CN112029903A - 一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用。本发明通过设计针对SARS‑CoV‑2病毒的N基因和ORF1ab基因的引物组，该试剂盒包括该引物组、靶向目的基因的向导DNA、带有荧光标记的分子信标和PfAgo酶。采用本发明提供的引物组能够简单快速地对新冠病毒核酸进行扩增，具有重复性好，敏感度高，特异性强的特点。

Description

一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

目前，荧光定量PCR技术是新型冠状病毒核酸检测的主流方法。该方法基于PCR技术，通过针对于新型冠状病毒基因组的特异性序列设计引物对，对目的核酸片段进行特异性扩增，与此同时在扩增系统中加入相应Taqman探针，探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。扩增反应在荧光定量PCR仪中进行，随着热循环的进行，结合在单链模板上的探针会被DNA聚合酶的外切酶活性切割，荧光基团与淬灭基团分离，解除淬灭作用，产生荧光信号，对该信号进行实时检测，就可以判断样本中是否含有新型冠状病毒。目前临床检测主要采用是针对多个目的序列的多重荧光检测法，靶基因包含SARS-CoV-2基因组中3段保守基因序列：开放读码框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleocapsidprotein，N)基因以及包膜蛋白(envelope，E)基因等。

虽然Taqman法已经得到普及，并为本次疫情的防控提供了有力保障，但是基于荧光PCR的核酸检测方法对于仪器和操作人员的要求都很高，特别是多通道荧光定量PCR仪价格昂贵，约为25-30万元/台，以目前的检测通量，每天每台只能检测3批次，严重限制了检测通量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用。本发明以新型冠状病毒核壳蛋白N基因及ORF1ab基因为检测靶基因，反应体系包括针对N基因的引物组、针对ORF1ab基因的引物组、PfAgo酶、向导DNA和分子信标；向导DNA分子可指导PfAgo酶对靶基因(N基因和/或ORF1ab基因)进行切割，产生16nt的ssDNA，ssDNA分子与游离的PfAgo酶装配成复合物，对与新生成的向导DNA互补的分子信标进行特异性切割，产生荧光，从而实现检测。

为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种引物组，包括SARS-CoV-2的N基因引物对和SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物对，其中：

所述SARS-CoV-2的N基因引物对包括引物NF和引物NR；

所述引物NF为如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物NR为如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物对包括引物OF和引物OR；

所述引物OF为如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物OR为如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子。

本发明的第二方面，提供所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

本发明的第三方面，提供所述引物组在制备试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

本发明的第四方面，提供一种试剂盒，包括上述引物组。

本发明的第五方面，提供所述试剂盒的制备方法，为如下(1)或(2)：

(1)所述引物组、所述向导DNA、所述分子信标和所述PfAgo酶单独包装；

(2)所述引物组、所述向导DNA、所述分子信标和所述PfAgo酶按比例混合在一起。

本发明的第六方面，提供一种鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用所述引物组和/或所述试剂盒进行荧光定量PCR；

如显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的新型冠状病毒SARS-CoV-2，如果不满足上述条件、待测病毒为候选的非新型冠状病毒SARS-CoV-2。

本发明的第七方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，包括以下步骤：

S1、以待测样本中的核酸提取液为模板，逆转录得到新型冠状病毒SARS-CoV-2的cDNA；

S2、采用本发明提供的所述引物组，对所述目的序列的cDNA为模板进行PCR；

S3、将本发明提供的所述向导DNA、分子信标和PfAgo酶与所述S2步骤得到的PCR扩增产物混合，进行酶切反应；

S4、检测上述反应体系中所述分子信标切割后产生的荧光情况，若荧光值与阴性对照相比有显著差异，则判断PCR产物中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中含有SARS-CoV-2病毒；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异，则判断PCR产物中不含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有SARS-CoV-2病毒。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、采用本发明提供的引物组能够简单快速地对新冠病毒核酸进行扩增，具有重复性好，敏感度高，特异性强的特点，同时还能对抗新型病毒基因突变导致的灵敏度降低的假阴性缺陷。

2、本发明提供的鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法及鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法均能实现多重检测。该方法通过与PCR技术结合，可在常规PCR仪中扩增样品中的靶基因，得到的扩增片段再经过本发明提供的基于PfAgo酶的切割方法，产生荧光分子后，再切换至荧光定量PCR仪中读取荧光值，能在1-2h内完成检测，而常规方法在多通道荧光定量PCR仪进行检测需要4-5h。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例利用PfAgo检测SARS-CoV-2病毒N基因检测示意图的原理图；箭头表示切割位点。

图2为本发明实施例利用PfAgo检测SARS-CoV-2病毒ORF1ab基因检测示意图的原理图；箭头表示切割位点。

图3为本发明实施例对阳性标准品中的靶基因片段进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测图；泳道1：阴性对照；泳道2：N基因PCR产物电泳条带；泳道3：ORF1ab基因PCR产物电泳条带；泳道4：DL2000 DNA marker。

图4为本发明实施例对阳性标准品进行PCR后获得的扩增产物进行PfAgo酶切后样品荧光值检测结果。

图5是本发明实例提供的对阳性标准品双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验得结果图；泳道1：N基因PCR产物电泳条带；泳道2：阴性对照；泳道3：ORF1ab基因PCR产物电泳条带；泳道4：N基因和ORF1ab基因双重PCR扩增产物电泳条带；泳道5：20bp DNAmarker。

图6为本发明实施例对阳性标准品进行双重PCR后的扩增产物利用PfAgo酶切后检测的不同激发光谱和发射光谱下荧光的情况。

图7为本发明实施例对0拷贝、1拷贝、10拷贝、100拷贝和1000拷贝的阳性标准品的行琼脂糖凝胶电泳实验的检测结果图，其中，M：20bp DNA ladder，泳道1：1000拷贝，泳道2：100拷贝，泳道3：10拷贝，泳道4：1拷贝，泳道5：0拷贝。

图8为本发明实施例对0拷贝、1拷贝、10拷贝、100拷贝和1000拷贝PCR后的扩增产物利用PfAgo酶切后荧光值检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

引物组

目前所有的新冠病毒核酸诊断试剂盒检测位点包括：核壳蛋白基因N，刺突蛋白基因(S)，小包膜蛋白基因(E)和ORF1ab基因。临床使用中发现N基因的特异性比较差，不少样本只有N基因阳性，而另一个基因呈阴性。但是由于N基因由于分子量小，拷贝数高，容易检测到，故而很多诊断试剂盒为了不漏检，都把N基因选作靶基因之一。虽然绝大多数突变发生在ORF1ab区域，但是由于ORF1ab基因非常大，其中具有抗突变的高度保守系列，非常适合作为引物设计的靶点。因此，本发明选择N基因和ORF1ab作为引物设计的靶点，并根据PfAgo的酶切特点选择合适的向导DNA，再根据向导DNA的靶向位置确定了上下游引物的位置，从而分别设计的检测N基因和ORf1ab基因的引物。

本发明的第一实施方式中，提供一种引物组，包括：

SARS-CoV-2的N基因引物对，包括引物NF和引物NR；

所述引物NF为如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物NR为如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物对，包括引物OF和引物OR；

所述引物OF为如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物OR为如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子。

试剂盒

本发明的第二实施方式中，提供一种试剂盒，包括上述实施例提供的引物组。

本发明的第三实施方式中，提供上述实施例提供的引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

需要说明的是，本发明提供的引物组可以分别用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因和新型冠状病毒SARS-CoV-2的ORF1ab基因。在实际应用中，可以将二者单独扩增或联合扩增，并结合荧光探针进行荧光PCR，从而实现对新型冠状病毒进行检测；还可以联合其他已有的新型冠状病毒检测引物和探针进行检测。本发明的又一具体实施方式中，采用的荧光探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团，荧光基团具体可为FAM和VIC，淬灭基团具体可为BHQ1。如图3为N基因和ORF1ab基因的扩散片段电泳图，图4为经本发明提供的引物对目的序列扩增后的荧光检测结果。结果表明，采用本发明提供的引物组，能够将目的序列进行成功扩增，并能通过荧光探针进行连接，从而进行荧光检测，满足荧光检测新型冠状病毒的引物设计要求。

本发明的第四实施方式中，提供一种试剂盒，包括上述实施例提供的引物组、靶向目的基因的向导DNA、带有荧光标记的分子信标和PfAgo酶。如图1、2所示，该设计盒的原理为：向导DNA分子可指导PfAgo酶对靶基因(N基因和/或ORF1ab基因)进行切割，产生16nt的ssDNA，ssDNA分子与游离的PfAgo酶装配成复合物，对与新生成的向导DNA互补的分子信标进行特异性切割，产生荧光，从而实现检测。

本发明的第五实施方式中，该试剂盒中的用途包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。实施例1用于SARS-CoV-2病毒核酸检测的试剂盒组分制备：

一、试验材料及设备

荧光基因和淬灭基团：FAM，6-Carboxy-fluorescein(6-羧基-荧光素)，VIC，BHQ-1；在本发明中，上述荧光染料(荧光基因)、荧光淬灭剂(荧光淬灭基因)仅仅是部分列举，也可采用其他试剂。

对照品：装有病毒基因组特异序列的质粒和空质粒。

仪器：PCR仪，伯乐PCR仪T100；q-PCR仪：伯乐CFX96 Touch荧光定量PCR仪。

二、引物设计

根据中国国家疾控中心公布的SARS-Cov-2病毒基因序列(MN908947.3)，设计并合成扩增目标基因所需引物、向导DNA和对应的分子信标，具体的引物、向导DNA和分子信标序列如下：

N基因引物对：

NF：5’-gttcaagaaattcaactccaggc-3’，如SEQ ID NO.1；

NR：5’-cagacattttgctctcaagctg-3’，如SEQ ID NO.2；

ORF1ab引物对：

OF：5’-ccctgtgggttttacacttaa-3’，如SEQ ID NO.3；

OR：5’-acgattgtgcatcagctga-3’，如SEQ ID NO.4；

N基因的向导DNA：5’-ccattgccagccattc-3’，如SEQ ID NO.5；

ORF1ab基因的向导DNA：5’-actacagccataacct-3’，如SEQ ID NO.6；

N基因的分子信标：5’-VIC-cgcacctcaccgccattgccagggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ IDNO.7；

ORF1ab基因的分子信标：5’-6-FAM-cgcaccatcacaactacagccaggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.8。

三、向导DNA和分子信标的制备

(1)向导DNA的制备：

向导DNA可引导PfAgo酶切割靶DNA。本发明所述实施例中所有的向导DNA均用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)处理使其5’端带上磷酸基团，T4 PNK反应体系见表1。

表1向导DNA的磷酸化修饰反应体系配置

(2)分子信标的制备：

在本实施例中，分子信标5’端和3’端分别由荧光基团和淬灭基团修饰，所述荧光基团选自FAM、VIC、Cy5或Rox中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ-1、BHQ2、BHQ-3、BBQ或TAMRA中的至少一种。在其他实施例中，还可以采用其他已知的所有荧光基团和荧光淬灭基团进行标记，所述可供选择的部分荧光基团的特定激发波长和发射波长见表2。

表2分子信标荧光基团的激发波长和发射波长

荧光基团	激发光谱(nm)	发射光谱(nm)
			6-FAM	496	518
VIC	538	554
			CY5	647	662
ROX	588	607

四、本发明提供的基于PfAgo酶的荧光试剂盒(表3)。

表3基于PfAgo酶的试剂盒组成

实施例2

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，包括以下步骤：

S1、以待测样本中的核酸提取液为模板，分别加入单独N基因引物、ORF1ab基因引物，或同时加入N基因引物和ORF1ab基因引物进行逆转录得到新型冠状病毒SARS-CoV-2的cDNA，所述逆转录反应体系见表4。

表4

逆转录反应程序为：55℃，15min；85℃，20min。

S2、采用上述引物组，所述逆转录得到的包含单个目的序列(N基因或ORF1ab基因)的cDNA、和同时包含N基因和ORF1ab基因的cDNA为模板，分别进行单重PCR和双重PCR；

S3、将所述向导DNA、分子信标和PfAgo酶与所述S2步骤得到的PCR扩增产物混合，进行酶切反应；

S4、检测上述反应体系中所述分子信标切割后产生的荧光情况，若荧光值与阴性对照相比有显著差异(即荧光值达到阴性对照的两倍及以上)，则判断PCR产物中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中含有SARS-CoV-2病毒；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异(即荧光值未达到阴性对照的两倍)，则判断PCR产物中不含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有SARS-CoV-2病毒。

具体的，S2步骤中的目的序列扩增方法，采用实施例1中设计的引物对步骤1中阳性标准品进行PCR扩增反应，得到双链DNA扩增产物作为PfAgo的底物。所述PCR扩增的反应体系见表5(以50μL/反应为例)。

表5

PCR扩增程序为：95℃，3min预变性；95℃，10s变性，57℃，10s退火，72℃，10s延伸；40-55个循环；72℃，5min。

具体的，步骤S3的酶切反应为，将步骤S2获得PCR扩增得到的产物中加入向导DNA、分子信标和PfAgo酶，进行酶切反应，反应条件为95℃，30min。所述反应体系见表5。

表6

具体的，步骤S4中的荧光信号检测，用q-PCR仪或荧光光度计检测酶切样品的荧光值，若荧光值相比于空白对照(不含目标基因DNA片段)有显著差异，则结果为阳性，若相比于空白对照无显著差异，则结果为阴性。

对经单重PCR获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示；如图4所示，其检测结果荧光检测值均显著高于阴性对照(p<0.01)，说明本发明提供的引物组及其试剂盒能够鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

阳性标准品的单重检测荧光值如表7所示，相对荧光强度如图3所示。

表7 ORF1ab基因和N基因的阳性标准品的检测荧光值

对经双重目的基因PCR获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。

对单重、双重目的基因的PCR获得扩增产物经过本发明提供的基于PfAgo酶的切割方法，产生荧光分子后，读取的荧光值如图6所示。

图6可知，阴性对照的荧光值在500左右，单ORF1ab目的基因其经扩增和酶切后的产物荧光值在500-1000之间，单N目的基因其经扩增和酶切后的产物荧光值在1000-1500之间；而双重目的基因其经扩增和酶切后的产物荧光值大于1500；可见双重目的基因的检出效果更明显，有效提高检出率，降低假阴性的检出情况。

表8离体样品的本发明提供的试剂盒荧光检测结果及q-PCR试剂盒方法检测结果

如表8所示，8份离体样品的相关荧光值的结果与常规荧光定量PCR的检测结果一致；其中，相对荧光值为测定荧光值减去阴性对照的荧光值的差值。

实施例3

本发明用于鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法的检测下限鉴定，包括以下步骤：

1：将包含N基因的阳性标准品分别稀释到1000copies/μL，100copies/μL，10copies/μL，1copies/μL，0copies/μL；

2：分别对步骤1稀释得到的不同浓度的阳性标准品进行PCR扩增，PCR扩增方法同实施例2；

3：将步骤2中扩增的到的PCR产物进行PfAgo酶切反应，PfAgo酶切反应同实施例2；

对经PCR获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示；对于PfAgo酶切的荧光值检测，如图8所示。结果表明，各稀释度的荧光检测值均显著高于阴性对照(阴性对照的两倍以上)，说明本发明方法可以实现单个拷贝的检测，灵敏度高。

综上所述：

1、采用本发明提供的引物组能够简单快速地对新冠病毒核酸进行扩增，具有重复性好，敏感度高，特异性强的特点，同时还能对抗新型病毒基因突变导致的灵敏度降低的假阴性缺陷。

2、本发明提供的鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法及鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法均能实现多重检测。该方法通过与PCR技术结合，可在常规PCR仪中扩增样品中的靶基因，得到的扩增片段再经过本发明提供的基于PfAgo酶的切割方法，产生荧光分子后，再切换至荧光定量PCR仪中读取荧光值，能在1-2h内完成检测，而常规方法在多通道荧光定量PCR仪进行检测需要4-5h。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种SARS-CoV-2病毒核酸检测的引物组、试剂盒及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttcaagaaa ttcaactcca ggc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccattgccag ccattc 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actacagcca taacct 16

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcacctcac cgccattgcc agggtgcg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcaccatca caactacagc caggtgcg 28

Claims (10)

1.一种引物组，其特征在于，包括SARS-CoV-2的N基因引物对和SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物对，其中：

所述SARS-CoV-2的N基因引物对包括引物NF和引物NR；

所述引物NF为如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物NR为如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物对包括引物OF和引物OR；

所述引物OF为如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物OR为如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子。

2.权利要求1所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

3.权利要求1所述引物组在制备试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括靶向目的基因的向导DNA、带有荧光标记的分子信标和PfAgo酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述向导DNA包括靶向目的基因中的SARS-CoV-2的N基因的向导DNA和靶向目的基因中的SARS-CoV-2的ORF1ab基因的向导DNA；

所述N基因的向导DNA为如SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述ORF1ab基因的向导DNA为SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子，或由如SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ IDNO.6所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述分子信标包括针对SARS-CoV-2的N基因的分子信标和针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因的分子信标；

所述N基因的分子信标中的核酸序列为如SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子，或由如SEQID NO.7所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述ORF1ab基因的分子信标中的核酸序列为如SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子、或由如SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且与如SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子具有相同功能的DNA分子。

8.权利要求5-7任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，为如下(1)或(2)：

(1)所述引物组、所述向导DNA、所述分子信标和所述PfAgo酶单独包装；

(2)所述引物组、所述向导DNA、所述分子信标和所述PfAgo酶按比例混合在一起。

9.一种鉴定或辅助鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1所述引物组和/或权利要求4所述试剂盒进行荧光定量PCR；

如显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的新型冠状病毒SARS-CoV-2，如果不满足上述条件、待测病毒为候选的非新型冠状病毒SARS-CoV-2。

10.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以待测样本中的核酸提取液为模板，逆转录得到新型冠状病毒SARS-CoV-2的cDNA；

S2、采用权利要求1所述引物组，对所述目的序列的cDNA为模板进行PCR；

S3、将权利要求5所述向导DNA、分子信标和PfAgo酶与所述S2步骤得到的PCR扩增产物混合，进行酶切反应；

S4、检测上述反应体系中所述分子信标切割后产生的荧光情况，若荧光值与阴性对照相比有显著差异，则判断PCR产物中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中含有SARS-CoV-2病毒；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异，则判断PCR产物中不含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有SARS-CoV-2病毒。

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