CN108315421B - 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法 - Google Patents

恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108315421B
CN108315421B CN201810300609.9A CN201810300609A CN108315421B CN 108315421 B CN108315421 B CN 108315421B CN 201810300609 A CN201810300609 A CN 201810300609A CN 108315421 B CN108315421 B CN 108315421B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
hrca
cag
reaction
texas red
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810300609.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108315421A (zh
Inventor
张春阳
胡娟
刘明昊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Normal University
Original Assignee
Shandong Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Normal University filed Critical Shandong Normal University
Priority to CN201810300609.9A priority Critical patent/CN108315421B/zh
Publication of CN108315421A publication Critical patent/CN108315421A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108315421B publication Critical patent/CN108315421B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了检测一种细胞中miRNA含量的检测方法，通过联合超支化滚环扩增(HRCA)和量子点(QD)的荧光共振能量转移(FRET)的技术手段，解决了同时检测细胞中miR‑21和miR‑221两种miRNA的技术问题，具有检测快捷灵敏的技术效果。本发明相应的保护一种基于FRET的纳米荧光化学传感器、一种检测方法及相关应用。该传感器包括miR‑21和miR‑221的环形模板、Bst DNA聚合酶、dNTPs、用于HRCA反应的反向引物、捕获探针、链霉亲和素量子点的525QD、Cy3和Texas Red标记的报告探针。该检测方法通过HRCA反应将细胞中miR‑21和miR‑221的信号放大，HRCA产物与捕获探针及报告探针发生杂化反应，通过链霉素亲和素‑生物素的作用，形成525QD‑DNA‑Cy3/Texas Red纳米结构，从而使QD和受体之间产生有效FRET，通过测量荧光强度从而测定miR‑21和miR‑221的含量。

Description

恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种 MicroRNAs的方法
技术领域
本发明涉及MicroRNA含量检测领域，具体涉及一种同时检测癌细胞中miR-21和miR-221含量的方法。
背景技术
MicroRNAs(miRNA)是一种非编码的，小的内源性的RNA，能够抑制信使RNA(mRNAs)的翻译，并降解mRNAs，迄今为止，人们已经鉴别的人体中miRNAs超过1000种，其中，超过300种以人类基因组为目标进行调控。MiRNAs在细胞发育、分化、增殖、凋亡，新陈代谢，形态发生以及造血等众多生理过程发挥重要的作用。MiRNAs表达形式的改变是所有人类肿瘤的普遍特征。更重要的是，特定miRNAs的增加或者缺失能够起到致癌基因或肿瘤抑制的作用。因此，miRNA能够成为具备诊断和预后双重价值的潜在生物标志物。同时灵敏的检测多种miRNAs能够促进早期临床诊断。然而，由于miRNAs极其微小，体外存活时间短，同家族不同个体之间相似性极高，并且在人类全部RNA中丰度极低，灵敏的检测miRNAs始终是一个巨大的挑战。
检测miRNAs方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)，RNA印迹法，微列阵和新一代基因测序技术，生物发光，分子信标，电化学，拉曼光谱，水凝胶微粒发光传感器等方法。
qRT-PCR是测量miRNAs的标准方法，该技术高灵敏度，良好特异性，宽动态范围并能用于绝对定量。但该技术需要精细昂贵的探针设计(如双重荧光标记的探针(Taqman)和锁核酸(LNA))，高精度的热循环，以及耐热性的DNA聚合酶。RNA印迹法在miRNA检测中表现良好，但该技术需要大量miRNA样品，并且灵敏度不佳。微列阵具有高通量和低花费等直接优点，但该技术灵敏度低，并涉及复杂的数据分析。新一代基因测序技术能够定量评估miRNA表达，但是其涉及大量计算支持并且缺乏绝对量化的能力。同时，其他的技术也存在诸多的局限性，比如生物发光时间极短，需合成昂贵的荧光标记的探针，信号较不稳定，需要背景分离从而消除干扰，需要微粒合成步骤。为了提高检测灵敏度，人们在检测miRNAs时引入了诸多扩增策略，比如：滚环扩增(RCA)，指数扩增反应(EXPAR)，链置换扩增(SDA)等。其中，恒温RCA采用短miRNAs作为模板连接锁式探针，能够检测灵敏检测miRNAs，并能使用探针设计识别单个碱基序列差异。尽管上述方法拥有高扩增效率，但是上述方法存在只能检测一种miRNA，或者检测多种RNA时需额外的模板以及设计的探针，因此，成本低廉且具有高灵敏性的同时检测多种miRNAs始终是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明提供了一种结合超支化滚环扩增(HRCA)和量子点(QD)的荧光共振能量转移(FRET)，并以单色量子点做供体，传递两种不同受体的方式同时检测多种miRNAs。HRCA反应产物能够杂化捕获探针与报告探针(花菁3(Cy3)与德克萨斯红(Texas Red)标记的探针)从而形成生物素化的标记受体杂交产物，从而使受体能够聚集到QD表面，使QD和受体之间能够有效发生FRET。本发明使用miR-21和miR-221作为模型miRNA，此两种miRNA能够在众多癌症中表达并发挥致癌基因的作用。HRCA反应对miR21和miR221使用相同的反向引物，并能在恒温下进行。本发明设计使用miR-21和miR221作为模型miRNA，并设计了能够分别杂化这两种miRNA的模板，并用于引发HRCA反应。HRCA产物为不同长度的大量单链DNA，能够杂交大量捕获探针和受体标记的报告探针。随后加入链霉亲和素包裹的525QD，经过链霉亲和素-生物素(biotin)相互作用，形成QD-DNA-受体纳米结构，从而使QD和受体之间产生有效FRET。本发明研究过程中，检验了单个QD对多个受体的相互作用，并表明单个量子点作为能量供体结合两个受体用于同时检测不同细胞系中内源性的miR-21和miR-221。Cy3能够指示miR-21的存在，Texas Red能够指示miR-221的存在。该技术具备操作简单，成本低廉的显著优势。并且miR-21与miR-221的HRCA反应产物能特异杂交同一种捕获探针。该技术具有高灵敏度和选择性，miR-21和miR-221的检测限分别为7.2×10-16和1.6×10-17摩尔每升。
针对以上技术方案，本发明的目的之一在于提供一种基于FRET的纳米荧光化学传感器，该荧光化学传感器能够同时检测miR-21和miR-221。
所述传感器包括miR-21和miR-221的环形模板、Bst DNA聚合酶、dNTPs、用于HRCA反应的反向引物、捕获探针、链霉亲和素包裹的硒化镉/硫化锌核/壳量子点的525QD、Cy3和Texas Red标记的报告探针。
进一步的，所述适用于miR-21的环模板碱基序列为：5′-CAG AAC AGC ACA AGACAG GAC AAG ACA CAC GCC GAA TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT ACC AGA CAG ACG A-3′；
所述适用于miR-221的环模板(环模板-221)碱基序列为：5′-CAG AAC AGC ACAAGA CAG GAC AAG ACA CAC GCC GAA GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTC CAG ACA GACGA-3′；
所述用于HRCA反应的反向引物碱基序列为：5′-GAC AGA CGA CAG AAC AG-3′；
所述捕获探针碱基序列为：5′-biotin-GGC GTG TGT CTT GTC CTG-3′；
Cy3标记的报告探针碱基序列为：5′-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-Cy3-3′；
Texas Red标记的报告探针碱基序列为：5′-AGC TAC ATT GTC TGC TGG GTT TC-Texas Red-3′。
优选的，Cy3用于指示miR-21的存在，Texas Red用于指示miR-221的存在。
本发明的目的之二在于提供一种同时检测细胞样品中miR-21和miR-221的含量的方法，通过HRCA反应将细胞中miR-21和miR-221的信号放大，HRCA产物与捕获探针及报告探针发生杂化反应，通过链霉素亲和素-生物素的作用，形成QD-DNA-受体纳米结构，从而使QD和受体之间产生有效FRET，通过荧光光谱仪测量荧光强度从而确定细胞中miR-21和miR-221的含量，miR-21和miR-221的HRCA反应在同一反向引物的作用下发生，HRCA产物能特异性的与相同的捕获探针结合。
进一步的，用于HRCA反应的反向引物碱基序列为：5′-GAC AGA CGA CAG AAC AG-3′，所述捕获探针的碱基序列为：5′-biotin-GGC GTG TGT CTT GTC CTG-3′。
进一步的，上述检测方法的具体步骤如下：
MiRNA提取和实际样品分析：在RPMI 1640培养基中培养人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)，人胚胎肾细胞系(HEK293T细胞)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，培养基中加入10％胎牛血清。培养基置于37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养。细胞的总RNA由microRNA提取试剂盒提取，并用于实际样品分析。
HRCA反应：10纳摩尔每升miR-21环模板和10纳摩尔每升miR-221环模板混合物。100纳摩尔每升反向引物，适当浓度目标RNA在含有20毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔每升氯化钾，10毫摩尔每升硫酸胺，2毫摩尔每升硫酸镁，0.1％吐温-100，pH为8.8的缓冲液中，95℃加热5分钟，随后缓慢冷却至室温。随后加入8单位Bst DNA聚合酶，200微摩尔每升dNTPs和16单位RNA酶抑制剂至总体积为20微升。上述溶液在60℃反应一小时，随后在80℃反应20分钟终止反应。
凝胶成像：向HRCA产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，将混合物分别加入2％琼脂糖凝胶的上样孔中，凝胶放入1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，在110V电压下室温电泳50分钟。最后通过凝胶成像仪对扩增反应产物进行凝胶成像。
荧光检测：向HRCA产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，荧光信号使用荧光光谱仪测量，激发波长为495nm。信噪比((F-F0)/F0)值用于优化实验条件，F为存在miRNA的HRCA反应产物进行DNA染色后在540nm处的荧光强度，F0为不存在miRNA的HRCA反应产物进行DNA染色后在540nm处的荧光强度。
杂化反应与荧光检测：20微升HRCA反应产物，0.3微升20微摩尔每升的Cy3和/或Texas Red标记的报告探针和0.3微升20微摩尔每升的生物素化的捕获探针加入到含有100毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔每升硫酸胺，3毫摩尔每升氯化镁，pH为8.0的缓冲液中，至终体积为78微升。上述混合物在95℃反应五分钟，后在45℃反应1小时，随后冷却至室温。最后向上述混合物加入2微升0.2微摩尔每升的链霉亲和素包裹的525QD致终体积80微升。在室温下反应15分钟。使用荧光光谱仪测量荧光信号，激发波长为405nm。Cy3能够指示miR-21的存在，Texas Red能够指示miR-221的存在。FRET效率根据公式E＝1-FDA/FD计算，FD为受体不存在时的QD荧光强度，FDA为受体存在时的QD荧光强度。
MiR-21在乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，结肠癌，肺癌，肝癌，脑癌，食道癌，前列腺癌以及甲状腺癌中过表达。MiR-221在恶性胶质瘤，前列腺癌，胰腺癌，肝癌以及甲状腺癌中过表达。相应的，本发明还保护上述纳米荧光化学传感器在制备癌症检测试剂盒中的应用，以及所述癌症检测试剂盒在检测方法中的应用。
本发明的有益效果
1.操作简单，成本低廉。不同的miRNA引发的HRCA反应能够在恒温下反应；对不同的miRNA使用同一种反向引物进行扩增；并且不同miRNA的HRCA反应产物能特异杂交同一种捕获探针；以同一种单色量子点做为能量供体，传递两种不同受体的方式检测，与以前的使用多种能量供体并多种能量受体的方法相比更为简单有效。
2.灵敏度高，miR-21和miR-221的检测限分别为7.2×10-16和1.6×10-17摩尔每升。
3.特异性好，能够区别单碱基错配。
4.为同时检测实际样品中细胞内的多种miRNA提供了研究思路。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：本发明技术方案机理图。
图2：HRCA产物电泳结果及HRCA产物荧光强度图。
(A)HRCA产物琼脂糖凝胶电泳结果。
M为DNA marker。带1为环模板-21。带2为miR-21+环模板-21。带3为miR-221+环模板-21。带4为环模板-221。带5为miR-221+环模板-221。带6为miR-21+环模板-221。带7为环模板-21+环模板-221。带8为miR-21+miR-221+环模板-21+环模板-221。
(B)环模板-21存在下HRCA产物荧光测量。c线：环模板-21。b线：环模板-21+miR-21。a线：环模板-21+miR-221。
(C)环模板-221存在下HRCA产物荧光测量。c线：环模板-221。b线：环模板-221+miR-221。a线：环模板-221+miR-21。
(D)环模板-21与环模板-221存在下HRCA产物荧光测量。b线：环模板-21+环模板-221。a线：环模板-21+miR-21+环模板-221+miR-221。
图3：525QD和Cy3、Texas Red的发射图谱。
(A)525QD和Cy3发射图谱测量。a线：miR-21不存在。b线：miR-21存在。插图为两者的独立光谱。
(B)525QD和Texas Red发射图谱测量。a线：miR-221不存在。b线：miR-221存在。
图4：HRCA反应的单因素考察结果图。
(A)在495nm激发波长下，不同环模板浓度的信噪比。
(B)不同反向引物浓度的信噪比。
(C)不同dNTPs浓度的信噪比。
(D)不同反应温度的信噪比。MiRNA浓度为10纳摩尔每升。误差线表示三次独立实验的标准偏差。图5：FRET效率图。
405nm激发波长下，525QD/Cy3系统中，Cy3标记的报告探针：525QD浓度不同比例的FRET效率。捕获探针与报告探针比例为1:1。误差线表示三次独立实验的标准偏差。
图6：miR-21产生的Cy3荧光强度及miR-221产生的Texas Red荧光强度图。
(A)测量不同浓度miR-21产生的Cy3荧光强度，左图表明FRET效率和miR-21浓度的对数形式呈线性关系。
(B)测量不同浓度miR-221产生的Texas Red荧光强度，右图表明FRET效率和miR-221浓度的对数形式呈线性关系。所有实验525QD浓度均为5纳摩尔每升。误差线表示三次实验标准差。
图7：荧光强度测量结果图。
(A)使用miR-21环模板测量miR-21，RNA-1，miR-221，let-7a和空白组的Cy3荧光强度。
(B)使用miR-221环模板测量miR-221，RNA-2，miR-21，let-7a和空白组的TexasRed荧光强度。误差线表示三次实验标准偏差。
图8：样品中miR-21与miR-221的荧光强度图。
同时检测miR-21与miR-221。MiR-21和miR-221浓度均为0.1微摩尔每升。误差线表示三次实验标准偏差。
图9：细胞提取物中miR-21和miR-221的测量浓度图。
(A)细胞提取物样品中miR-21测量结果。
(B)细胞提取物样品中miR-221测量结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例一
MiRNA提取和实际样品分析：在RPMI 1640培养基中培养人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)，人胚胎肾细胞系(HEK293T细胞)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，培养基中加入10％胎牛血清。培养基置于37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养。细胞的总RNA由microRNA提取试剂盒提取，并用于实际样品分析。
HRCA反应：10纳摩尔每升miR-21环模板和10纳摩尔每升miR-221环模板混合物，100纳摩尔每升反向引物，适当浓度目标RNA在含有20毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔每升氯化钾，10毫摩尔每升硫酸胺，2毫摩尔每升硫酸镁，0.1％吐温-100，pH为8.8的缓冲液中，95℃加热5分钟，随后缓慢冷却至室温。随后加入8单位Bst DNA聚合酶，200微摩尔每升dNTPs和16单位RNA酶抑制剂至总体积为20微升。上述溶液在60℃反应一小时，随后在80℃反应20分钟终止反应。
凝胶成像：向HRCA产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，将混合物分别加入2％琼脂糖凝胶的上样孔中，凝胶放入1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，在110V电压下室温电泳50分钟。最后通过凝胶成像仪对扩增反应产物进行凝胶成像。
荧光检测：向HRCA产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，荧光信号使用荧光光谱仪测量，激发波长为495nm。信噪比((F-F0)/F0)值用于优化实验条件，F为存在miRNA的HRCA反应产物进行DNA染色后在540nm处的荧光强度，F0为不存在miRNA的HRCA反应产物进行DNA染色后在540nm处的荧光强度。
杂化反应与荧光检测：20微升HRCA反应产物，0.3微升20微摩尔每升的Cy3和/或Texas Red标记的报告探针和0.3微升20微摩尔每升的生物素化的捕获探针加入到含有100毫摩尔每升Tris-HCl，10毫摩尔每升硫酸胺，3毫摩尔每升氯化镁，pH为8.0的缓冲液中，至终体积为78微升。上述混合物在95℃反应五分钟，后在45℃反应1小时，随后冷却至室温。最后向上述混合物加入2微升0.2微摩尔每升的链霉亲和素包裹的525QD致终体积80微升。在室温下反应15分钟。荧光信号使用荧光光谱仪测量，激发波长为405nm。Cy3和Texas Red在复合谱中的独立贡献被用于分析。FRET效率根据公式E＝1-FDA/FD计算，FD为受体不存在时的QD荧光强度，FDA为受体存在时的QD荧光强度。
结果讨论与分析
1.HRCA反应的特异性的验证
本发明使用琼脂糖凝胶电泳和荧光测量确认HRCA反应产物。如图2A所示，当miR-21，miR-221均不存在时，只能观察到一个环模板带(条带1、4、7)，表明HRCA反应没有发生。相反，当miR-21和环模板-21存在时，能观察到具有不同分子量的明显条带(条带2)，当miR-221和环模板-221存在时，能观察到具有不同分子量的明显条带(条带5)。当miR-21和环模板-221存在时，观察不到新条带(条带6)；当miR-221和环模板-21存在时，观察不到新条带(条带3)。这一结果证明，只有目标miRNA与特定的环模板相结合才能引发HRCA反应。另外，当miR-21，miR-221，环模板-21，环模板-221四者同时存在时，能观察到一个具有不同分子量的清晰带条(条带8)。
随后，测量染有SYBR Gold荧光指示剂的HRCA产物的荧光光谱。SYBR Gold荧光指示剂能够染色体系中说有核酸。荧光检测结果和琼脂糖凝胶电泳一致(图2B-D)。当只有环模板和反向引物存在时，只能观察到一个低的荧光信号(图2B c线，图2C c线，图2D b线)。相反，当miR-21和环模板-21存在时，能观察到一个提高的荧光信号(图2B b线)。类似的，当miR-221和环模板-221存在时，也能观察到一个提高的荧光信号(图2C b线)。另外，当miR-21和环模板-221存在时(图2C a线)以及miR-221和环模板-21存在(图2B a线)只能观察到一个低的荧光信号。这一结果同样证明，只有目标miRNA与特定的环模板相结合才能引发HRCA反应。另外，当miR-21，miR-221，环模板-21，环模板-221四者同时存在时，能观察到一个提高的荧光信号(图2D a线)，该荧光信号是miR-21+环模板-21(图2B b线)以及miR-221+环模板-221(图2C b线)信号的综合。这表明该技术所使用的环模板不会互相干扰并能用于同时检测miRNAs。
2.确认以HRCA媒介的FRET
本发明首先通过miR-21引发的HRCA验证525QD和Cy3之间的FRET，当miR-21不存在时，无法观察到Cy3信号(图3A a线)，这表明525QD和Cy3没有发生FRET，这是因为Cy3标记的报告探针在没有HRCA反应产物的情况下无法组装到525QD表面。与此相反，当miR-21存在时，QD信号降低，Cy3信号升高(图3A b线)。
随后，通过miR-221引发的HRCA验证525QD和Texas Red之间的FRET，当miR-221不存在时，无法观察到Texas Red信号(图3B a线)，这表明525QD和Texas Red没有发生FRET，这是因为Texas Red标记的报告探针在没有HRCA反应产物的情况下无法组装到525QD表面。与此相反，当miR-221存在时，QD信号降低，Texas Red信号升高(图3B b线)。这些结果清晰证明了miRNA引发的HRCA能介导QD供体和荧光染料受体之间的FRET。
3.优化实验条件
为了得到最佳的HRCA反应结果，本发明优化了环模板，反向引物，dNTPs浓度和反应温度四个变量。如图4A所示，随着环模板浓度由0.2纳摩尔每升增加到10纳摩尔每升，信噪比值随之增加，随着环模板浓度大于10纳摩尔每升，信噪比随之减少。因此，HRCA反应最佳环模板浓度为10纳摩尔每升。如图4B所示，随着反向引物浓度由10纳摩尔每升增加到100纳摩尔每升，信噪比值随之增加，随着反向引物浓度大于100纳摩尔每升，信噪比随之减少。因此，HRCA反应最佳反向引物浓度为100纳摩尔每升。如图4C所示，随着dNTPs浓度由2微摩尔每升增加到200微摩尔每升，信噪比值随之增加，随着dNTPs浓度大于200微摩尔每升，信噪比随之减少。因此，HRCA反应最佳dNTPs浓度为200微摩尔每升。如图4D所示，随着反应温度由55℃增加到60℃，信噪比值随之增加，随着反应温度大于60℃，信噪比随之减少。因此，HRCA反应最佳反应温度为60℃。
随后，以Cy3为模板优化了受体对供体的比例以确保HRCA媒介的FRET效率达到最大。如图5所示，随着Cy3：QD比例从1:1增加到15:1，FRET效率逐渐增加，随着Cy3：QD比例大于15:1，FRET效率降低。因此，采用受体：供体比例为15:1。
4.灵敏度检测
为了说明该技术检测miR21和miR221灵敏度，本发明在优化的实验条件下测得的不同浓度的miRNAs对应的荧光强度和FRET效率。如图6A所示，随着miR21浓度从0增加到1×10-7摩尔每升，Cy3荧光强度也不断增加。在对数尺度，FRET效率和miR21浓度从1×10-15摩尔每升到1×10-11摩尔每升呈线性关系(图A插入图)。回归方程为N＝41.48+1.37log10C(R2＝0.990)，计算得到检测限为7.2×10-16摩尔每升。如图6B所示，随着miR221浓度从0增加到1×10-7摩尔每升，Texas Red荧光强度也不断增加。在对数尺度，FRET效率和miR221浓度从1×10-16摩尔每升到1×10-12摩尔每升呈线性关系(图B插入图)。回归方程为N＝44.38+1.27log10C(R2＝0.993)，计算得到检测限为1.6×10-17摩尔每升。该技术所展现出的灵敏度相比于基于FRET的固化QD的方法提高了7个数量级(10纳摩尔每升)，比基于Q-STAR探针的滚环扩增方法提高了5个数量级(0.2纳摩尔每升)，比荧光标记的肽核酸和基于氧化石墨烯的滚环扩增方法提高了两个数量级(0.4皮摩尔每升)，比基于金银纳米探针的表面增强拉曼散射方法提高了一个数量级(10飞摩尔每升)。
5.特异性检测
为了验证该方法的特异性，本发明使用单碱基错配RNA1，RNA2，let-7a以及两种miRNA作为负控制组。RNA1碱基序列为：5′-UAG CUU AUC ACA CUG AUG UUG A-3′，与miR-21仅有一个碱基的区别。RNA2碱基序列为：5′-AGC UAC AUU GUC GGC UGG GUU UC-3′，与miR-221仅有一个碱基的区别。let-7a碱基序列为：5′-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3′。如图7A所示，当环模板21存在时，miR21有明显的的荧光信号。而RNA1，miR221，let-7a以及空白组均观察到较低荧光信号。值得注意的是，miR-21的荧光信号分别是空白组，miR221，let-7a以及RNA1信号的7.1、6.8、6.9以及4.4倍。如图7B所示，当环模板221存在时，miR221有明显的的荧光信号。而RNA2，miR21，let-7a以及空白组均观察到较低荧光信号。值得注意的是，miR-21的荧光信号分别是空白组，miR21，let-7a以及RNA1信号的9.3、7.9、9.2以及4.7倍。这一结果清晰表明该技术具备高选择性并能够区别单碱基错配。
6.同时检测多种miRNAs
为了验证该方法能够同时检测多种miRNAs，测量在环模板-21和环模板-221存在下，miR-21和miR-221的混合物。如图8所示，当miR-21存在时，只能观察到高Cy3信号而无法观察到Texas Red信号。当miR-221存在时，只能观察到高Texas Red信号而无法观察到Cy3信号。只有miR-21和miR-221两者同时存在时，能同时观察到高Cy3信号和高Texas Red信号。这一结果清晰证明该技术在同时检测多种miRNAs方面的可行性。
7.实际样品检测
为了验证该技术在实际样品方面的应用，本发明检测了MCF-7，HEK293T，和Hela细胞中miR-21和miR-221。发明人从MCF-7，HEK293T，和Hela细胞全部RNA提取物中分别取10纳克。并用0纳克作为控制组。根据图6校正曲线求得miR-21与miR-221浓度。MCF-7样品得到Cy3信号远高于控制组，并且在MCF-7，miR-21为高表达，miR-221为低表达(图9)，这一结果和基于生物发光的杂交法以及微列阵检测方法一致。同时miR-221在HEK293T细胞中表达高于miR-21。另外，在Hela细胞中，miR-21表达远高于miR-221。另外，发明人使用同样的样品通过qRT-PCR这一方法进行检测并与该技术作比较，如图9所示，本发明得到的结果和qRT-PCR方法得到的结果一致。这一结果清晰证明本发明技术方案能够用于实际样品检测。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方
法
<130> 2010
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagaacagca caagacagga caagacacac gccgaatcaa catcagtctg ataagctacc 60
agacagacga 70
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagaacagca caagacagga caagacacac gccgaagaaa cccagcagac aatgtagctc 60
cagacagacg a 71
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacagacgac agaacag 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcgtgtgtc ttgtcctg 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctacattg tctgctgggt ttc 23

Claims (3)

1.一种基于FRET的纳米荧光化学传感器，其特征在于，所述传感器包括miR-21和miR-221的环形模板、Bst DNA聚合酶、dNTPs、用于HRCA反应的反向引物、捕获探针、链霉亲和素包裹的硒化镉/硫化锌核/壳量子点的525QD、Cy3和Texas Red标记的报告探针；适用于miR-21的环形模板碱基序列为：
5 ′-CAG AAC AGC ACA AGA CAG GAC AAG ACA CAC GCC GAA TCA ACA TCA GTC TGATAAGCT ACC AGA CAG ACG A-3′；适用于miR-221的环形模板碱基序列为：5 ′-CAG AAC AGCACA AGA CAG GAC AAGACA CAC GCC GAA GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTC CAG ACAGAC GA-3′；所述用于HRCA反应的反向引物碱基序列为：5′-GAC AGA CGA CAG AAC AG-3′；
所述捕获探针碱基序列为：5′-biotin-GGC GTG TGT CTT GTC CTG-3′；
Cy3标记的报告探针碱基序列为：5′-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-Cy3-3′；
Texas Red标记的报告探针碱基序列为：5′-AGC TAC ATT GTC TGC TGG GTT TC-TexasRed-3′。
2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，Cy3用于指示miR-21的存在，Texas Red用于指示miR-221的存在。
3.权利要求1或2所述的纳米荧光化学传感器在制备检测miR-21、miR-221的试剂盒中的应用。
CN201810300609.9A 2018-04-04 2018-04-04 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法 Active CN108315421B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810300609.9A CN108315421B (zh) 2018-04-04 2018-04-04 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810300609.9A CN108315421B (zh) 2018-04-04 2018-04-04 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108315421A CN108315421A (zh) 2018-07-24
CN108315421B true CN108315421B (zh) 2021-06-25

Family

ID=62897300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810300609.9A Active CN108315421B (zh) 2018-04-04 2018-04-04 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108315421B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110243792A (zh) * 2019-06-11 2019-09-17 山东师范大学 一种基于量子点和四面体dna结构的荧光化学传感器及其检测方法和应用
CN110398481B (zh) * 2019-07-25 2022-05-27 山东师范大学 一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用
CN111909932B (zh) * 2020-07-17 2023-06-20 南方医科大学 一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用
CN111999504B (zh) * 2020-08-10 2021-09-28 江南大学 一种粘蛋白1及其唾液酸糖基的双重荧光成像方法及应用
CN112280830B (zh) * 2020-11-18 2022-04-08 福州大学 一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法
CN113462753B (zh) * 2021-06-25 2023-04-11 山东师范大学 点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用
CN115452787A (zh) * 2022-09-22 2022-12-09 山东理工大学 银纳米簇和金钯纳米粒子构建荧光传感器测牛奶中链霉素

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2689029A1 (en) * 2011-03-22 2014-01-29 Life Technologies Corporation Identification of linkage using multiplex digital pcr
CN103555838A (zh) * 2013-10-31 2014-02-05 深圳先进技术研究院 一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒
CN103834719A (zh) * 2012-11-28 2014-06-04 深圳先进技术研究院 miRNA检测探针及miRNA的扩增检测方法
WO2015196120A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Somagenics, Inc. Methods and compositions for detecting polynucleotides and fragments thereof
CN107723338A (zh) * 2017-10-27 2018-02-23 山东师范大学 一种在单分子水平同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101292536B1 (ko) * 2005-12-21 2013-08-07 삼성전자주식회사 바이오 메모리 디스크 및 바이오 메모리 디스크 드라이브장치 및 이를 이용한 분석 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2689029A1 (en) * 2011-03-22 2014-01-29 Life Technologies Corporation Identification of linkage using multiplex digital pcr
CN103834719A (zh) * 2012-11-28 2014-06-04 深圳先进技术研究院 miRNA检测探针及miRNA的扩增检测方法
CN103555838A (zh) * 2013-10-31 2014-02-05 深圳先进技术研究院 一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒
WO2015196120A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Somagenics, Inc. Methods and compositions for detecting polynucleotides and fragments thereof
CN107723338A (zh) * 2017-10-27 2018-02-23 山东师范大学 一种在单分子水平同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xue Qiu 等.Rapid and Multiplexed MicroRNA Diagnostic Assay Using Quantum Dot-Based Förster Resonance Energy Transfer.《ACS Nano》.2015,第9卷(第8期),第8449-8457页. *
利用超分支滚环扩增技术检测miR-21;郭仲莉 等;《第三军医大学学报》;20140821;第36卷(第18期);第1964页左栏第3段至第1965页左栏第2段、表1、图1-2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108315421A (zh) 2018-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108315421B (zh) 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法
Hu et al. Integration of isothermal amplification with quantum dot-based fluorescence resonance energy transfer for simultaneous detection of multiple microRNAs
de Planell-Saguer et al. Analytical aspects of microRNA in diagnostics: a review
Yan et al. A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs
Jin et al. A Rapid, Amplification‐Free, and Sensitive Diagnostic Assay for Single‐Step Multiplexed Fluorescence Detection of MicroRNA
Wang et al. MnO2 nanosheet-mediated ratiometric fluorescence biosensor for MicroRNA detection and imaging in living cells
Goryacheva et al. Luminescent quantum dots for miRNA detection
Gilboa et al. Single-molecule analysis of nucleic acid biomarkers–A review
Zeng et al. A quantum dot-based microRNA nanosensor for point mutation assays
CN110398481B (zh) 一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用
Cui et al. Signal-on electrogenerated chemiluminescence biosensor for ultrasensitive detection of microRNA-21 based on isothermal strand-displacement polymerase reaction and bridge DNA-gold nanoparticles
JP2007535928A (ja) 染色体異常の検出
Wang et al. Target-assisted FRET signal amplification for ultrasensitive detection of microRNA
Wang et al. A copper-free and enzyme-free click chemistry-mediated single quantum dot nanosensor for accurate detection of microRNAs in cancer cells and tissues
Zhang et al. Construction of a dual-functional dumbbell probe-based fluorescent biosensor for cascade amplification detection of miRNAs in lung cancer cells and tissues
Marín-Romero et al. A PCR-free technology to detect and quantify microRNAs directly from human plasma
EP2949759A1 (en) Multiplexed homogeneous oligonucleotide detection
Chinnappan et al. Highly sensitive multiplex detection of microRNA by competitive DNA strand displacement fluorescence assay
CN110878356A (zh) 一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用
Li et al. DNA polymerase/NEase-assisted signal amplification coupled with silver nanoclusters for simultaneous detection of multiple microRNAs and molecular logic operations
Peng et al. A versatile single-molecule counting-based platform by generation of fluorescent silver nanoclusters for sensitive detection of multiple nucleic acids
Zhang et al. One-step self-assembly of quantum dot-based spherical nucleic acid nanostructure for accurate monitoring of long noncoding RNA MALAT1 in living cells and tissues
Joo et al. Highly selective FRET-aided single-molecule counting of microRNAs labeled by splinted ligation
Zhang et al. Mismatched fluorescent probes with an enhanced strand displacement reaction rate for intracellular long noncoding RNA imaging
CN106841135B (zh) 一种通过荧光法同时检测多种miRNA的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant