CN113667719B - 基于3′-oh的生成诱导多色荧光编码及高通量检测dna中不同糖苷酶的荧光分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于3′‑OH的生成诱导多色荧光编码高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。该方法操作步骤简单，检测通量高，具有良好的选择性和较高的灵敏度。经实验结果表明，其测定UDG糖苷酶的检测限为5.5×10‑5U/mL,hAAG糖苷酶的检测限为3.3×10‑3U/mL。此外，该方法可用于检测人宫颈癌细胞系和正常人肾上皮细胞种的UDG和hAAG，还可用于评价两种酶的动力学参数。本发明是一种经济、简单、特异、灵敏的高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于3′-OH的生成诱导多色荧光编码及高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。
背景技术
DNA损伤是生命过程中的一个自发过程，将会导致基因组不稳定、发育障碍、过早衰老和/或癌症。不同DNA糖苷酶可发起异常碱基切除修复(base excision repair,BER)，从DNA链中剪除受损碱基，维持基因组的稳定性，预防人类疾病。然而，异常活性的DNA糖苷酶会干扰修复过程，导致各种疾病，如人类免疫缺陷、bloom综合征和癌症。因此，DNA糖苷酶是一类有价值的疾病标志物。最近，越来越多的证据表明，某种特定DNA糖苷酶的异常表达可能与各种疾病有关，或一种疾病可能与几种DNA糖苷酶活性异常有关，例如，DNA糖苷酶在多种人类癌细胞中都有过表达，如人类宫颈癌HeLa、肝癌HepG2、乳腺癌细胞(MCF-7)。具体而言，人类细胞尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)活性异常，可能导致尿嘧啶切除修复功能异常，导致衰老、神经退行性变、癌症等。另一方面，尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)在A549细胞和HeLa细胞中的活性较高。因此，有必要同时对多种DNA糖苷酶进行分析，为癌症的早期诊断和疗效监测提供有力证据。
近年来，已发展了多种检测DNA糖苷酶活性的新方法，如比色法、荧光法和电化学发光法。但方法的灵敏度低，且涂覆电极的过程比较复杂。为提高检测灵敏度，发展了多种等温级联信号扩增方法，如T7外切酶介导信号扩增、TdT聚合酶辅助信号扩增、滚环扩增(RCA)等检测方法，但这些方法只能检测单一DNA糖苷酶。到目前为止，科学家已经开发了几种同时检测多种DNA糖苷酶的方法。例如，Zhang等报道了分别同时检测hOGG1和hAAG、hOGG1和UDG、hAAG和UDG糖苷酶的单分子方法。虽然单分子方法可以同时高灵敏检测多种DNA糖基酶，但单分子仪器价格昂贵，难以大规模推广。现有的荧光分析方法虽然能够同时检测两种DNA糖苷酶的活性，但核酸链设计复杂，引入的lambda核酸外切酶存在非特异性消解，且荧光信号猝灭不完全，导致背景信号高。
为此，我们提出一种经济、简单、特异、灵敏的高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于3′-OH的生成诱导多色荧光编码及高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法，以解决现有DNA糖基酶检测中核酸链设计复杂，引入的lambda核酸外切酶存在非特异性消解，荧光信号猝灭不完全，导致背景信号高的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述3′-OH的生成以及诱导多色荧光编码方法包括以下步骤：
S1:发夹底物DNA、UDG信号探针、hAAG信号探针DNA的选取：
S2:对步骤S1中选取的发夹底物进行DNA的退火；
S3:利用UDG和hAAG分别对退火后的发夹底物中尿嘧啶和次黄嘌呤的特异性识别，切断N-糖苷键从而释放受损碱基，生成AP位点；AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后分别形成两条3′-OH末端的DNA单链；
S4:利用TdT末端转移酶和dTTP对步骤S3中形成的两条DNA单链末端进行延伸，生成聚T核酸链；
S5:Endo IV辅助循环：将步骤S4中形成的两条DNA单链分别与UDG信号探针和hAAG信号探针杂交形成部分互补双链，随后利用Endo IV识别并切割双链上信号探针的AP位点。
进一步地，所述步骤S1中，发夹底物的茎部含有21对完全互补的碱基，环部由12个碱基组成；距离5′端7个碱基的位置为hAAG识别的次黄嘌呤碱基，距离3′末端17个碱基的位置为UDG识别的尿嘧啶碱基。
优选地，所述发夹底物的3′末端用NH2修饰，UDG信号探针的两端分别用FAM和BHQ1标记，中间位置含有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，信号探针可与其对应的延伸产物杂化形成部分互补双链。
优选地，所述hAAG信号探针的两端分别用Cy5和BHQ3标记，中间位置具有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，且信号探针与其对应的延伸产物杂化形成部分互补的双链。
进一步地，所述步骤S5中，对双链上信号探针的AP位点切割后使得FAM和Cy5荧光信号恢复，且释放出与荧光探针互补的DNA延伸产物，释放出的DNA延伸产物继续与新的信号探针杂交形成双链，发生杂交-剪切-释放的循环过程，使得荧光信号增强。
进一步地，所述发夹底物的DNA序列为：CGA TTC GIG GCA GCA ACA GTG GTG CATAGT GGA CAC UGT TGC TGC CTC GAA TCG，其中U和I分别代表尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG的识别位点。
进一步地，所述UDG信号探针的DNA序列为：FAM-AAAAAAAAAXGTGTCCAC-BHQ1，其中X为AP位点。
进一步地，所述hAAG信号探针的DNA序列为：Cy5-AAAAAAAAAXCGAATCG-BHQ3，其中X为AP位点。
进一步地，所述高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法，包括以下步骤：
D1:通过退火制备发夹底物,将发夹底物、ThermoPol缓冲、UDG缓冲、BSA、Endo IV、不同浓度的UDG和hAAG进行混合，在37℃反应90min；
D2:将步骤D1中的部分产物与末端转移酶TdT缓冲、CoCl2、dTTPs、TdT、Endo IV、UDG信号探针和hAAG信号探针进行混合，在37℃反应90min；
D3:将D2中得到的产物分别在490nm和640nm的激发波长下测定荧光强度。
优选地，所述步骤D1中发夹底物DNA的终浓度为100-1000nM，UDG信号探针在缓冲溶液中的终浓度为0.25-0.75μM，且保证hAAG1信号探针在缓冲溶液中的最终浓度为0.75-1.25μM。
优选地，所述步骤D2中，末端转移酶TdT在缓冲液中的最终浓度为100-500U/mL，dTTPs在缓冲液中的最终浓度为500μM，Endo IV在缓冲液中的最终浓度为150-350U/mL。
优选地，所述步骤D2中，末端转移酶TdT催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端，且催化作用不需要模板，UDG催化DNA底物链上的尿嘧啶然后释放尿嘧啶，hAAG催化DNA底物双链上受损碱基位点，hAAG催化N-糖苷键的水解断裂，释放受损碱基，Endo IV是一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶，Endo IV切割双链DNA上完整AP位点的5′端的第一个磷酸二酯键，产生3′羟基和5′脱氧核糖磷酸末端。
进一步地，所述的受损碱基位点包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1，N6-乙烯基腺嘌呤和次黄嘌呤。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益技术效果是：
本发明的有益效果在于检测过程操作简单，可同时高灵敏检测两种DNA糖苷酶。
附图说明
图1：基于TdT激活的EndoIV-辅助的信号扩增方法同时检测UDG和hAAG活性的原理示意图；(A)UDG；(B)hAAG；(C)UDG和hAAG。
图2：可行性分析：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征分析UDG和hAAG糖苷酶活性：(A)：条带1：发夹底物；条带2：发夹底物+hAAG+Endo IV；条带3：发夹底物+UDG+Endo IV；条带4：发夹底物+hAAG+UDG+Endo IV；(B)：条带1：发夹底物；条带2：发夹底物+hAAG+Endo IV+TdT+dTTPs；条带3：发夹底物+UDG+Endo IV+TdT+dTTPs；条带4：发夹底物+hAAG+UDG+EndoIV+TdT+dTTPs；(C)不同条件下检测UDG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在UDG；黑线：不存在UDG；(D)不同条件下检测hAAG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在hAAG；黑线：不存在hAAG；(E)不同条件下检测UDG+hAAG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在UDG+hAAG；黑线：不存在UDG+hAAG。
图3：实验条件优化：(A)末端转移酶TdT用量对F/F0的影响；(B)Endo IV用量对F/F0的影响；(C)扩增反应时间对F/F0的影响(黑线和蓝线表明没有UDG和hAAG；红线和紫线表明存在UDG和hAAG)；(D)UDG信号探针浓度对F/F0的影响；(E)hAAG信号探针浓度对F/F0的影响。
图4：检测UDG和hAAG糖苷酶活性的荧光变化图：(A)不同浓度的UDG对应的荧光光谱图；(B)荧光强度与UDG浓度对数值之间的线性关系；(C)不同浓度的hAAG对应的荧光光谱图；(D)荧光强度与hAAG浓度对数值之间的线性关系。
图5：不同的糖苷酶以及其它蛋白对荧光强度的影响。
图6：酶动力学参数的评价(A)在4U/mL UDG存在下，起始反应速率与底物浓度之间的关系；(B)在8U/mL hAAG存在下，起始反应速率与底物浓度之间的关系。
图7：检测实际样品中UDG和hAAG荧光强度图；(A)检测不同细胞样品中UDG和hAAG糖苷酶活性；(B)荧光强度与Hela细胞核蛋白提取液中总蛋白浓度对数值的线性关系(UDG)；(C)荧光强度与Hela细胞核蛋白提取液中总蛋白浓度对数值的线性关系(hAAG)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实验中用到的试剂和仪器：尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)、人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)、核酸内切酶IV(Endo IV)、10×BSA、10×ThermoPol缓冲(200mM Tris-HCl,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mM MgSO4,1％Triton X-100,pH 8.8),10×TdT缓冲、10×UDG缓冲(200mM Tris-HCl,10mM DTT,10mM EDTA,pH 8.0)均从NEB购买，脱氧核苷酸dTTP和所有的寡核苷酸(见表1)从上海生工购买，SYBR Gold购买于赛默飞世尔科技，实验所需的超纯水都来自于纯水净化系统18202V AXL(重庆，中国)，RF-5301PC型荧光分光光度计(岛津，日本)。
尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG活性分析：
底物DNA链用95℃水浴退火5min，然后自然冷却至室温，最终形成浓度为5μM的双功能发夹底物；在20μL的剪切反应体系中分别加入0.5μM发夹底物，包括1.0mg/mL BSA、10×Thermopol缓冲、10×UDG缓冲、5U Endo IV、不同浓度的UDG和hAAG，在37℃反应90min。然后在20μL的反应体系中，加入4μL的上述剪切产物，包括2μL 10×TdT缓冲、CoCl2、0.55μMUDG信号探针、1.15μM hAAG信号探针、4U Endo IV、10U TdT、dTTPs，在37℃下反应90min。最后在490nm和640nm的激发波长下测定荧光强度。
凝胶电泳分析:
凝胶电泳用于验证该实验方法的可性行。在凝胶电泳分析中，除了4U/mL的UDG和20U/mL的hAAG,剪切反应产物和延伸反应产物样品中所有的成分和上述实验相同。用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(15％丙烯酰胺，1×TBE缓冲，0.1％过硫酸铵和0.2％N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)在1×TBE缓冲液(9mMTris-HCl，9mM硼酸和0.2mM EDTA，pH7.9)中对剪切反应产物和延伸反应产物样品分别进行分离。在室温条件下恒压120V进行40min，以1×SYBR gold为荧光指示剂染色10min。
选择性和特异性分析：
为了考察该分析方法的选择性，选择FPG和FEN1作为干扰物质。选择性实验中除了使用20U/mL的FPG和2.0U/mL的FEN1代替尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG，其余的步骤与上述操作相同。
细胞培养：
HeLa细胞和正常人肾脏上皮细胞293T在DMEM培养基中培养(Invitrogen公司，美国)，然后添加15％胎牛血清(Sigma-Aldrich公司，美国)；最后将细胞在含5％CO2、37℃的环境中培养。培养后用核蛋白提取试剂盒提取总核蛋白(中国Solarbio R0050)，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，获得总蛋白，所得上清液可用于同时检测UDG和hAAG的活性。然后通过BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白含量(P0009，Beyotime Biotech，上海，中国)，在提取的蛋白中加入不同体积的无菌水稀释至所需浓度。最后，将2μL不同浓度的蛋白质与反应液混合进行反应，对真实复杂样品中UDG和hAAG活性进行测定。
实验原理：
(1)所提出的UDG活性检测的原理如图1A所示，分析的过程主要包括3个部分：a.UDG特异性识别发夹底物中的尿嘧啶并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，UDG特异性识别发夹底物双链部分的U碱基，切断N-糖苷键释放出受损碱基，生成AP位点，AP位点被Endo IV特异性识别并切割，产生3′-OH末端的核酸链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸进行延伸反应。最后，延伸产物与UDG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上UDG信号探针的AP位点，释放FAM荧光信号。该过程反复循环，使得荧光信号不断增强。
(2)所提出的hAAG活性检测的原理如图1B所示，分析过程主要包括3个部分：a.hAAG特异性识别发夹底物中次黄嘌呤并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，hAAG特异性识别发夹底物双链部分的次黄嘌呤I碱基，切断N-糖苷键释放出受损碱基，生成AP位点，AP位点被Endo IV特异性识别并切割，产生3′-OH末端的核酸链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸进行延伸反应。最后，延伸产物与hAAG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上hAAG信号探针的AP位点，释放Cy5荧光信号。该过程反复循环，使得荧光信号不断增强。
所提出的UDG和hAAG活性同时检测的原理如图1C所示，分析过程主要包括3个部分：a.UDG和hAAG同时分别识别发夹底物上的异常碱基U和I，并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，UDG和hAAG分别特异性识别发夹底物双链上的尿嘧啶和次黄嘌呤，切断N-糖苷键从而释放受损碱基，生成AP位点，AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后形成两条不同的3′-OH末端的核酸单链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸单链分别进行延伸反应。最后，两条延伸产物分别与UDG信号探针和hAAG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上UDG信号探针和hAAG信号探针的AP位点，释放FAM和Cy5荧光信号。该过程反复循环，使得两种荧光信号不断增强。
可行性分析：
为了证明该分析方法的可行性，采用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了剪切反应和延伸反应的产物，如图2A所示，当UDG和hAAG都不存在时(条带1)，除了发夹底物没有新的条带出现，表明没有发生反应；单独加入hAAG时，有新条带出现(条带2)，表明切除次黄嘌呤碱基后，Endo IV发生了切割反应；单独加入UDG时，又有新条带出现(条带3)，表明切除尿嘧啶碱基后，Endo IV发生了切割反应；加入UDG和hAAG时(条带4)，同时出现两条新条带，表明同时切除尿嘧啶和次黄嘌呤碱基后，Endo IV发生了切割反应。如图2B所示，当UDG和hAAG都不存在时(条带1)，除了发夹底物没有新的条带出现，表明没有发生反应；加入hAAG、Endo IV、TdT和dTTP时，有一条新条带出现(条带2)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，剪切产物发生延伸聚合反应；加入UDG、Endo IV、TdT和dTT，有一条新条带出现(条带3)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，剪切产物发生延伸聚合反应；加入hAAG、UDG、Endo IV、TdT和dTTP，有两条新条带出现(条带4)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，两条剪切产物分别进行延伸聚合反应。表明该方法是可行的。我们也通过荧光光谱法考察了该方法的可行性，如图2C所示，当没有加入UDG(黑线)，在494nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入UDG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的；如图2D所示，当没有加入hAAG(黑线)，在640nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入hAAG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的；如图2E所示，当没有加入UDG和hAAG(黑线)，在494nm和640nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入UDG和hAAG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的。这些结果表明，UDG和hAAG能够有效地从发夹底物上剪切尿嘧啶和次黄嘌呤碱基，且彼此之间不干扰，进而分别启动TdT激活-Endo IV辅助的信号扩增。
分析性能的评估：
为了评估该方法的分析性能，最优的条件下测定了不同浓度的UDG和hAAG糖苷酶活性。图4A体现了不同浓度的UDG糖苷酶的荧光光谱。在0.1-3×10-4U mL-1的浓度范围内，随着UDG糖苷酶浓度的增大，荧光强度不断增强。图4B表明荧光强度与UDG糖苷酶浓度的对数呈线性关系，其检测限为5.5×10-5U mL-1。图4C体现了不同浓度的hAAG糖苷酶的荧光光谱。在0.01-20U mL-1的浓度范围内，随着hAAG糖苷酶浓度的增大，荧光强度不断增强。图4D表明荧光强度与hAAG糖苷酶浓度的对数呈线性关系，其检测限为3.3×10-3U mL-1。该方法的高灵敏度主要归结于：(1)UDG和hAAG特异性切除修复诱导的扩增反应的非特异性扩增被抑制，背景降低；(2)TdT-激活Endo IV-辅助扩增反应的效率高
选择性和特异性分析：
为了考察该方法的选择性，选择甲酰胺嘧啶糖苷酶(FPG)和热稳定Flap核酸内切酶1(FEN1)作为干扰物质。FPG糖苷酶能特异性识别和切除底物DNA中8-oxoG/C碱基对中的8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG)碱基。FEN1酶可催化切除分叉双链DNA底物中的flap结构。如图5所示，只有UDG或hAAG或UDG和hAAG存在时，所对应的荧光信号强于FPG、FEN1存在时对应的荧光强度，说明该方法的选择性好。
酶动力学参数考察：
为了考察该方法的实际应用性能，用该方法考察了UDG和hAAG的酶动力学参数，如图6A所示，UDG的初始反应速率随着底物浓度(0-300nM)的增加而增大，UDG的vmax为1.906s-1，Km值为147.87nM；如图6B所示，hAAG的初始反应速率随着底物浓度(0-250nM)的增加而增大，hAAG的vmax为1.125s-1，Km值为16.15nM。上述这些结果证明该方法可用于考察UDG和hAAG的酶动力学参数。
实际样品分析：
为了考察该方法在实际样品分析中的性能，用该方法考察了HeLa细胞和正常人肾脏上皮细胞293T中的UDG和hAAG糖苷酶。如图7A所示，UDG和hAAG糖苷酶在HeLa细胞中的含量大于正常人肾脏上皮细胞293T中的含量，与文献报道的癌细胞中糖苷酶含量异常相符合，因此我们测定了HeLa细胞中两种糖苷酶的含量。如图7B所示，在494nm的激发波长下，荧光强度随着总蛋白浓度的增加而增强，且荧光强度和总蛋白浓度的对数呈线性相关。如图7C所示，在640nm的激发波长下，荧光强度随着总蛋白浓度的增加而增强，且荧光强度和总蛋白浓度的对数呈线性相关。因此，方法能够用于复杂生物样品中的UDG和hAAG糖苷酶活性的检测。
以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.UDG和hAAG酶诱导多色荧光编码的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：发夹底物DNA、UDG信号探针、hAAG信号探针DNA的选取；
S2:对步骤S1中选取的发夹底物进行DNA的退火；
S3:利用UDG和hAAG分别对退火后的发夹底物中尿嘧啶和次黄嘌呤特异性识别，切断N-糖苷键从而释放受损碱基，生成AP位点；AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后分别形成两条3’-OH末端的DNA单链；
S4:利用TdT末端转移酶和dTTP对步骤S3中形成的两条DNA单链末端进行延伸，生成聚T核酸链；
S5:Endo IV辅助循环：将步骤S4中形成的两条DNA单链分别与UDG信号探针和hAAG信号探针杂交形成部分互补双链，随后利用Endo IV识别并切割双链上所述UDG和hAAG信号探针的AP位点；
步骤S1中，发夹底物的茎部含有21对完全互补的碱基，环部由12个碱基组成；距离5′端7个碱基的位置为hAAG识别的次黄嘌呤碱基，距离3′末端17个碱基的位置为UDG识别的尿嘧啶碱基。
2.根据权利要求1所述UDG和hAAG酶诱导多色荧光编码的方法，其特征在于：所述发夹底物的3′末端用NH2修饰，UDG信号探针的两端分别用FAM和BHQ1标记，中间位置含有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，信号探针可与其对应的延伸产物杂化形成部分互补双链。
3.根据权利要求1所述UDG和hAAG酶诱导多色荧光编码的方法，其特征在于：所述hAAG信号探针的两端分别用Cy5和BHQ3标记，中间位置具有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，且信号探针与其对应的延伸产物杂化形成部分互补的双链。
4.根据权利要求1所述UDG和hAAG酶诱导多色荧光编码的方法，其特征在于：所述步骤S5中，对双链上信号探针的AP位点切割后使得FAM和Cy5荧光信号恢复，且释放出与荧光探针互补的DNA延伸产物，释放出的DNA延伸产物继续与新的信号探针杂交形成双链，发生杂交-剪切-释放的循环过程，使得荧光信号增强。
5.根据权利要求1所述UDG和hAAG酶诱导多色荧光编码的方法，其特征在于：所述发夹底物的DNA序列为：CGA TTC GIG GCA GCA ACA GTG GTG CAT AGT GGA CAC UGT TGC TGCCTC GAA TCG，其中U和I分别代表UDG和hAAG的识别位点，所述UDG信号探针的DNA序列为：FAM-AAAAAAAAAXGTGTCCAC-BHQ1，其中X为AP位点，所述hAAG信号探针的DNA序列为Cy5-AAAAAAAAAXCGAATCG-BHQ3，其中X为AP位点。
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