgtgggtgttgatcat(如SEQ ID NO.19所示) g11 agtgggtgtAgatcat(如SEQ ID NO.28所示)
g3 aCtgggtgttgatcat(如SEQ ID NO.20所示) g12 agtgggtgttCatcat(如SEQ ID NO.29所示)
g4 agAgggtgttgatcat(如SEQ ID NO.21所示) g13 agtgggtgttgTtcat(如SEQ ID NO.30所示)
g5 agtCggtgttgatcat(如SEQ ID NO.22所示) g14 agtgggtgttgaAcat(如SEQ ID NO.31所示)
g6 agtgCgtgttgatcat(如SEQ ID NO.23所示) g15 agtgggtgttgatGat(如SEQ ID NO.32所示)
g7 agtggCtgttgatcat(如SEQ ID NO.24所示) g16 agtgggtgttgatcTt(如SEQ ID NO.33所示)
g8 agtgggAgttgatcat(如SEQ ID NO.25所示) g17 agtgggtgttgatcaA(如SEQ ID NO.34所示)
g9 agtgggtCttgatcat(如SEQ ID NO.26所示) g0 (如SEQ ID NO.17所示)
2、将步骤1中合成的分子信标(MB-ssDNA1)以及PfAgo酶分别与步骤1 中合成的17条DNA guides孵育，95℃，30min；
3、将步骤2中的产物分别用荧光光度计测得荧光值，根据荧光值判断PFAgo 得是否有单碱基专一性，结果如图2所示，PfAgo蛋白酶在16nt得guide DNA 介导酶切下，在从5’第10-15碱基突变得情况下几乎没有切割分子信标，说明从5’第10-15碱基处具有较好得专一性。
4、根据步骤3得到的结论设计分别检测SNP rs12516(T>C)和rs16941(A>G) 的DNAguides和分子信标，使得SNP的碱基位点位于5’端第12位；即得到了本发明的DNA guides和分子信标：
针对rs12516位点：3条DNA guides包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、 SEQ IDNO.9所示的序列；rs12516位点T/C的分子信标分别如SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14所示；
针对rs16941位点：3条DNA guides包括如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、 SEQ IDNO.12所示的序列；rs16941位点A/G的分子信标分别如SEQ ID NO.15、 SEQ ID NO.16所示。
5、利用已知基因型的DNA片段验证步骤4设计得DNA guides和分子信标对相应SNP得区分效果，结果如图5所示，MB-rs12516(T)只有在rs12516(T) 存在时才有荧光信号(荧光值大于空白对照)，MB-rs12516(C)只有在rs12516 (C)存在时才有荧光信号(荧光值大于空白对照)；MB-rs16941(A)只有在 rs16941(A)存在时才有荧光信号(荧光值大于空白对照)，MB-rs16941(G) 只有在rs16941(G)存在时才有荧光信号(荧光值大于空白对照)。表明本发明设计的DNA guides和分子信标专一性好，SNP的区分效果好。
实施例3灵敏度分析
1、阳性标准品作为模板：合成分别包含rs12516(T)和rs12516(C)以及rs16941(A)和rs16941(G)的DNA作为阳性标准品；
2、不同梯度阳性标准品的获得
将rs12516(T)与rs12516(C)分别以100：0、99.9：0.1、99：1、95：5、 0：100的比例混合；
将rs16941(A)与rs16941(G)分别以100：0、99.9：0.1、99：1、95：5、 0：100的比例混合；
3、进行酶切反应，酶切反应体系如表3所示。
(1)利用实施例1所述的rs12516位点的3条DNA guides和PfAgo酶以及上述包含rs12516(T)的不同浓度组分的混合物分别与分子信标MB-rs12516(T) 反应后测荧光值；结果如图6中的(A)图所示；图中rs12516基因中T是野生型(WT)，C是突变型rs12516(T>C)；
(2)利用实施例1所述的rs12516位点的3条DNA guides和PfAgo酶以及上述包含rs12516(C)的不同浓度组分的混合物分别与分子信标MB-rs12516(C) 反应后测荧光值；结果如图6中的(B)图所示；图中rs12516基因中T是野生型(WT)，C是突变型rs12516(T>C)；
(3)利用实施例1所述的rs16941位点的3条DNA guides和PfAgo酶以及上述包含rs16941(A)的不同浓度组分的混合物分别与分子信标MB-rs16941 (A)、反应后测荧光值；结果如图6中的(C)图所示；图中rs16941基因中 A是野生型(WT)，G是突变型rs16941(A>G)；
(4)利用实施例1所述的rs16941位点的3条DNA guides和PfAgo酶以及上述包含rs16941(G)的不同浓度组分的混合物分别与分子信标MB-rs16941(G) 反应后测荧光值；结果如图6中的(D)图所示；图中rs16941基因中A是野生型(WT)，G是突变型rs16941(A>G)；
4、结果如图6所示，在99.9％的rs12516(T)背景下本发明方法可以成功检测到0.1％的rs12516(C)，同样的在99.9％的rs16941(A)背景下本发明方法可以成功检测到0.1％的rs16941(G)，因此本发明的检测方法的检测限低至 0.1％的SNP。
实施例4临床样本检测
1、临床样本(血清)DNA扩增
临床样品(血清)DNA扩增采用实施例1中的引物利用诺唯赞Blood Direct PCRKit V2(PD103-02)试剂盒对血清样品直接进行扩增得到包括待检测位点的DNA片段，具体操作详见说明书。
2、PCR扩增得到的产物与实施例1中的DNA guide和分子信标混合，并加入Pfago蛋白酶进行酶切反应。反应体系如表4所示。
3、荧光检测结果如图7所示，并通过测序验证检测结果，如表5所示；其中，两个SNP位点序列分别为：rs12516(T>C)(482bp)如SEQ ID NO.5所示；rs16941(A>G)(560bp)如SEQID NO.6所示。
表5
由表5可知，本实施例的检测结果与测序检测结果一致，说明本发明方法的可行性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒与方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaccaggaa ggaagctgtt gctttctttg 30
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagttgag ccacctcaga cttctgac 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagaggcaac gaaactggac tcattactcc 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgagatgc atgactactt cccataggc 29
<210> 5
<211> 482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> allele
<222> (181)..(181)
<223> n=t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (181)..(181)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 5
ccaccaggaa ggaagctgtt gctttctttg aggtgatttt tttcctttgc tccctgttgc 60
tgaaaccata cagcttcata aataattttg cttgctgaag gaagaaaaag tgtttttcat 120
aaacccatta tccaggactg tttatagctg ttggaaggac taggtcttcc ctagcccccc 180
nagtgtgcaa gggcagtgaa gacttgattg tacaaaatac gttttgtaaa tgttgtgctg 240
ttaacactgc aaataaactt ggtagcaaac acttccacca tgaatgactg ttcttgagac 300
ttaggccagc cgactttctc agagcctttt cactgtgctt cagtctccca ctctgtaaaa 360
tgggggtaat gatagtatct acctcctagg atttattgag gcagcttaaa taccttttgt 420
atttcctgtt gctgccaaaa caaattgttg caaggtcaga agtctgaggt ggctcaactg 480
tt 482
<210> 6
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> allele
<222> (240)..(240)
<223> n=a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (240)..(240)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 6
cagaggcaac gaaactggac tcattactcc aaataaacat ggacttttac aaaacccata 60
tcgtatacca ccactttttc ccatcaagtc atttgttaaa actaaatgta agaaaaatct 120
gctagaggaa aactttgagg aacattcaat gtcacctgaa agagaaatgg gaaatgagaa 180
cattccaagt acagtgagca caattagccg taataacatt agagaaaatg tttttaaagn 240
agccagctca agcaatatta atgaagtagg ttccagtact aatgaagtgg gctccagtat 300
taatgaaata ggttccagtg atgaaaacat tcaagcagaa ctaggtagaa acagagggcc 360
aaaattgaat gctatgctta gattaggggt tttgcaacct gaggtctata aacaaagtct 420
tcctggaagt aattgtaagc atcctgaaat aaaaaagcaa gaatatgaag aagtagttca 480
gactgttaat acagatttct ctccatatct gatttcagat aacttagaac agcctatggg 540
aagtagtcat gcatctcagg 560
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtgcaaggg cagtga 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcttcactg cccttg 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccctagccc ccctag 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccagctcaa gcaata 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttaatattgc ttgagc 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaatgttttt aaagaa 16
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcacccccc ctagtgtgca agggcggtgc g 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcacccccc ccagtgtgca agggcggtgc g 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcacctaaa ggagccagct caagcggtgc g 31
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcacctaaa gaagccagct caagcggtgc g 31
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcaccatga tcaacaccca ctggtgcg 28
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtgggtgtt gatcat 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtgggtgtt gatcat 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
actgggtgtt gatcat 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agagggtgtt gatcat 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agtcggtgtt gatcat 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agtgcgtgtt gatcat 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agtggctgtt gatcat 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtgggagtt gatcat 16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agtgggtctt gatcat 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agtgggtgat gatcat 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agtgggtgta gatcat 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agtgggtgtt catcat 16
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agtgggtgtt gttcat 16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agtgggtgtt gaacat 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agtgggtgtt gatgat 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agtgggtgtt gatctt 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agtgggtgtt gatcaa 16

Claims (9)

1.一种用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SNP位点的上下游引物组；DNA guides、不同荧光基团标记的分子信标、以及DNA编辑酶PfAgo；
所述SNP位点的上下游引物组包括以下A、B中至少一个：
A、rs12516位点的上、下游引物组：rs12516位点的上、下游引物分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
B、rs16941位点的上、下游引物组：rs16941位点的上、下游引物分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
所述DNA guides包括以下C、D中至少一个：
C、针对rs12516位点的3条DNA guides包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的序列；
D、针对rs16941位点的3条DNA guides包括如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示的序列；
所述不同荧光基团标记的分子信标包括以下E、F中至少一个：
E、针对rs12516位点T/C的分子信标分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
F、针对rs16941位点A/G的分子信标分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
其中，所述分子信标的5’端均标记有荧光基团和3’端均标记有猝灭基团。
2.如权利要求1所述的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增所需的常规溶液。
3.如权利要求2所述的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增所需的常规溶液包括2×Taq-Mix；或者所述PCR扩增所需的常规溶液包括2×Phanta BloodBuffer V2、Phanta Blood Super-Fidelity DNA polimerase、dNTPs。
4.如权利要求1所述的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，其特征在于，所述DNA guides均用T4多核苷酸激酶处理使其5’端带上磷酸基团。
5.如权利要求1所述的用于检测BRAC1基因SNP的试剂盒，其特征在于，所述分子信标的5’端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，3’端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子；所述有机荧光染料为FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
6.一种用于检测BRAC1基因SNP的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、准备含有不同HPV亚型的待检测离体样品并提取核酸得到待测样品模板；
步骤2、采用权利要求1-5所述的SNP位点的上下游引物组对步骤1所得的待测样品模板进行PCR得到PCR扩增产物；
步骤3、将权利要求1-5所述的DNA guides、不同荧光基团标记的分子信标、DNA编辑酶PfAgo与步骤2所得的PCR扩增产物混合，进行酶切反应；
步骤4、将上述反应产物用荧光光度计测得不同荧光基团得发光情况，从而判断待检测样品中BRAC1基因SNP的碱基组成，从而实现SNP检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序为：95℃，5min预变性；95℃，15S变性，56～72℃，15S退火，72℃，30S延伸；35个循环；72℃，5min。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中酶切反应体系为：PCR扩增产物3uL；
针对rs12516位点的3条DNA guide各0.1uL至终浓度为100nM，针对rs16941位点的3条DNA guide各0.1uL至终浓度为100nM；
所述四种分子信标各0.5uL至终浓度为500nM：
所述DNA编辑酶PfAgo1uL至终浓度为300nM；
以及加反应缓冲液补至终体积为10uL。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4具体判定方法为：检测不同分子信标分别在激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照的荧光值后得到待测样品的相对荧光值的结果；若PCR产物中只有一种碱基则会出现只有一条分子信标的荧光值大于空白对照，若PCR产物中有两种碱基则会出现两条分子信标的荧光值均大于空白对照。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029903A (zh) * 2020-08-13 2020-12-04 湖北大学 一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用
CN112813200A (zh) * 2021-01-22 2021-05-18 湖北大学 核酸极短pcr扩增的方法、检测方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120156676A1 (en) * 2009-06-25 2012-06-21 Weidhaas Joanne B Single nucleotide polymorphisms in brca1 and cancer risk
CN108796036A (zh) * 2018-04-03 2018-11-13 上海交通大学 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120156676A1 (en) * 2009-06-25 2012-06-21 Weidhaas Joanne B Single nucleotide polymorphisms in brca1 and cancer risk
CN108796036A (zh) * 2018-04-03 2018-11-13 上海交通大学 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
缑文斌等: "维吾尔族、汉族散发性乳腺癌BRCA1基因rs16941及rs16942位点多态性分析", 《临床与实验病理学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029903A (zh) * 2020-08-13 2020-12-04 湖北大学 一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用
CN112029903B (zh) * 2020-08-13 2021-11-16 湖北大学 一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用
CN112813200A (zh) * 2021-01-22 2021-05-18 湖北大学 核酸极短pcr扩增的方法、检测方法及应用

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