CN108088826B - 一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶（udg）的荧光生物传感器 - Google Patents

一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶（udg）的荧光生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi 29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV。本发明的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好。

Description

一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于核酸内切酶放大和滚环扩增检测DNA糖基化酶的荧光生物传感器。
背景技术
水解胞嘧啶生成尿嘧啶是DNA水解损伤中最常见的一种形式，从而导致在DNA复制过程中G：C碱基对转变成A：U碱基对。尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是一种蛋白酶，它具有基本的切除修复酶活性，在维持基因组完成性方面起着至关重要的作用。作为碱基切除修复路径的启动者和一种针对不受欢迎的异常碱基的“侦察员”，UDG由于具有对尿嘧啶的高特异性，因此可作用于识别和催化单链或双链DNA上的N-糖苷键的水解和分裂。随后，便产生了一种无嘌呤无嘧啶的位点（AP位点）并触发DNA修复过程，并通过附加酶的协调作用来移除AP位点，以取代正常的胞嘧啶碱基。异常的UDG作用可以诱发基因突变与多种疾病直接相关包括癌症，基因型疾病，人类免疫缺陷。因此，作为一种潜在的生物标志物，UDG的灵敏性和直接的检测对基础功能研究和临床诊断都具有重要意义。传统的UDG活性检测方法包括凝胶电泳法，质谱分析法，放射性标记法。近年来，各种生物传感技术，如电化学法、比色法、光学法等已被开发应用，以提高灵敏度和特异性，提高安全性，缩短检测时间。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于内切酶辅助滚环扩增放大的荧光法检测DNA糖基化酶的生物传感器及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi 29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；
所述环形模板的序列如SEQ No.1所示；
所述发卡探针的序列如SEQ No.2所示；
所述荧光探针的序列如SEQ No.3所示，其5’端第10位碱基为无碱基位点，紧邻上述位点5’端T修饰荧光基团，紧邻上述位点3’端T修饰荧光猝灭基团；所述荧光探针3’端修饰C3 spacer。
所述荧光探针的荧光基团与相应荧光猝灭基团优选为6-羧基荧光素（FAM）和4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（Dabcyl）。
所述环形模板采用以下方法获得：
（1）将线性模板与连接探针在T4 DNA连接酶缓冲液中杂交，然后加入T4 DNA连接酶低温下反应，然后灭活T4 DNA连接酶；
（2）上述体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反应，然后灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得环形模板；
所述线性模板的序列如SEQ No. 4所示，其5’端修饰磷酸基团；
所述连接探针的序列如SEQ No. 5所示。
所述T4 DNA连接酶的反应温度为16-20℃，反应时间为12-20 h。
所述步骤（1）和（2）中灭活酶的步骤为高温灭活；灭活T4 DNA连接酶的条件优选为65℃下15 min；灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的条件优选为85℃下10 min。
所述T4 DNA连接酶反应缓冲液含有50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM二硫苏糖醇（DTT）和1 mM ATP。
一种利用上述荧光生物传感器检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，包括以下步骤：
（1）将环状模板、发卡探针、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV在缓冲液中混合后分别加入系列浓度UDG酶的标准溶液或待测液，混匀后37℃恒温反应；
（2）向步骤（1）的溶液中加入荧光探针，混匀后37℃恒温反应；
（3）将步骤（2）所得溶液进行荧光检测；根据系列浓度UDG酶的标准溶液做UDG酶浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程；根据待测液的荧光强度，计算含UDG酶的浓度。
所述核酸内切酶IV的浓度为1-30U/mL，优选为20-30 U/mL；
所述发卡探针的浓度为0.5-50nM，优选为10-50nM；
所述步骤（2）的反应时间为10-40min，优选为30-40min；
所述荧光探针的浓度为1-20μM，优选为10-20μM。
所述步骤（3）中，激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm。
本荧光生物传感器的工作原理如下：
在线性模板5’端修饰了磷酸基团，并且在5’端和3’端包含与连接探针的互补的碱基。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接探针的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。
在发卡探针包含尿嘧啶脱氧核糖核苷的修饰位点，和能够与环形模板互补的序列。荧光探针中分别修饰了FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，并含有无嘌呤无嘧啶位点（AP位点），3’修饰的C3 spacer用于防止核酸外切酶和聚合酶发挥作用。
当有目标物UDG存在时，UDG能够识别预先修饰有尿嘧啶的发夹探针并对糖苷键进行水解作用，随后产生一个无嘌呤无嘧啶的AP位点。随后，核酸内切酶IV识别AP位点并进行切割使发夹探针断裂形成两条单链DNA。其中一条链能够与预先制备的环形模板结合，进行滚环扩增放大，产生的单链DNA能够与带有AP位点修饰的荧光探针结合，在核酸内切酶的辅助作用下，使探针断裂，从而荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光基团，产生一定强度的荧光信号。
本发明具有以下优点：
本发明的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好。
附图说明
图1为本荧光生物传感器的工作原理；
图2为荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化曲线图；
图3为荧光强度随发卡探针浓度的变化；
图4为荧光强度随荧光探针反应时间的变化；
图5为荧光强度随荧光探针浓度的变化；
图6为实施例6中检测UDG酶的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中使用序列如下：
线性模板：5’-p-CTG AGC TAC GTA GTA TCA GAT AGA TCT GTC AAG TCT GAT AGTAGT ATC AGA TAG ATC TGA CGG C-3’
连接探针：5’-CGT AGC TCA GGC CGT CAG-3’
发卡探针：5’-GTG ATA CTG ATT TCA GGC CGT CAG UAT CAC-3’
荧光探针：5’-GTA GTA T(FAM)C AXA T(Dabcyl)AG ATC TG-C3Spacer-3’。
实施例1 环形模板的制备。
配制含50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT和1mM ATP的T4 DNA连接酶反应缓冲液。
（1）将42 μL灭菌水，6 μL线性模板（100 nM），6 μL连接探针（100 nM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶；
（2）向上述反应体系中加入3 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和3 μL的核酸外切酶Ⅲ（100 U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。
实施例2 荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化。
（1）将3μL环状模板（10 nM）、3 μL发卡探针（10 nM）、3 μL dNTP（1 mM）、2 μLphi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（终浓度分别为1 U/mL，5 U/mL，10 U/mL，20U/mL，30 U/mL）在3 μL phi29 DNA聚合酶缓冲液中混合后分别加入3 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应90 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL荧光探针（10 μM），混匀后37℃恒温反应30 min；
（3）取32 μL步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图2，从图中可以看出，随着核酸内切酶IV量的增加，荧光强度不断增强，在酶量达到20 U/mL之后，荧光强度基本不变。
实施例3 荧光强度随发卡探针浓度的变化。
（1）将3μL环状模板（10 nM）、3 μL发卡探针（终浓度分别为0.5 nM、1 nM、5 nM、10nM、50 nM）、3 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（20 U/mL）在3 μL phi29 DNA聚合酶缓冲液中混合后分别加入3 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应90 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL荧光探针（10 μM），混匀后37℃恒温反应30 min；
（3）取32 μL步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图3，从图中可以看出，随着HP的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在HP浓度达到10 nM之后，荧光强度基本不变。
实施例4 荧光强度随荧光探针反应时间的变化。
（1）将3μL环状模板（10 nM）、3 μL发卡探针（10 nM）、3 μL dNTP（1 mM）、2 μLphi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（20 U/mL）在3 μL phi29 DNA聚合酶缓冲液中混合后分别加入3 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应90 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL荧光探针（10 μM），混匀后37℃恒温反应0 min、10 min、20 min、30 min、40 min；
（3）取32 μL步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图4，从图中可以看出，随着时间增加，实验得到的荧光强度不断增强，在反应时间达到30 min之后，荧光强度基本不变。
实施例5 荧光强度随荧光探针浓度的变化。
（1）将3μL环状模板（10 nM）、3 μL发卡探针（10 nM）、3 μL dNTP（1 mM）、2 μLphi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（20 U/mL）在3 μL phi29 DNA聚合酶缓冲液中混合后分别加入3 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应90 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL荧光探针（终浓度分别为1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、20 μM），混匀后37℃恒温反应30 min；
（3）取32 μL步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图5，从图中可以看出，随着荧光探针浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在荧光探针浓度达到10 μM之后，荧光强度基本不变。
实施例6 对UDG酶的检测。
（1）将3μL环状模板（10 nM）、3 μL发卡探针（10 nM）、3 μL dNTP（1 mM）、2 μLphi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（20 U/mL）在3 μL phi29 DNA聚合酶缓冲液中混合后分别加入3 μL UDG酶液（浓度分别为0.05 U/mL、0.1 U/mL、0.5 U/mL、1 U/mL、5U/mL）和待测液，混匀后37℃恒温反应90 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL荧光探针（10 μM），混匀后37℃恒温反应30 min；
（3）取32 μL步骤（2）所得溶液分别加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
根据系列UDG酶液的荧光强度，作标准曲线，如图6所示，计算回归方程为F=880.42+185.68×LgCUDG(U/mL)，相关系数为0.975，根据待测液的荧光强度860，计算得其中UDG酶的浓度为0.78 U/mL。
<110> 济南大学
<120> 一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器
<130> 20171214
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hairpin probe
<400> 1
gtgatactga tttcaggccg tcaguatcac 30
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> padlock probe
<400> 2
ctgagctacg tagtatcaga tagatctgtc aagtctgata gtagtatcag atagatctga 60
cggc 64
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ligation probe
<400> 3
cgtagctcag gccgtcag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ
<400> 4
gtagtatcaa tagatctg 18

Claims (6)

1.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的荧光生物传感器，其特征在于，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi 29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；
所述环形模板的序列如SEQ No.1所示；
所述发卡探针的序列如SEQ No.2所示；
所述荧光探针的序列如SEQ No.3所示，其5’端第10位碱基为无碱基位点，紧邻上述位点5’端T修饰荧光基团，紧邻上述位点3’端T修饰荧光猝灭基团；所述荧光探针3’端修饰C3spacer；所述荧光基团与相应荧光猝灭基团为6-羧基荧光素和4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸
所述环形模板采用以下方法获得：
（1）将线性模板与连接探针在T4 DNA连接酶缓冲液中杂交，然后加入T4 DNA连接酶低温下反应，然后灭活T4 DNA连接酶；
（2）上述体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反应，然后灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得环形模板；
所述线性模板的序列如SEQ No. 4所示，其5’端修饰磷酸基团；
所述连接探针的序列如SEQ No. 5所示。
2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述T4 DNA连接酶的反应温度为16-20℃，反应时间为12-20 h。
3.一种利用如权利要求1所述的荧光生物传感器检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将环状模板、发卡探针、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV在缓冲液中混合后分别加入系列浓度尿嘧啶-DNA糖基化酶的标准溶液或待测液，混匀后37℃恒温反应；
（2）向步骤（1）的溶液中加入荧光探针，混匀后37℃恒温反应；
（3）将步骤（2）所得溶液进行荧光检测；根据系列浓度尿嘧啶-DNA糖基化酶的标准溶液做尿嘧啶-DNA糖基化酶浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程；根据待测液的荧光强度，计算含尿嘧啶-DNA糖基化酶的浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸内切酶IV的浓度为1-30 U/mL；所述发卡探针的浓度为0.5-50 nM；所述荧光探针的浓度为1-20 μM。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）的反应时间为10-40 min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm。
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