CN107723338B - 一种在单分子水平同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用，该传感器基于修饰有8‑羟基鸟嘌呤且尾端标记花菁3(Cy3)和猝灭基团的分子信标以及修饰有脱氧次黄嘌呤且尾端标记花菁5(Cy5)和猝灭基团的两种不同的分子信标用于检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶和N‑甲基嘌呤DNA糖基化酶，与受动力学和热力学影响严重的传统分子信标不同，Cy3和Cy5的信号恢复取决于DNA糖基化酶为媒介的分子信标劈裂，该方法在不涉及任何信号扩增的情况下能够实现同时灵敏检测对hOGG1和hAAG活性的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及基于一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。
背景技术
DNA糖基化酶是一种碱基切除修复路径中的初始酶，此种酶能够识别并切除变异的DNA碱基并产生无嘌呤或者无嘧啶(AP)位点，DNA糖基化酶的正常活动保证了碱基切除修复的稳定性从而保证基因组的稳定性。碱基切除修复路径至少涉及11种不同的哺乳动物糖基化酶，这些酶通过依赖不同的变异类型发生作用。此外，异常的DNA糖基化酶和癌症，神经病，心血管疾病和炎症等一系列疾病密切相关。
检测糖基化酶的传统方法包括放射性标记法，酶连免疫吸附测定，高相液相色谱法，以磁珠纳米颗粒为基础的分离法，以金纳米颗粒为基础的比色法。放射性标记法将待检测物标记一种或两种放射性核素从而用于检测。酶连免疫吸附测定(ELISA)基于酶分子与抗体或者抗抗体分子的共价结合，通过ELISA 检测仪进行测定从而判断有无相应的反应。高相液相色谱法(HPLC)以液体为流动相，向色谱柱内加入不同的洗脱液从而在柱内将各种成分分离，进入检测器进行检测。磁珠纳米颗粒为基础的分离法以修饰DNA为发卡探针连接磁珠与荧光基团实现荧光猝灭，通过糖基化酶引发的发卡探针劈裂并分离磁珠实现荧光基团的释放从而获得信号。以纳米金颗粒为基础的比色法通过使分散状态的纳米金颗粒团聚，使纳米金溶液的颜色发生改变，并通过紫外分光光度计检测纳米金溶液在520nm和650nm波长处的紫外吸收峰。
然而这些传统的检测方法需要昂贵的标记试剂，所需DNA片段过于冗长，检测设备过于昂贵，这些均增加了实验成本并且上述方法步骤繁琐，分析时间长，特异性及灵敏度较差。
为了提高检测灵敏度，人们在糖基化酶检测中引入了一些扩增步骤，如核酸外切酶(λ核酸外切酶或核酸外切酶III)辅助的信号扩增，目标介导的自动催化生成DNA核酶的滚环扩增和低变性温度聚合酶链反应扩增。这些方法通过扩增进行信号放大提高了检测灵敏度，但外切酶辅助的信号扩增对反应体系要求较高，重现性差。而目标介导的自动催化生成DNA核酶的滚环扩增易发生非特异性扩增，产生假阳性信号，降低特异性。同时低变性温度聚合酶链反应依赖高精度的温度循环，多种引物和特定的DNA聚合酶，增加检测的复杂性和花费。此外，上述这些扩增放大信号的方法仅仅能够用于测量一种DNA 糖基化酶。因此开发一种简单灵敏廉价且能够同时检测多种DNA糖基化酶的方法成为本领域研究人员亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种同时检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和N-甲基嘌呤DNA糖基化酶 (hAAG)的荧光化学传感器，该传感器基于修饰有8-羟基鸟嘌呤且尾端标记花菁 3(Cy3)和猝灭基团的分子信标以及修饰有脱氧次黄嘌呤且尾端标记花菁5(Cy5) 和猝灭基团的两种不同的分子信标用于检测hOGG1和hAAG，与受动力学和热力学影响严重的传统分子信标不同，Cy3和Cy5的信号恢复取决于DNA糖基化酶为媒介的分子信标劈裂，该方法在不涉及任何信号扩增的情况下能够实现同时灵敏检测对hOGG1和hAAG活性的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：hOGG1分子信标和hAAG分子信标；
其中，所述hOGG1分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hOGG1的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团I和淬灭基团I标记；所述hOGG1的识别位点为8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对；
所述hAAG分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hAAG的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团II和淬灭基团II标记；所述hAAG的识别位点为脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对；
所述荧光基团I与荧光基团II为两个发射光谱之间没有明显光谱重叠和串扰的荧光基团，进一步优选的，所述荧光基团I为花菁3(Cy3)，所述淬灭基团 I为BHQ2淬灭剂；所述荧光基团II为花菁5(Cy5)，所述淬灭基团II为BHQ3 淬灭剂；
所述hOGG1分子信标和hAAG分子信标茎部碱基序列长度均为12～13个碱基，通常分子信标茎部为5～7个碱基序列长度，发明人通过研究中发现，由于本发明荧光基团的荧光恢复是由分子信标的劈裂产生的，因此适当增长分子信标茎部碱基序列长度能够显著提高检测的灵敏度；同时也有助于会降低背景荧光，从而增加信噪比；
优选的，所述荧光化学传感器还包括脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)；
优选的，所述hOGG1分子信标长度为34nt，所述hOGG1分子信标的碱基序列为：5'-Cy3-GGT CTO ATG GGG GAC ACG ACA CCC CCA TCA GAC C-BHQ2-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hOGG1分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基O即8-羟基鸟嘌呤，所述hOGG1分子信标5'端标记有荧光基团花菁3(Cy3)，3'端标记有淬灭基团BHQ2；
优选的，所述hAAG分子信标长度为34nt，所述hAAG分子信标的碱基序列为：5'-Cy5-CTC GIG GCA GCT CAG TAC AGG AAG CTG CCT CGA G- BHQ3-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hAAG分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基I即脱氧次黄嘌呤，所述hAAG分子信标5'端标记有荧光基团花菁5(Cy5)，3'端标记有淬灭基团BHQ3；
本发明的第二个方面，公开了所述荧光化学传感器用于同时检测hOGG1 和hAAG的方法，具体包括：
1)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；
2)对步骤1)反应后的溶液进行荧光化学检测，实现对待测样品中hOGG1 和hAAG的定量分析。
其中，步骤1)所述反应溶液I中包括hOGG1分子信标、hAAG分子信标和APE1酶；
步骤1)中孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1～2h(优选为1.5h)；高温灭活处理温度为80℃，处理时间为10～30min(优选为20min)；
步骤2)中采用荧光仪定量检测荧光强度，具体的，在535nm处激发Cy3 并收集560nm处的信号，在635nm处激发Cy5并收集665nm处的信号。
本发明还公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测hOGG1/或 hAAG中的应用。
本发明还公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在筛选hOGG1/或 hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
本发明所述荧光化学传感器检测方法的原理为：本发明涉及一种可同时检测多种DNA糖基化酶(hOGG1和hAAG)的超灵敏单分子检测方法。
发明人设计了修饰有8-羟基鸟嘌呤且5'端标记花菁3(Cy3)和猝灭基团的分子信标以及修饰有脱氧次黄嘌呤且5'端标记花菁5(Cy5)和猝灭基团的两种不同的分子信标用于检测hOGG1和hAAG，与受动力学和热力学影响严重的传统分子信标不同，Cy3和Cy5的信号恢复取决于DNA糖基化酶为媒介的分子信标劈裂，当hOGG1、双分子信标以及APE1酶存在时，hOGG1识别8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对并释放8-羟基鸟嘌呤从而形成一个脱嘌呤位点，随后，APE1 切割分子信标从而使Cy3标记的分子信标断裂成两部分，分子信标的断裂使得荧光基团Cy3远离猝灭剂BHQ2，导致Cy3信号恢复并被单分子检测系统灵敏定量。类似地，当hAAG、双分子信标以及APE1酶存在时，hAAG识别脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对从而形成一个脱嘌呤位点，随后，APE1切割分子信标从而使Cy5标记的分子信标断裂成两部分，分子信标的断裂使得荧光基团 Cy5远离猝灭剂BHQ3，导致Cy5信号恢复并被单分子检测系统灵敏定量。因此，该方法在不涉及任何信号扩增的情况下能够实现同时待检物中hOGG1和 hAAG活性以及动力学参数测定。
本发明的有益效果如下：
(1)不需额外的扩增步骤
传统的检测糖基化酶为了提高灵敏度往往结合复杂的扩增步骤，扩增步骤往往需要复杂的模板设计，并且扩增过程中容易出现假阳性信号。本发明所用的单分子检测在超灵敏检测方面具有独特优势，不需要额外的扩增步骤也能达到高灵敏度。
(2)本发明所用的分子信标为一种新型分子信标
传统分子信标茎部分通常为5～7个碱基序列长度，本发明所用的分子信标茎部为12～13碱基序列长度，由于荧光基团的荧光恢复是由分子信标的劈裂产生的，更长茎的分子信标能够提高检测灵敏度。此外，长茎同样会降低背景荧光，从而增加信噪比。
(3)同时检测多种糖基化酶
该方法不像已报道的糖基化酶检测方法只能特异性检测一种糖基化酶，该方法中hOGG1只能识别8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对而无法识别脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对，hAAG只能识别脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对而无法识别8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对，因此Cy3与Cy5信号相对独立只反映是否存在其修饰底物所对应的相应酶，从而实现多种酶的同时检测。
综上，本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，在提高检测灵敏度的同时有效降低检测成本，同时由于我们对本发明中的各反应条件(APE1酶浓度，分子信标浓度和酶切反应时间等)也都进行了细致优化，因此在检测过程中，极大提高了检测灵敏度同时有效防止非特异性反应的发生，可实现在复杂生物样品中对hOGG1和hAAG的精准检测。经试验验证，本发明对hOGG1的检测极限为 2.23×10-6单位每微升，与金纳米粒子为基础的比色法相比，本发明所述检测方法的检测限提高了约3个数量级，本发明对hAAG的检测极限为8.69×10-7单位每微升，与基于磁珠的荧光法相比检测限提高约2个数量级。
附图说明
图1为本发明所述荧光化学传感器用于同时检测hOGG1和hAAG的机理示意图；
图2(A)为聚丙烯酰氨凝胶电泳分析hOGG1引发的分子信标劈裂产物表征(带 1-4)和hAAG引发的分子信标劈裂产物表征(带5-8)，其中以SYBR gold作为指示剂；图2(B)为聚丙烯酰氨凝胶电泳分析hOGG1引发的分子信标劈裂产物表征和hAAG引发的分子信标劈裂产物表征，带2表示当hOGG1存在时， Cy3标记的DNA片段，带4表示当hAAG存在时，Cy5标记的DNA片段；图 2(C)为存在hOGG1和不存在hOGG1时Cy3荧光图谱；图2(D)为存在hAAG 和不存在hAAG时Cy5荧光图谱；其中，hOOG1和hAAG以及APE1浓度均为0.1单位每微升；
图3为通过全内反射荧光显微镜为基础的单分子成像同时检测多种DNA糖基化酶显像图；其中，图3A和图3E为hOGG1与hAAG均不存在时的显像图，图3B和图3F为只存在hOGG1时的显像图，图3C和图3G代表只存在hAAG 的显像图，图3D和图3H为hOGG1与hAAG同时都存在时的显像图；其中，两种分子信标浓度均为0.3微摩尔每升，hOOG1和hAAG以及APE1浓度均为 0.1单位每微升，图3中各比例尺均为5微米。
图4(A)为不同浓度APE1酶对应的荧光强度，其中hOGG1和hAAG浓度均为0.1单位每微升；图4(B)为不同浓度分子信标酶切反应后信噪比，其中hOOG1 和hAAG以及APE1浓度均为0.1单位每微升；图4(C)为反应体系中是否存在hOGG1时Cy3计数与反应时间的关系；其中hOGG1和APE1浓度均为0.1 单位每微升。图4(D)为反应体系中是否存在hAAG时Cy5计数与反应时间的关系，其中hAAG和APE1浓度均为0.1单位每微升；
图5(A)为测量不同浓度hOGG1产生的Cy3点数，图5(A)内图为Cy3点数和hOGG1浓度线性关系图；其中，hOGG1分子信标浓度为0.3微摩尔每升， APE1单位为0.1单位每微升；图5(B)为测量不同浓度hAAG产生的Cy5点数，图5(B)内图为Cy5点数和hAAG浓度线性关系图；其中hAAG分子信标浓度为0.3微摩尔每升，APE1单位为0.1单位每微升；误差线表示三次重复实验标准差；
图6为在仅存在反应缓冲液(对照)，0.1克每升牛血清白蛋白(BSA)，0.1 单位每微升尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，0.1单位每微升胸腺嘧啶糖基化酶(TDG)，0.1单位每微升hOGG1，0.1单位每微升hAAG和0.1单位每微升 hOGG1和hAAG混合物时Cy3和Cy5的计数，其中，两种分子信标浓度均为 0.3微摩尔每升，APE1浓度为0.1单位每微升，误差线表示三次重复实验标准差；
图7为不同浓度二价镉离子所对应的相对催化活性图，其中，hOGG1分子信标和hAAG分子信标浓度均为0.3微摩尔每升，hOOG1和hAAG以及APE1浓度均为0.1单位每微升。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术对DNA糖基化酶测定存在灵敏度偏低、检测方法繁琐、所需仪器昂贵、仅能针对单一糖基化酶进行检测等各种问题；
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种同时检测hOGG1和 hAAG的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：hOGG1分子信标和hAAG 分子信标；
其中，所述hOGG1分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hOGG1的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团I和淬灭基团I标记；所述hOGG1的识别位点为8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对；
所述hAAG分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hAAG的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团II和淬灭基团II标记；所述hAAG的识别位点为脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对；
所述荧光基团I与荧光基团II为两个发射光谱之间没有明显光谱重叠和串扰的荧光基团，进一步优选的，所述荧光基团I为花菁3(Cy3)，所述淬灭基团I为BHQ2淬灭剂；所述荧光基团II为花菁5(Cy5)，所述淬灭基团II为BHQ3 淬灭剂；
所述hOGG1分子信标和hAAG分子信标茎结构碱基序列长度均为12～13 个碱基，通常分子信标茎部为5～7个碱基序列长度，发明人通过研究中发现，由于本发明荧光基团的荧光恢复是由分子信标的劈裂产生的，因此适当增长分子信标茎部碱基序列长度能够显著提高检测的灵敏度；同时也有助于会降低背景荧光，从而增加信噪比；
本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感器还包括脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)；
本发明的又一具体实施方式中，所述hOGG1分子信标长度为34nt，所述 hOGG1分子信标的碱基序列为：5'-Cy3-GGT CTO ATG GGG GAC ACG ACA CCC CCA TCA GAC C-BHQ2-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hOGG1分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基O即8-羟基鸟嘌呤，所述hOGG1分子信标5'端标记有荧光基团花菁3(Cy3)，3'端标记有淬灭基团BHQ2；
本发明的又一具体实施方式中，所述hAAG分子信标长度为34nt，所述 hAAG分子信标的碱基序列为：5'-Cy5-CTC GIG GCA GCT CAG TAC AGG AAG CTG CCT CGA G-BHQ3-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hAAG分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基I即脱氧次黄嘌呤，所述hAAG分子信标5' 端标记有荧光基团花菁5(Cy5)，3'端标记有淬灭基团BHQ3；
本发明的又一具体实施方式中，提供了所述荧光化学传感器用于同时检测 hOGG1和hAAG的方法，具体包括：
1)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；
2)对步骤1)反应后的溶液进行荧光化学检测，实现对待测样品中hOGG1 和hAAG的定量分析。
其中，步骤1)所述反应溶液I中包括hOGG1分子信标、hAAG分子信标和APE1酶；
步骤1)中孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1～2h(优选为1.5h)；高温灭活处理温度为80℃，处理时间为10～30min(优选为20min)；
步骤2)中采用荧光仪定量检测荧光强度，具体的，在535nm处激发Cy3 并收集560nm处的信号，在635nm处激发Cy5并收集665nm处的信号。
本发明的又一具体实施方式中，提供了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测hOGG1/或hAAG中的应用。
本本发明的又一具体实施方式中，提供了上述荧光化学传感器和/或检测方法在筛选hOGG1/或hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例
实验方法步骤
1.分子信标制备：6微摩尔每升hOGG1探针、6微摩尔每升hAAG探针或6微摩尔每升hOGG1与6微摩尔每升hAAG探针混合物加入含有50毫摩尔每升氯化钠，10毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔氯化镁，1毫摩尔二硫苏糖醇，pH为7.9的缓冲液中，95℃加热5分钟，随后缓慢冷却至室温，产物放在冰上备用。
2.酶切反应：向20微升包含50毫摩尔每升氯化钠，50毫摩尔每升醋酸钾， 20毫摩尔每升Tris-Ac，10毫摩尔醋酸镁，10毫摩尔氯化钾，10毫摩尔硫酸铵，2 毫摩尔硫酸镁，30毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔氯化镁，1毫摩尔二硫苏糖醇， 0.1％曲通X-100的缓冲液中加入不同浓度的hOGG1和hAAG，0.1单位每微升人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)和1微升分子信标(分子信标浓度为0.3微摩尔每升)。上述溶液在37℃反应1.5h，随后在80℃反应20分钟终止反应。
3.凝胶成像：向产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，将混合物打入12％聚丙烯酰氨凝胶中，凝胶放入1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液中，在110V电压下室温电泳45分钟。最后通过ChemiDoc MP成像系统对酶切反应产物进行凝胶成像。
4.荧光检测：Cy3和Cy5的荧光信号均使用一台日立F-7000荧光仪测量收集，在535nm处激发Cy3并收集560nm处的信号，在635nm处激发Cy5并收集665nm处的信号。
5.单分子测量和数据分析：在单分子测量前，酶切产物使用稀释液(10毫摩尔每升Tris-HCl，50毫摩尔每升氯化钾，1毫摩尔奎诺二甲基丙烯酸酯，pH8.0) 稀释3000倍。随后，取10微升稀释物打到玻片上。单分子成像通过一个全内反射荧光显微镜获得，561nm和640nm激光源同时打开用于激发Cy3和Cy5，光子由一个油浸物镜捕捉并通过分光镜分离到Cy3通道(573-613nm滤波器)或Cy5通道 (661.5-690.5nm滤波器)并在电子倍增电荷耦合摄像机处成像。使用软件image J 对600×600像素区域内的Cy3或Cy5点数进行计数，Cy3和Cy5的计数取10张图像取平均值。
6.抑制剂实验：将不同浓度的氯化镉与0.1单位每微升hOGG1和0.1单位每微升hAAG在37摄氏度反应20分钟，随后反应遵循酶切反应条件，并对Cy3和Cy5 进行计数。
7.细胞培养和细胞提取：在DMEM培养基中培养肺腺癌细胞系A549，培养基中加入10％胎牛血清和1％青霉素链霉素。培养基置于37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养至细胞成熟。待细胞成熟，使用核提取试剂盒(Active Motif) 根据说明书进行细胞提取物的提取。得到的提取物用于随后的检测。
结果分析与讨论
1.同时检测hOGG1与hAAG可行性实验
在这项研究中，我们使用凝胶电泳分析用来分析该实验是否可行。如图2A 所示，当不存在糖基化酶时(条带1、2、5、6)只有一条34寡核苷酸分子信标带，表明分子信标未劈裂。当Cy3标记的分子信标，hOGG1和APE1三者都存在时，能看到一条28个碱基序列寡核苷酸带(带4)，这表明hOGG1的存在引发了Cy3 标记的分子信标的劈裂。相似地，当Cy5标记的分子信标，hAAG和APE1三者都存在时，能看到一条约29个碱基序列寡核苷酸带(带8)，这表明hAAG的存在引发了Cy5标记的分子信标的劈裂。与此相反，Cy3标记的分子信标，hAAG和APE1三者都存在时或者Cy5标记的分子信标，hOGG1和APE1三者都存在时，均未能观察到28～29寡核苷酸带(条带3,7)。这一结果进一步通过进一步激发Cy3 或Cy5凝胶电泳证实(图2B)，当仅存分子信标及APE1酶时，无法观察到谱带 (条带1,3)，这表明此时分子信标未发生劈裂，荧光基团被淬灭剂所淬灭。当 Cy3标记的分子信标，hOGG1和APE1三者都存在时，能观察到Cy3标记的DNA 片段(条带2)。当Cy5标记的分子信标，hAAG和APE1三者都存在时，能观察到Cy5标记的DNA片段(条带4)。
聚丙烯酰氨凝胶电泳和荧光测量结果一致(图2C，D)，在不加入糖基化酶的控制组，无法观察到明显的Cy3或者Cy5信号。相反，加入hOGG1后，在560nm 出观察到明显的Cy3发射峰，加入hAAG后，665nm处观察到明显的Cy5发射峰。
为了进一步验证实验可行性，我们在单分子水平同时检测hOGG1和hAAG。如图3所示，当不存在糖基化酶时，Cy3和Cy5通道均无信号(A和E)，当只存在hOGG1，只能观察到Cy3通道信号而无Cy5信号(B和F)，当只存在hAAG时，只能观察到Cy5信号而无Cy3信号(C和G)，当hOGG1和hAAG同时存在时，Cy3 和Cy5信号观察到(D和H)。
上述结果清晰表明该方法能用于同时检测多种DNA糖基化酶。
2.优化实验条件
为了得到最佳的实验结果，我们优化了不同浓度的APE1酶浓度，分子信标浓度和酶切反应时间三个变量。
如图4A所示，随着APE1酶浓度由0单位每微升增加到0.1单位每微升，Cy3 和Cy5荧光值均增加，当APE1酶浓度为0.12单位每微升时，Cy3与Cy5荧光值相比于0.1单位每微升不再变化，因此我们选择0.1单位每微升作为最佳APE1酶浓度。同时，我们研究不同浓度分子信标浓度对信噪比(F-F0)/F0的影响，如图4B 所示，随着两种分子信标浓度由0.2微摩尔每升增加到0.6微摩尔每升，Cy3与Cy5 信噪比均先增后降且均在分子信标浓度为0.3微摩尔每升时达到最大，因此，我们选择0.3微摩尔每升作为两种分子信标最佳浓度。随后，我们研究酶切反应时间对信号的影响，如图4C所示，Cy3计数随着反应时间增加而加大，在10分钟到达平台期后Cy3计数不再改变。如图4D所示，Cy5计数随着反应时间增加而加大，在90分钟到达平台期。鉴于hOGG1和hAAG同时检测，我们选择90分钟作为最佳反应时间。
3.DNA结合蛋白灵敏度检测
为了说明该方法检测hOGG1和hAAG灵敏度，我们在优化的实验条件下测得的不同浓度的糖基化酶对应的荧光计数。如图5A所示，随着hOGG1浓度从0增加到0.12单位每微升，Cy3计数不断增加，同时在对数刻度上，Cy3计数和hOGG1 浓度从3.4×10-6单位每微升至1×10-3单位每微升呈线性关系(图5A内图)。回归方程为N＝946.54+167.49log10C(R2＝0.981)，通过计算空白平均值加三倍标准差得到检测极限为2.23×10-6单位每微升。该检测限比金纳米粒子为基础的比色法高约3个数量级(7×10-4单位每微升)并可与外切酶辅助的恒温扩增为基础的荧光法相媲美(3.5×10-6单位每微升和1×10-6单位每微升)。如图5B所示，随着hAAG 浓度从0增加到0.12单位每微升，Cy5计数不断增加，同时在对数刻度上，Cy5计数和hAAG浓度从3.4×10-6单位每微升至1×10-3单位每微升呈线性关系(图5B内图)。回归方程为N＝955.86+157.72log10C(R2＝0.990)，通过计算空白平均值加三倍标准差得到检测极限为8.69×10-7单位每微升。该检测限比磁珠为基础的荧光法高约2个数量级(1×10-4单位每微升)。
4.DNA结合蛋白特异性检测
为了验证该方法的特异性，我们使用的牛血清白蛋白(BSA)，尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)作为负控制组。如图6所示，加入BSA,UDG和TDG的三组与空白组相同，均未观察到Cy3或Cy5信号。相反，加入hOGG1的实验组观察到显著提高的Cy3信号，加入hAAG的实验组观察到显著提高的Cy5信号，当hOGG1和hAAG均加入，能同时检测到Cy3和Cy5信号。这一结果表明该方法在检测hOGG1和hAAG中该方法具有良好的特异性。
5.抑制剂分析
为了验证该方法在抑制实验的可行性，我们使用二价镉离子作为模型抑制剂。如图7所示，随着镉离子浓度增加，hAAG和hOGG1活性均显著降低。我们使用半数抑制浓度(IC50，将DNA糖基化酶活性抑制为原来50％时所使用抑制剂浓度)来验证二价镉离子对糖基化酶的抑制作用，镉离子对hOGG1单独抑制时， IC50为10.51微摩尔每升，该结果和放射性法检测hOGG1时的半数抑制浓度一致 (约10微摩尔每升)。有趣的是，当hOGG1和APE1同时存在时，镉离子的半数抑制浓度为18.01微摩尔每升，该结果大于hOGG1单独存在时半数抑制浓度。相似的是，当hAAG和APE1同时存在时，镉离子的半数抑制浓度为66.57微摩尔每升，反而低于hAAG单独存在时镉离子的半数抑制浓度(约100微摩尔每升)。这是由于APE1酶是一种镁离子依赖酶，当镉离子存在时，镉离子能够占据镁离子与APE1酶的结合位点，从而导致APE1酶的失活。这一结果清晰表明该方法能够提供一种新的平台用于寻找DNA糖基化酶抑制剂并且能够用于DNA糖基化酶抑制机理研究。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggtctoatgg gggacacgac acccccatca gacc 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctcgiggcag ctcagtacag gaagctgcct cgag 34
Claims (5)
1.一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括：hOGG1分子信标、hAAG分子信标和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶；
其中，所述hOGG1分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hOGG1的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团I和淬灭基团I标记；所述hOGG1的识别位点为8-羟基鸟嘌呤/胞嘧啶碱基对；
所述hAAG分子信标为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有hAAG的识别位点；所述分子信标的茎结构两个末端分别用荧光基团II和淬灭基团II标记；所述hAAG的识别位点为脱氧次黄嘌呤/胸腺嘧啶碱基对；
所述hOGG1分子信标长度为34 nt，所述hOGG1分子信标的碱基序列为：5'-Cy3-GGT CTO ATG GGG GAC ACG ACA CCC CCA TCA GAC C-BHQ2-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hOGG1分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基O即8-羟基鸟嘌呤，所述hOGG1分子信标5'端标记有荧光基团Cy3，3'端标记有淬灭基团BHQ2；
所述hAAG分子信标长度为34 nt，所述hAAG分子信标的碱基序列为： 5'-Cy5-CTC GIG GCA GCT CAG TAC AGG AAG CTG CCT CGA G- BHQ3-3'，其中下划线标出的碱基序列即为hAAG分子信标茎结构碱基序列，下划线标出的碱基I即脱氧次黄嘌呤，所述hAAG分子信标5'端标记有荧光基团Cy5，3'端标记有淬灭基团BHQ3。
2.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光基团I与荧光基团II为两个发射光谱之间没有明显光谱重叠和串扰的荧光基团。
3.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光基团I为Cy3，所述淬灭基团I为BHQ2淬灭剂；所述荧光基团II为Cy5，所述淬灭基团II为BHQ3淬灭剂。
4.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器，其特征在于，所述hOGG1分子信标和hAAG分子信标茎结构碱基序列长度均为12~13个碱基。
5.权利要求1-4任一项所所述荧光化学传感器和在筛选hOGG1/或hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
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