CN113088557B - 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用 - Google Patents

一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、两种或两种以上DNA糖基化酶识别序列、报告探针；所述双链DNA底物包括用于识别一种或多种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对。基于荧光化学传感器的信号放大技术可实现对多种DNA糖基化酶的超灵敏检测。

Description

一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测 方法和应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，其分子结构的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常生理活动的发挥具有重要意义。然而在日常生活中，紫外线、电离辐射、化学诱变剂、活性氧自由基等内源性及外源性理化因素的影响持续威胁着基因组DNA的稳定，产生各种各样的DNA损伤，包括碱基的缺失、插入、替换，DNA链断裂及交联等。这些损伤如果不被及时修复，很可能会干扰细胞的正常生理功能，导致细胞衰老、凋亡以及癌变等。为维持基因组DNA的稳定与完整，细胞在进化中形成了一系列损伤修复机制来识别和修复受损的DNA分子，例如碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、同源重组以及非同源末端连接等。碱基切除修复在DNA碱基发生自氧化、脱氨基、甲基化和脱嘌呤等损伤后被激活，并由DNA糖基化酶引发。DNA糖基化酶识别受损碱基，通过DNA链的局部扭曲而使受损碱基突出，之后水解受损碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键，除去受损碱基，从而产生无嘌呤/无嘧啶位点。大量研究表明，DNA糖基化酶的表达异常会引起碱基切除修复的功能障碍，最终导致各种疾病，例如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等。典型的例子包括肺癌患者外周血单核细胞中人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)过量表达，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性异常与人类免疫缺陷和癌症密切相关。
实现多种DNA糖基化酶的同时、超灵敏检测对于准确评估疾病发生几率，疾病早期诊断、治疗及分子机制的研究具有十分重要的意义。传统的检测方法包括凝胶电泳(gelelectrophoresis)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱/同位素稀释串联质谱(LC-MS/MS)，放射性标记(radiolabeling)，蛋白质印记(western blot)，酶联免疫吸附(ELISA)等。
发明人研究现有检测技术后发现，凝胶电泳(gel electrophoresis)灵敏度低，且无法准确定量。高效液相色谱(HPLC)和液相色谱/同位素稀释串联质谱(LC-MS/MS)仪器昂贵，且通常会由于操作过程中对碱基造成的人工损坏而导致高的背景信号。而酶联免疫吸附(ELISA)需要昂贵的特异性抗体和复杂的样品处理过程，且多步洗涤过程对样品造成的损耗会导致测定值偏低。为克服这些问题，一些新的DNA糖基化酶测定方法，例如比色法，发光法，电化学法和荧光方法被开发出来。然而，它们也都存在一些无法避免的缺点。比色法简单易行，但仅适用于成分相对简单、显色不易被干扰的体系。发光法，电化学法和荧光法分析速度快、选择性好、可用于准确定量，但灵敏度不高限制了它们在低浓度复杂样品中的应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提出一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。在荧光化学传感器中设计一种具有多种DNA糖基化酶识别位点和信号放大功能的荧光化学传感器，其具有多种DNA糖基化酶识别位点，3'末端修饰NH2，可有效防止非特异性扩增；紧密相邻的BHQ1/Cy3和BHQ2/Cy5碱基对使淬灭基团和荧光基团之间具有较高的FRET效率，从而导致较高的信噪比，并基于荧光化学传感器的信号放大技术实现对多种DNA糖基化酶的超灵敏检测，hAAG检出限为3.39×10-12UμL-1，UDG检出限为4.05×10-12UμL-1，因此具有良好的实际应用之价值。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、两种或两种以上DNA糖基化酶识别序列、报告探针；
所述双链DNA底物包括用于识别一种或多种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对。
本发明第二方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，包括：将多种DNA糖基化酶识别序列与被荧光基团修饰的报告探针在缓冲液中加热进行反应，冷却后形成同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器。
本发明第三方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器在DNA糖基化酶中的应用。
本发明第四方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的方法，所述方法包括：
1)将待测样品和同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器混合反应；
2)将步骤1)产物加入无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Nb.BtsI切刻酶，进行反应。
本发明第五方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器和/或同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法和/或同时检测多种DNA糖基化酶的方法在DNA糖基化酶活性检测和/或筛选DNA糖基化酶药物中的应用。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
1)本发明提供了一种单分子检测与碱基切除修复诱导的链置换扩增辅助信号放大相结合的方法，用于多种DNA糖基化酶的快速、同时、超灵敏检测。该方法简单快速，反应在等温条件下进行，无需繁琐的操作步骤、热循环仪器以及复杂的分离程序等。
2)本发明设计了一种双功能双链DNA探针，即同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其3'末端修饰NH2，可有效防止非特异性扩增；紧密相邻的BHQ1/Cy3和BHQ2/Cy5相连碱基序列杂交形成的碱基对使淬灭基团和荧光基团之间具有较高的FRET效率，从而导致较高的信噪比，提高了检测灵敏度。
3)本发明提供的荧光化学传感器灵敏度高、特异性好，hAAG检出限为3.39×10-12UμL-1。与靶标介导的基于超支化扩增的荧光检测方法(9×10-5UμL-1)和碱基切除修复介导的级联三重信号放大荧光方法(2.6×10-5UμL-1)相比提高了7个数量级，与基于分子信标裂解的荧光方法(8.69×10-7UμL-1)相比提高了5个数量级，UDG检出限为4.05×10-12UμL-1。与基于人工荧光碱基类似物的荧光方法(2.5×10-6UμL-1)相比提高了6个数量级，辅助双环级联信号放大的荧光测定(1×10-7UμL-1)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和T7核酸外切酶(T7Exo)辅助的基于回收扩增的荧光测定(1.5×10-7UμL-1)方法相比提高了5个数量级，与基于磁分离的荧光测定法(1.736×10-8UμL-1)相比提高了4个数量级。
4)本发明提供的荧光化学传感器或制备方法或检测方法即使在单细胞水平上也可用于实际样品中多种DNA糖基化酶的灵敏定量，在早期临床诊断中具有巨大潜力。此外，荧光化学传感器或制备方法或检测方法可用于酶动力学参数的测定和DNA糖基化酶抑制剂的筛选，在生物医学研究，药物发现和临床诊断中具有巨大的应用潜力。更重要的是，通过简单地改变DNA底物中的识别位点，可以将提出的方法应用于其它类型DNA糖基化酶的分析。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：本发明实施例1的原理图。基于单分子检测与碱基切除修复启动的链置换扩增相结合同时检测多种DNA糖基化酶的示意图。该测定方法包括三个连续步骤：(1)DNA糖基化酶诱导的受损碱基切除修复，(2)双向链置换扩增反应诱导的报告基因探针的释放，以及(3)荧光分子的单分子检测。
图2：本发明实施例2(A)DNA糖基化酶诱导的链置换扩增反应的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。泳道1，1微摩尔双链DNA底物+0.1UμL-1hAAG+0.1UμL-1UDG+0.2UμL-1APE1+2.5UμL-1KF聚合酶；泳道2，1微摩尔双链DNA底物+0.2UμL-1APE1+2.5UμL-1KF聚合酶；泳道3，1微摩尔双链DNA底物+0.1UμL-1hAAG+0.2UμL-1APE1+2.5UμL-1KF聚合酶；泳道4，1微摩尔双链DNA底物+0.1UμL-1UDG+0.2UμL-1APE1+2.5UμL-1KF聚合酶。
(B)在0.1UμL-1hAAG存在(灰色)和不存在(黑色)的情况下测量Cy3荧光发射光谱。
(C)分别在0.1UμL-1UDG的存在(灰色)和不存在(黑色)下测量Cy5荧光发射光谱。
(D)分别在存在和不存在0.1UμL-1hAAG和0.1UμL-1UDG的情况下测量Cy3和Cy5荧光发射光谱。
图3：本发明实施例2不同双功能双链DNA探针浓度下F/F0值的差异。
图4：本发明实施例2不同APE1量下F/F0值的差异。
图5：本发明实施例2在固定量的Nb.BtsI(1U)情况下，不同量Klenow片段聚合酶的F/F0值的差异。
图6：本发明实施例2在固定量的Klenow片段聚合酶(2.5U)情况下，不同量Nb.BtsI的F/F0值的差异。
图7：本发明实施例2(A)Cy3计数对应不同浓度hAAG的响应。插图显示Cy3计数与hAAG浓度的对数之间在1×10-11至1×10-3UμL-1范围内呈线性相关。
(B)Cy5计数对应不同浓度UDG的响应。插图显示Cy5计数与UDG浓度的对数之间在1×10-11至1×10-3UμL-1范围内呈线性相关。双功能双链DNA探针的浓度为1微摩尔，APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
图8：本发明实施例2响应0.1UμL-1hAAG+0.1UμL-1UDG，0.1UμL-1hAAG，0.1UμL-1UDG，0.1UμL-1hOGG1、0.1UμL-1Fpg，0.1mg mL-1IgG，0.1mg mL-1BSA和仅含反应缓冲液的对照组的Cy3计数和Cy5计数。双功能双链DNA探针的浓度为1微摩尔，APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
图9：本发明实施例2(A)在存在0.1UμL-1hAAG的情况下，初始速度(V)随双功能双链DNA探针浓度的变化。
(B)在存在0.1UμL-1UDG的情况下，初始速度(V)随双功能双链DNA探针浓度的变化。APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
图10：本发明实施例2(A)0.1UμL-1hAAG的相对活性响应不同浓度的CdCl2。
(B)0.1UμL-1UDG的相对活性响应不同浓度的CdCl2。双功能双链DNA探针的浓度为1微摩尔，APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
图11：本发明实施例2响应A549细胞，HeLa细胞，SW480细胞，HL-7702细胞，HEK-293细胞和灭活的A549细胞(103个细胞)提取物的Cy3计数和Cy5计数。双功能双链DNA探针的浓度为1微摩尔，APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
图12：本发明实施例2(A)Cy3计数与A549细胞数的对数之间的线性关系。
(B)Cy5计数与A549细胞数对数之间的线性关系。双功能双链DNA探针的浓度为1微摩尔，APE1的浓度为0.2UμL-1。误差棒显示三个实验的标准偏差。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，现有DNA糖基化酶检测普遍存在操作复杂、成本高、耗时长、灵敏度较差等缺点。因此本发明提出一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用，实现对多种DNA糖基化酶的超灵敏检测。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、两种或两种以上DNA糖基化酶识别序列、报告探针；
所述双链DNA底物包括用于识别一种或多种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对。
所述DNA糖基化酶识别序列也可以称为DNA糖基化酶探针。
DNA糖基化酶识别序列用于特异性识别DNA糖基化酶，在双链DNA底物中使用被荧光基团修饰的报告探针，可在识别DNA糖基化酶后发生一系列反应，使得传感器对待识别物产生荧光效果。荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对可以使淬灭基团和荧光基团之间具有较高的FRET效率，从而导致较高的信噪比，提高了检测灵敏度。
在本发明一个或多个实施例中，所述双链DNA底物中，其中一条链中具有用于识别一种或多种DNA糖基化酶识别序列，另一条链上具有识别另一种或多种DNA糖基化酶识别序列；
将不同的DNA糖基化酶识别序列分设在不同DNA链上，可以实现多种DNA糖基化酶的识别与荧光效应，扩大适用范围。
优选地，所述双链DNA底物5'末端分别修饰BHQ1和BHQ2淬灭基团，3'末端修饰NH2。
优选地，所述荧光基团包括Cy3和Cy5，优选为Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针分别与连有BHQ1和BHQ2淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ1与Cy3邻近，BHQ2与Cy5邻近。
也就是说，Cy3标记的报告探针与连有BHQ1淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ1与Cy3邻近。
Cy5标记的报告探针与连有BHQ2淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ2与Cy5邻近。
3'末端修饰NH2以防止非特异性扩增，5'末端分别修饰BHQ1和BHQ2淬灭基团，荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对，这样设计可以使得报告探针不与3'末端连接，为后续NA糖基化酶特异性识别DNA糖基化酶识别序列，形成无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，进而AP核酸内切酶1(APE1)可以裂解AP位点生成游离的3'-OH末端，具有游离的3'-OH末端的DNA片段可以用作引发聚合反应延伸的引物，在DNA聚合酶和dNTPs的存在下发生聚合反应。引物的延伸导致荧光基团标记的报告探针从双链DNA底物上释放，从而导致荧光基团标记的报告探针与淬灭基团分离，恢复荧光做准备。
在本发明一个或多个实施例中，所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG；
DNA糖基化酶作用是特异性识别荧光化学传感器中的DNA糖基化酶碱基对，并催化水解，形成无嘌呤/无嘧啶(AP)位点。
当所述DNA糖基化酶为UDG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ1-GCT CGT CAC TGTCCT AGC AGT GAG ATA GAG CTC TGA GAATCT ACG TAC UTC CA-NH2-3'；
当所述DNA糖基化酶为hAAG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ2-GTG CAC TCGATC GCA GGC AGT GAG CAA TGG AAG TAC GTAGAT TCT CAG IGC TC-NH2-3'；
优选地，所述UDG识别序列和hAAG识别序列位于双链DNA底物的不同链上。
本发明公开了一种基于链置换扩增辅助信号放大同时测定hAAG和UDG活性的单分子检测方法。具有以下明显优势：
(1)双功能双链DNA探针在3'端修饰NH2，与高精确度的KF聚合酶相结合，可有效防止非特异性扩增。
(2)双功能荧光探针设计非常简单，仅由四个线性DNA寡核苷酸构成。
(3)紧密相邻的BHQ1/Cy3和BHQ2/Cy5使淬灭基团和荧光基团之间具有较高的FRET效率，从而导致较高的信噪比。
(4)等温信号放大策略避免了对热循环仪器的需求。
(5)双向链置换扩增反应的高效率诱导了大量Cy5报告探针和Cy3报告探针的释放，从而可以高灵敏地同时检测多种DNA糖基化酶。
利用链置换扩增的高效率，新型设计的淬灭基团/荧光基团标记的双功能双链DNA探针的高淬灭效率以及单分子检测的高信噪比，该方法可以同时检测多个DNA糖基化酶，检测限为UDG为4.05×10-12UμL-1，hAAG为3.39×10-12UμL-1。该方法的灵敏度优于已报道的基于分子信标裂解的荧光测定法和基于磁分离的荧光测定法。该方法还可用于区分正常细胞与癌细胞，甚至可以在单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种DNA糖基化酶。此外，该方法可用于酶动力学参数的测定和DNA糖基化酶抑制剂的筛选，在生物医学研究，药物发现和临床诊断中具有巨大的应用潜力。重要的是，通过简单地改变DNA底物中的识别位点，可以将提出的方法应用于其它类型DNA糖基化酶的分析。
在本发明一个或多个实施例中，所述荧光化学传感器还包括酶和缓冲液；
优选地，所述酶包括无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、dNTPs和Nb.BtsI切刻酶、Klenow片段DNA聚合酶。
所述无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶为AP核酸内切酶1，作用是剪切掉DNA5'端脱嘌呤和脱嘧啶位点，裂解AP位点生成游离的3'-OH末端。
所述DNA聚合酶和dNTPs作用是以游离的3'-OH末端的DNA片段为引物引发聚合反应延伸。
所述Nb.BtsI切刻酶作用是切割带有完整识别位点的DNA双链体，生成触发探针1和游离的3'-OH末端。
所述Klenow片段聚合酶属于DNA聚合酶的一种，作用是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTPs等的情况下)及其相辅的活性。
本发明第二方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，包括：将多种DNA糖基化酶识别序列与被荧光基团修饰的报告探针在缓冲液中加热进行反应，冷却后形成同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器。
优选地，所述每种DNA糖基化酶识别序列和被荧光基团修饰的报告探针浓度为10μM/L；
优选地，所述加热温度为80-100℃，保温5-10分钟，优选为95℃保温5分钟。
本发明第三方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器在DNA糖基化酶中的应用。
优选的，所述DNA糖基化酶至少为两个；
所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG。
本发明第四方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的方法，所述方法包括：
1)将待测样品和同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器混合反应；
2)将步骤1)产物加入无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、DNA聚合酶、dNTPs、入Nb.BtsI切刻酶，进行反应。
在本发明一个或多个实施例中，所述检测方法还包括采用荧光检测系统测定荧光信号，从而实现对DNA糖基化酶的定量检测。
在本发明一个或多个实施例中，当同时检测的DNA糖基化酶为UDG和hAAG时，
所述步骤1)中反应具体条件为：在35-40℃下反应0.5-2小时，优选为在37℃下反应1小时；
所述步骤2)中反应具体条件为：先在35-40℃中反应1-3小时后，再于70-90℃下保温15-30分钟终止反应，优选为先在37℃中反应2小时后，再于80℃下保温20分钟终止反应。
在该过程中，主要发生DNA糖基化酶诱导的碱基切除反应和链置换扩增反应。
本发明第五方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器和/或同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法和/或同时检测多种DNA糖基化酶的方法在DNA糖基化酶活性检测和/或筛选DNA糖基化酶药物中的应用。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。实施例中使用的核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0002996644630000101
I代表次黄嘌呤，U代表脱氧尿嘧啶，带下划线的区域表示hAAG或UDG的识别位点。
药品及材料
所有寡核苷酸均由上海生工生物技术有限公司(中国，上海)合成。人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，人嘌呤/嘧啶核糖核酸内切酶1(APE1)，Klenow片段DNA聚合酶(3'→5'exo-)，Nb.BtsI切刻内切酶，人8-氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶1(hOGG1)，甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG)，脱氧核糖核苷5'-三磷酸混合物(dNTPs)，10×NEB缓冲液4(500毫摩尔乙酸钾，200毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-乙酸，100毫摩尔醋酸镁，10毫摩尔二硫苏糖醇，pH 7.9)，10×UDG反应缓冲液(200毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，10毫摩尔二硫苏糖醇，10毫摩尔乙二胺四乙酸，pH 8)，10×NEB缓冲液2(500毫摩尔氯化钠，100毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，100毫摩尔氯化镁、10毫摩尔二硫苏糖醇，pH 7.9)，10×Cutsmart缓冲液(500毫摩尔乙酸钾，200毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-乙酸，100毫摩尔乙酸镁、100微克每毫升牛血清白蛋白(BSA)，pH 7.9)从新英格兰生物实验室(伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)购买。人肺腺癌细胞系(A549细胞)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，人结肠癌细胞(SW480细胞)，人胚肾细胞系(HEK-293细胞)和人肝细胞系(HL-7702细胞)购自中国科学院细胞研究所(中国，上海)。氯化铬(II)(CdCl2)，免疫球蛋白G(IgG)和牛血清白蛋白(BSA)购自西格玛奥德里奇公司(圣路易斯，密苏里揍，美国)。SYBRGold从赛默飞世尔公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)购买。所有其他试剂均为分析级，无需进一步纯化即可直接使用。超纯水通过微孔滤膜过滤系统(微孔，米尔福德，美国)制备。
实施例1
1、双功能双链DNA探针的制备。
将10微摩尔hAAG探针，10微摩尔UDG探针，10微摩尔Cy3标记的报告探针和10微摩尔Cy5标记的报告探针在10×NEB缓冲液4(500毫摩尔乙酸钾，200毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-乙酸，100毫摩尔醋酸镁，10毫摩尔二硫苏糖醇，pH 7.9)于95℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温以形成双功能双链DNA探针。获得的双功能双链DNA探针在4℃下保存备用。
2、DNA糖基化酶诱导的碱基切除反应和链置换扩增反应。
DNA糖基化酶诱导的碱基切除反应在10微升反应体系中进行，该反应体系中包含1微摩尔双功能双链DNA探针，1×NEB缓冲液4、1×UDG反应缓冲液，2U APE1和不同浓度的hAAG和UDG，在37℃下孵育1小时。然后将0.5毫摩尔dNTPs，1×NEB缓冲液2，1×Cutsmart缓冲液，5U Klenow片段聚合酶和2U Nb.BtsI切刻内切酶添加到反应溶液中，最终体积为20微升，在37℃中孵育2小时后，于80℃下20分钟终止反应。
3、凝胶电泳和荧光测量。
在1×TBE缓冲液(9毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，9毫摩尔硼酸，0.2毫摩尔乙二胺四乙酸，pH 8.3)中，以1×SYBR Gold作为荧光指示剂，在室温、110伏恒定电压下，用14％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析链置换扩增反应产物。凝胶通过伯乐ChemiDocMP成像系统(赫尔克里石，加利福尼亚，美国)进行分析。Cy3和Cy5的荧光光谱通过HitachiF-7000荧光光谱仪(东京，日本)测量，分别记录550至750纳米和650至750纳米内的发射光谱，激发狭缝和发射狭缝均设置为5纳米，在570纳米和665纳米的发射波长处的荧光强度用于数据分析。
4、单分子检测和数据分析。
反应产物用成像缓冲液(10毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，50毫摩尔氯化钾，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸，pH 8.0)稀释，10微升样品滴在载玻片上进行成像。通过全内反射荧光(TIRF)显微镜(尼康，Ti-E，日本)获取单个分子的图像。561纳米和640纳米的激光分别用于激发Cy3和Cy5荧光分子。用油浸式100倍物镜收集光子，然后用二向色镜将其分成Cy3通道(573-613纳米滤光片)和Cy5通道(661.5-690.5纳米滤光片)，最后成像到EMCCD相机(Photometrics，Evolve 512)上。使用ImageJ软件选择了600×600像素的区域用于Cy3和Cy5荧光分子计数。通过计算十帧的平均值获得平均计数。
5、抑制剂实验。
为研究氯化铬(ΙΙ)对hAAG和UDG活性的影响，不同浓度的氯化铬(ΙΙ)，0.1UμL- 1hAAG和0.1UμL-1UDG与37℃中孵育15分钟，然后进行如上所述的DNA糖基化酶诱导的碱基切除反应和链置换扩增反应。根据等式(1)测量DNA糖基化酶的相对活性(RA)：
Figure BDA0002996644630000121
其中N0是不存在DNA糖基化酶(即hAAG和UDG)的情况下Cy3/Cy5的计数，Nt在存在DNA糖基化酶的情况下Cy3/Cy5的计数，Ni是在存在DNA糖基化酶和不同浓度氯化铬(ΙΙ)的情况下的Cy3/Cy5计数。从DNA糖基化酶相对活性(RA)对氯化铬(ΙΙ)浓度的曲线计算出IC50值。
6、细胞培养和酶提取。人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，人肺腺癌细胞系(A549细胞)，人结肠癌细胞系(SW480细胞)，人胚肾细胞系(HEK-293细胞)和人正常肝细胞(HL-7702细胞)获自中国科学院上海生物科学研究所细胞库(中国，上海)。所有细胞在添加了10％胎牛血清(FBS，Gibco，GrandIsland，NY，USA)和1％青霉素-链霉素(California，CA，USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco，GrandIsland，USA)，37℃，含有5％二氧化碳的湿润培养箱中培养。通过Countstar细胞计数仪(IC 1000，Inno-Alliance Biotech Inc.，Wilmington，DE，USA)对细胞数进行计数。使用裂解缓冲液(10毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，150毫摩尔氯化钠，1％(w/v)乙基苯基聚乙二醇，0.25毫摩尔脱氧胆酸钠，1％(w/v)甘油和0.1毫摩尔4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，pH 8.0)制备细胞提取液，离心所得的上清液用于DNA糖基化酶活性测定。
实验原理(如图1)
以UDG和hAAG为例解释本发明一个或多个实施例同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的原理和工作过程：
两条距离3'-末端第5个碱基处分别修饰有一个尿嘧啶碱基(U)和一个次黄嘌呤碱基(I)的UDG识别序列和hAAG识别序列。UDG识别序列和hAAG识别序列所在DNA链上的5'末端分别修饰BHQ1和BHQ2淬灭基团，3'末端修饰NH2以防止非特异性扩增。Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针分别与连有BHQ1和BHQ2淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ1与Cy3邻近，BHQ2与Cy5邻近，Cy3和Cy5的荧光可被BHQ1和BHQ2通过荧光共振能量转移(FRET)淬灭。UDG识别序列、hAAG识别序列、Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针杂交从而形成双功能双链DNA探针。
同时检测多种DNA糖基化酶的方法包括三个连续步骤：(1)DNA糖基化酶诱导的受损碱基切除修复，(2)双向链置换扩增反应诱导的报告基因探针的释放，以及(3)荧光分子的单分子检测。
hAAG可以特异性识别双功能双链DNA探针中的I/T碱基对，并催化脱氧核糖和次黄嘌呤碱基之间的N-糖苷键的水解，释放次黄嘌呤碱基形成无嘌呤/无嘧啶(AP)位点。随后，AP核酸内切酶1(APE1)可以裂解AP位点生成游离的3'-OH末端。具有游离的3'-OH末端的DNA片段可以用作引发聚合反应延伸的引物，在DNA聚合酶和dNTPs的存在下发生聚合反应。引物的延伸导致Cy3标记的报告探针从双功能双链DNA探针上释放，从而导致Cy3标记的报告探针与BHQ1淬灭基团分离，恢复Cy3荧光，同时产生具有Nb.BtsI切刻酶识别位点的完整DNA双链体。Nb.BtsI切刻酶可以切割带有完整识别位点的DNA双链体，生成触发探针1和游离的3'-OH末端，在聚合酶的协同作用下启动新的聚合-切割循环，从而生成大量触发探针1。释放的触发探针1可以进一步与新的双功能双链DNA探针杂交，从而诱导更多Cy3标记的报告探针的释放。类似地，UDG可以特异性识别双功能双链DNA探针中的尿嘧啶碱基，并切割脱氧核糖和尿嘧啶碱基之间的N-糖苷键，产生一个AP位点。随后，双功能双链DNA探针中的AP位点被APE1裂解，带有游离3'-OH末端的新DNA片段可随后引发链置换扩增反应，诱导产生更多的触发探针2和Cy5标记的报告探针的释放。释放的触发探针2可以与新的双功能双链DNA探针杂交，以释放越来越多的Cy5标记的报告探针。释放出的Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针可以通过单分子检测同时定量，其中Cy3荧光信号指示hAAG的活性，Cy5荧光信号指示UDG的活性。相反，在不存在hAAG和UDG的情况下，次黄嘌呤碱和尿嘧啶碱基均不能被去除，无法引发链置换扩增反应。结果，Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针都不能被释放，从而不能检测到Cy3和Cy5荧光信号。
实施例2
1、实验方法的可行性验证
利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，图2A)和荧光测量(图2B-D)，以验证所提出方法的可行性。在存在hAAG的情况下，观察到Cy3标记的报告探针形成的一条独特的12碱基明显条带(图2A，泳道3，最下方的箭头所指区域)，表明hAAG介导的碱基去除和链置换扩增反应诱导的Cy3报告探针的释放。同样，在存在UDG的情况下，观察到Cy5标记的报告探针形成的一条独特的12碱基带(图2A，泳道4，中间箭头所指区域)，表明UDG介导的碱基去除和链置换扩增反应诱导的Cy5报告探针的释放。当同时存在hAAG和UDG时，可以观察到Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针的条带(图2A，泳道1)，表明hAAG和UDG可以有效切割双功能双链DNA探针以诱导双功能链置换扩增反应，释放Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针。相反，在没有hAAG和UDG的情况下，只能观察到原始双功能双链DNA探针的一个条带(图2A，泳道1)，这表明在DNA糖基化酶不存在的情况下，受损的碱基不能被去除。我们进一步测量了荧光光谱，以验证所提出的方法用于多种DNA糖基化酶测定的可行性(图2B，C和D)。在存在hAAG的情况下，观察到具有562纳米特征发射峰的Cy3荧光信号(图2A，最下方的箭头所指区域)，但未观察到Cy5荧光信号。相反，在没有hAAG的情况下，未观察到明显的Cy3荧光信号(图2A，最上方的箭头所指区域)。在存在UDG的情况下，仅观察到具有665纳米特征发射峰的Cy5荧光信号(图2B，中间箭头所指区域)，但未观察到明显的Cy3荧光信号。相反，在没有UDG的情况下，没有观察到明显的Cy5信号(图2B，黑线)。当同时存在hAAG和UDG时，会同时观察到明显的Cy3(图2D，最下方的箭头所指区域)和Cy5荧光信号(图2D，中间箭头所指区域)。这些结果表明，该方法可用于同时检测hAAG和UDG。
2、优化实验条件
为获得最佳的实验效果，本实施例优化了实验条件，包括双功能双链DNA探针的浓度，Nb.BtsI、Klenow片段聚合酶和APE1的用量。双功能双链DNA探针的浓度是影响链置换扩增反应扩增效率和报告探针释放量的关键因素。一方面，高浓度双功能双链DNA探针可导致高的链置换扩增效率，但也可能会增加链置换扩增的背景信号。另一方面，低浓度双功能双链DNA探针可以降低背景信号，但可能会导致低扩增效率。因此，应优化双功能双链DNA探针的浓度。如图3所示，F/F0值随着双功能双链DNA探针浓度的增加而增加，并在1微摩尔浓度时达到平稳，其中F和F0分别为存在和不存在DNA糖基化酶时的单分子计数。因此，在后续研究中使用了1微摩尔双功能双链DNA探针。
APE1用于切割双功能双链DNA探针中的AP位点，从而引发链置换扩增反应。因此，需要优化APE1的量。如图4所示，随着APE1的量从0.5U增加到2U，F/F0值增加，在2U APE1处获得最高的F/F0值，其中F和F0分别是存在和不存在DNA糖基化酶时的单分子计数。因此，在后续研究中使用了2U的APE1。
在该测定法中，链置换扩增反应依赖于Klenow片段聚合酶和Nb.BtsI切刻酶的协同作用，因此应仔细优化Klenow片段聚合酶和Nb.BtsI的量。我们首先固定Nb.BtsI的量(1U)研究了Klenow片段聚合酶对荧光信号的影响。如图5所示，F/F0值随着Klenow片段聚合酶的用量从1U到2.5U的增加而增加，并在2.5U达到平稳，其中F和F0分别是存在和不存在DNA糖基化酶的单分子计数。因此，在随后的研究中使用了2.5U的Klenow片段聚合酶。我们进一步固定Klenow片段聚合酶的量(2.5U)，研究了Nb.BtsI对荧光信号的影响。如图6所示，在2U的Nb.BtsI处获得最大F/F0值，其中F和F0分别是存在和不存在DNA糖基化酶的单分子计数。因此，在后续研究中使用了2U的Nb.BtsI。
3、检测灵敏度
在最佳实验条件下，通过测量不同浓度DNA糖基化酶的单分子计数来评估实验方法的灵敏度。如图7A所示，随着hAAG浓度从1×10-11增加到0.1UμL-1，Cy3计数逐渐增加。在对数尺度上，Cy3计数与hAAG浓度在1×10-11至1×10-3UμL-1的8个数量级上呈线性相关。回归方程为N＝310.53+25.03log10 C(R2＝0.9961)，其中N为Cy3计数，C为hAAG的浓度。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算检出限为3.39×10-12UμL-1。与靶标介导的基于超支化扩增的荧光检测方法(9×10-5UμL-1)和碱基切除修复介导的级联三重信号放大荧光方法(2.6×10-5UμL-1)相比提高了7个数量级，与基于分子信标裂解的荧光方法(8.69×10-7UμL-1)相比提高了5个数量级。图7B显示了Cy5荧光计数随UDG浓度的变化。Cy5计数随着UDG浓度从1×10-11到0.1UμL-1的增加而增加。在对数尺度上，Cy5计数与UDG浓度在1×10-11至1×10-3UμL-1的8个数量级上呈线性关系。回归方程为N＝427.20+35.17log10 C(R2＝0.9975)，其中N为Cy5计数，C为UDG的浓度。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算检出限为4.05×10-12UμL-1。与基于人工荧光碱基类似物的荧光方法(2.5×10-6UμL-1)相比提高了6个数量级，辅助双环级联信号放大的荧光测定(1×10-7UμL-1)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和T7核酸外切酶(T7 Exo)辅助的基于回收扩增的荧光测定(1.5×10-7UμL-1)方法相比提高了5个数量级，与基于磁分离的荧光测定法(1.736×10-8UμL-1)相比提高了4个数量级。灵敏度的提高可能归因于(1)链置换扩增诱导大量报告探针的释放；(2)新设计的淬灭基团/荧光基团标记的双功能双链DNA探针的高淬灭效率，以及(3)单分子检测的高信噪比。
4、检测特异性
为了研究该方法对hAAG和UDG的选择性，使用了人8-氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶1(hOGG1)，甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG)，牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)作为干扰。BSA和IgG不能识别和切除DNA中的受损碱基。hOGG1和Fpg都可以通过碱基切除修复识别并去除8-氧代鸟嘌呤(8-oxoG)和2,6-二氨基-4-氧代-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)DNA损伤，但是它们不能识别和切割本研究中的双功能双链DNA探针。在hOGG1，FPG，BSA和IgG的存在下，都无法观察到Cy3和Cy5荧光信号，与只有反应缓冲液的对照组结果相同。在存在hAAG的情况下，仅观察到Cy3荧光信号(图8)。当存在UDG时，仅观察到Cy5荧光信号。当同时存在hAAG和UDG时，可以同时检测Cy3和Cy5荧光信号。这些结果清楚地表明，所提出的方法对hAAG和UDG具有良好的特异性。
5、动力学分析
本实施例进一步使用该方法在单分子水平上评估DNA糖基化酶的动力学参数。为了评估hAAG和UDG的酶动力学参数，分别在存在0.1UμL-1hAAG和0.1UμL-1UDG的情况下测量了初始速度(V)，响应不同浓度的双功能双链DNA探针(0至300纳摩尔)在37℃下孵育5分钟。如图9所示，hAAG(图9A)和UDG(图9B)的初始速度随着双功能DNA底物浓度的增加而增加。实验数据符合Michaelis-Menten方程，V＝Vmax[S]/(Km+[S])，其中Vmax是最大初始速度，[S]是分子信标的浓度，而Km是Michaelis-Menten常数对应于最大速度一半时的浓度。hAAG的Vmax评估为31.78每分钟，Km计算为26.87纳摩尔，与通过基于分子信标裂解的荧光测定法(20.68纳摩尔)获得结果相一致。UDG的Vmax评估为52.63每分钟和Km的计算值为65.62纳摩尔，与通过基于滚环扩增的单分子检测方法获得的结果(68.10纳摩尔)一致。这些结果表明，该方法可用于准确评估DNA糖基化酶的动力学参数。
6、抑制剂分析
本实施例进一步以镉离子(Cd2+)作为模型抑制剂来证明所提出的方法进行DNA糖基化酶抑制试验的可行性。如图10所示，当hAAG和UDG的浓度固定在0.1UμL-1时，hAAG和UDG的相对活性随Cd2+浓度从0增加到500微摩尔而降低。IC50定义为抑制酶活性50％所需的抑制剂浓度。根据hAAG相对活性与Cd2+浓度拟合的校准曲线(图10A)，在APE1存在下，hAAG的IC50值计算为65.06微摩尔，与基于分子信标裂解的荧光方法计算的IC50值(66.57微摩尔)相一致。根据UDG相对活性与Cd2+浓度拟合的校准曲线(图10B)，在APE1存在的情况下，UDG的IC50值计算为48.05微摩尔，与基于滚环扩增的荧光测定法计算的IC50值为(54.81微摩尔)一致。结果表明，所提出的方法可用于筛选DNA糖基化酶抑制剂，在药物开发中具有很大的潜力。
7、实际样品分析
为了进一步研究该方法在复杂生物样品中的潜在应用，本实施例同时测量了hAAG和UDG在不同细胞系中的活性，包括人肺腺癌细胞系(A549细胞)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，人结肠癌细胞(SW480细胞)，人肝细胞系(HL-7702细胞)和人胚胎肾细胞系(HEK-293细胞)。如图11所示，在正常细胞系(即HL-7702细胞和HEK-293细胞)中，未测量到明显的Cy3和Cy5信号，表明正常细胞中DNA糖基化酶的活性低。相反，在癌细胞系(即A549细胞，HeLa细胞和SW480细胞)中，观察到明显的Cy3和Cy5信号，这与人癌细胞中DNA糖基化酶的过表达相符。这些结果证明了所提出的方法对细胞内干扰具有良好的耐受性，可用于准确定量不同细胞系中的hAAG和UDG活性。
本实施例进一步研究了Cy3/Cy5计数随A549细胞数量的变化。对于hAAG，Cy3计数随A549细胞数量的增加而升高，并且Cy3计数与A549细胞数的对数在1到1000个细胞范围内线性相关(图12A)。回归方程为N＝60.87+94.68log10X(R2＝0.9959)，其中N是Cy3计数，X是A549细胞数。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算检出限为1个细胞，优于先前报道的基于分子信标裂解的荧光测定法(9个细胞)。对于UDG，Cy5计数随A549细胞数量的增加而增加，并且Cy5计数与A549细胞数量的对数之间在1到1000个细胞范围内具有良好的线性相关性(图12B)。回归方程为N＝73.12+95.61log10 X(R2＝0.9964)，其中N是Cy3计数，X是A549细胞数。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算检出限为1个细胞，优于先前报道的基于酶辅助双环级联信号放大的荧光测定法(3个细胞)。这些结果证明了所提出的方法即使在单细胞水平上也可用于实际样品中多种DNA糖基化酶的灵敏定量，在早期临床诊断中具有巨大潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用
<130> 202121868
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 53
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<212> DNA
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acagtgacga gc 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatcgagtgc ac 12

Claims (10)

1.检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、报告探针、酶、缓冲液和dNTPs；
所述双链DNA底物包括用于识别两种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对；
所述双链DNA底物中，其中一条链中具有用于识别一种DNA糖基化酶识别序列，另一条链上具有识别另一种DNA糖基化酶识别序列；
所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG；
当所述DNA糖基化酶为UDG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ1-GCT CGT CAC TGT CCTAGC AGT GAG ATA GAG CTC TGA GAA TCT ACG TAC UTC CA-NH2-3'，U代表脱氧尿嘧啶；
当所述DNA糖基化酶为hAAG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ2-GTG CAC TCG ATCGCA GGC AGT GAG CAA TGG AAG TAC GTA GAT TCT CAG IGC TC-NH2-3'，I代表次黄嘌呤；
所述双链DNA底物3'末端修饰NH2；
所述双链DNA底物5'末端分别修饰BHQ1和BHQ2淬灭基团；
所述荧光基团包括Cy3和Cy5，Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针分别与连有BHQ1和BHQ2淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ1与Cy3邻近，BHQ2与Cy5邻近；
Cy3标记的报告探针的碱基序列为ACA GTG ACG AGC-Cy3；
Cy5标记的报告探针的碱基序列为GAT CGA GTG CAC-Cy5；
所述酶包括脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、Nb.BtsI切刻酶和Klenow片段DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述UDG识别序列和hAAG识别序列位于双链DNA底物的不同链上。
3.权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括：
将一种DNA糖基化酶识别序列和另一种DNA糖基化酶识别序列，与被荧光基团修饰的报告探针在缓冲液中加热进行反应，冷却后形成同时检测两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器；
所述每种DNA糖基化酶识别序列和被荧光基团修饰的报告探针浓度为10µM/L；
所述加热温度为80-100℃，保温5-10分钟。
4.根据权利要求3所述的检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，所述加热温度为95℃，所述保温5分钟。
5.权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器在非疾病诊断目的的DNA糖基化酶检测中的应用；
所述DNA糖基化酶至少为两个；
所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG。
6.一种非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）将待测样品和权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器混合反应；
2）将步骤1）产物加入脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Nb.BtsI切刻酶，进行反应。
7.如权利要求6所述非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用荧光检测系统测定荧光信号，从而实现对DNA糖基化酶的定量检测。
8.如权利要求6所述非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，当同时检测的DNA糖基化酶为UDG和hAAG时，
所述步骤1）中反应具体条件为：在35-40℃下反应0.5-2小时；
所述步骤2）中反应具体条件为：先在35-40℃中反应1-3小时后，再于70-90℃下保温15-30分钟终止反应。
9.如权利要求8所述非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述步骤1）中反应具体条件为：在37℃下反应1小时；
所述步骤2）中反应具体条件为：先在37℃中反应2小时后，再于80℃下保温20分钟终止反应。
10.权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器和/或权利要求3所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法获得的荧光化学传感器在和/或权利要求6-9任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的方法在非疾病诊断目的的DNA糖基化酶活性检测和/或筛选DNA糖基化酶药物中的应用。
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