CN109752362B

CN109752362B - 一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶的生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN109752362B
Application number: CN201910022818.6A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 李莎莎; 刘素; 黄加栋; 张儒峰; 赵一菡; 瞿晓南; 孙文玉; 王业茹; 张曼如
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109752362A

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于纳米金DNA分子机器与表面增强拉曼散射的生物传感器。为了解决以上现有技术中检测UDG活性的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种基于DNA分子机器表面增强拉曼散射检测UDG活性的生物传感器，将纳米金分子机器与表面增强拉曼相结合，均相反应混合液。制备方法：合成金纳米粒子；将Hairpin Probe和Track DNA以及拉曼染料修饰到金纳米粒子表面；将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。利用了内切酶IV的特异性切割实现DNA分子机器开启，利用表面增强拉曼检测实现了高灵敏性检测；利用外切酶Ⅲ，实现了DNA分子机器的循环，起到了信号放大的作用。

Description

一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及基于DNA分子机器表面增强拉曼散射检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

基因组由特定配对的DNA碱基组成，其稳定和准确性是所有生物体的先决条件。然而，DNA碱基的结构特性可能被多种环境因子和内源性活性氧物质破坏，导致基因组不稳定性和诱导癌变。尿嘧啶是DNA中常见的受损碱基，在DNA复制过程中dUTP错误掺入或胞嘧啶水解脱氨的结果，从而导致G:C碱基对转变成A:U碱基对，最终导致基因突变。通常通过碱基切除修复系统中的尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）来修复DNA内的尿嘧啶。尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是一种高度保守的损伤修复酶，它可以通过催化尿嘧啶和DNA骨架之间的糖苷键的裂解来特异性地识别和切除尿嘧啶，释放受损的碱基并产生无碱基位点（AP位点），并最终与其他修复蛋白质协调以完成整个DNA修复。UDG在维持基因组完整性方面发挥着至关重要的作用，而UDG的异常表达与人类免疫缺陷，淋巴瘤，神经变性和癌症等多种疾病直接相关。因此，精确检测UDG活性对于生物医学研究和临床诊断至关重要。

传统的UDG活性检测方法有凝胶电泳法，核酸标记等方法，然而，它们需要复杂的核酸标记和凝胶电泳程序，并且耗时且灵敏度差，很难普遍化。为了克服以上缺陷，一些基于比色和荧光的UDG活性检测方法发展起来，这些新技术给UDG活性检测方面带来了巨大的进步；但要实现更加灵敏、特异性检测UDG还有待进一步改善。

发明内容

为了实现更加灵敏的、特异性的检测UDG活性，本申请提出了一种基于双酶辅助和DNA分子机器介导纳米金颗粒聚集检测DNA糖基化酶的生物传感器。

一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物传感器，包括纳米金溶液、Hairpin Probe、Track DNA、拉曼染料、拉曼染料、均相反应液；

所述的Hairpin Probe、Track DNA序列为：

Hairpin Probe：

5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTATGTAGTAT

CTCTTTTTCUACATACTGTTTTTT-3’ 序列如SEQ No.1所示；

Track DNA: 5’-SH-TTTTGAGATACTACATAC-3’ 序列如SEQ No.2所示；

所述的DNA序列中，Hairpin Probe和Track DNA的5’端修饰-SH；

所述的Hairpin Probe序列5’第67位修饰U。

所述的均相反应液，包括内切酶IV、外切酶Ⅲ、待测物UDG、PBS。

所述的内切酶IV浓度为1 U/mL，所述的外切酶Ⅲ浓度为10U/mL，待测物UDG的浓度为1 U/mL。

所述的PBS为10mM Tris-HCL、50mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH=7.9。

上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备纳米金溶液；

（2）将Hairpin Probe、Track DNA及拉曼染料修饰到金纳米粒子表面，得到修饰后的纳米金溶液；

（3）将修饰后的的纳米金溶液与均相反应溶液混合。

所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。

所述的步骤（2），包括以下步骤：

S1 向纳米金溶液中边搅拌边加入拉曼染料溶液；

S2 加入修饰了-SH的底物探针 Hairpin Probe and Track DNA，混合均匀；

S3 按照1μL/min的速度加入50 μL PB缓冲液，搅拌均匀，1μL/min的速度加入27 μL PBS缓冲液，4 ℃放置48 h；

S4 按照1μL/min的速度加入62μL PBS缓冲液，搅拌均匀，4 ℃放置；

S5加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存待用。

所述的步骤（3）的反应条件为37℃，反应时间是1h。

所述的步骤（3）中拉曼染料的终浓度为0.5-3.0μM。

Walker DNA序列如SEQ No.3所示，本发明的检测方式是纳米金表面增强拉曼散射（SERS）检测， Hairpin Probe在目标物UDG及EndoIV的作用下得到Walker DNA，得到的Walker DNA与纳米金上标记的Track DNA杂交，在外切酶Ⅲ的作用下实现后续的循环放大，在检测之前，先通过Au-S键将Hairpin Probe和Track DNA修饰到金纳米粒子表面。然后将标有核酸链的纳米金粒子与均相溶液混合，37℃孵育2h完成内切酶IV及外切酶Ⅲ介导的循环放大过程。最后，通过检测溶液的拉曼散射光谱进行目标物的检测。

本发明基于内切酶IV及外切酶III的特异性切割实现循环放大和DNA分子机器的特殊结构实现纳米金离子的团聚，导致颗粒间隙的局域电磁场显著增强，从而极大增强了颗粒表面吸附拉曼染料的SERS信号，实现对目标物活性检测的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补UDG现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、检测周期短，灵敏度高

利用了UDG的特异性识别，利用内切酶IV及外切酶Ⅲ的特异性切除实现了对目标物的循环放大；由于使用纳米金结合DNA分子机器以及表面增强拉曼检测，其检测方法操作简便、检测周期短，检测灵敏度高；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。

2、特异性识别

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是一种高度保守的损伤修复酶，能特异性识别DNA单链或双链中的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，产生无碱基位点（AP位点）。

3、反应温和，适于工业化

该传感器的反应条件温和，反应速度快；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为本生物传感器的工作原理图；

图2为实施例1拉曼染料浓度优化结果图；

图3为实施例2内切酶IV浓度优化检测结果图；

图4为实施例3外切酶Ⅲ浓度优化检测结果图；

图5为实施例4反应时间优化检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

将Hairpin Probe和Track DNA修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

a、取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心15 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口，分别加入不同体积的拉曼染料（4NTP终浓度分别为0.25uM，0.5 uM，1uM，2 uM和3 uM）。

b、室温放置30 min后，加入150 μL浓度为10 μM的修饰了-SH的底物探针（Hairpin Probe and Track DNA），混合均匀后，4 ℃下放置24 h。

c、分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子（再放到王水里），4 ℃放置48 h。

d、 48 h后再分多次缓慢加入62μL PBS缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡，边加边搅拌）。取出磁子（再放到王水里），4 ℃放置24h。

e、将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链），4 ℃保存。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将内切酶IV（1 U/mL），外切酶Ⅲ（10U/mL），标记好五种不同染料吸附量的纳米金溶液（6μL）和待测物UDG（1 U/mL），PBS（10mM Tris-HCL,50mM NaCl,10mM MgCl2, 1mMDTT, pH 7.9）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应60min。

b、60min后，从水浴锅中取出混合溶液。观察颜色变化，并且用拉曼光谱仪检测，获得五组空白样品和阳性样品的SERS光谱。根据所得到的一系列光谱，分别计算了阳性样品和空白样品的SERS光谱的特征峰的峰面积比值，由此，我们得到了不同染料吸附量的金纳米颗粒探针所对应的信背比见图2。由以上数据可以得出，当拉曼染料浓度为2uM时，方法具有最高的信背比。所以，我们选择2uM作为实验所需的拉曼染料浓度。

实施例2

将Hairpin Probe and Track DNA修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

a、取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心15 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口，加入拉曼染料（4NTP终浓度为2 μM）。

c、分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将不同浓度的内切酶IV（终浓度分别为0.6 U/mL,0.8 U/mL,1 U/mL,1.2 U/mL,1.4 U/mL），外切酶Ⅲ（10 U/mL），标记好的纳米金溶液6μL）和待测物UDG（1 U/mL），PBS（10mM Tris-HCL,50mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应60min。

b、60min后，从水浴锅中取出混合溶液。观察颜色变化，并且用拉曼光谱仪检测。

结果见图3，可以看出，检测到的拉曼强度随着内切酶IV的浓度在0.6-1 U/mL区间内增大而增大，当浓度超过1 U/mL后，吸收峰值开始波动。所以内切酶IV的最佳终浓度为1U/mL。

实施例3

将Hairpin Probe and Track DNA修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将不同浓度的外切酶Ⅲ（终浓度分别为6 U/mL,8 U/mL,10 U/mL,12 U/mL,14U/mL），内切酶IV（1 U/mL），标记好的纳米金溶液（6μL）和待测物UDG（1 U/mL），PBS（10mMTris-HCL,50mM NaCl,10mM MgCl₂, 1mM DTT, pH 7.9）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应60min。

结果见图4，可以看出，检测到的拉曼强度随着外切酶Ⅲ的浓度在6-10 U/mL区间内增大而增大，当浓度超过10 U/mL后，吸收峰值开始波动。所以外切酶Ⅲ的最佳终浓度为10 U/mL。

实施例4

将Hairpin Probe and Track DNA修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将内切酶IV（1 U/mL），外切酶Ⅲ（10 U/mL），标记好的纳米金溶液（6μL）和待测物UDG（1 U/mL），PBS（10mM Tris-HCL,50mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应时间分别为30min，45min，60min，75min，90min。

b、从水浴锅中取出混合溶液。观察颜色变化，并且用拉曼光谱仪检测。

结果见图5，从图中可以看出，检测到的拉曼吸收峰值随着时间的增加逐渐增加，但是，在60min后趋于平坦，所以，选择最佳的反应时间为60min。

实施例5

一种本发明所述基于双酶和DNA分子机器介导纳米金颗粒聚集检测糖基化酶的生物传感器的制备方法：

将Hairpin Probe and Track DNA修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

至此金纳米粒子的修饰完成，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将内切酶IV（1 U/mL），外切酶Ⅲ（10U/mL），标记好的纳米金溶液（6μL）和不同浓度的UDG（0，0.001U/ml，0.005 U/ml，0.01 U/ml，0.05 U/ml，0.1 U/ml，0.5 U/ml，1 U/ml），PBS（10mM Tris-HCL,50mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应60min。

b、60min后，从水浴锅中取出混合溶液。观察颜色变化，并且用拉曼光谱仪检测吸收值，据此检测目标物。

检测结果如下表所示，可以看到，当UDG浓度从0到1U/mL时，分别测得的拉曼吸收峰强度如表中所示。同时，我们在0.001U/mL浓度基础上继续向更低浓度检测，经检测当浓度低于0.001 U/mL时，拉曼强度恰好不在线性范围内。因此，该方法检测下限为0.001U/mL。

UDG糖苷酶浓度(U/mL)	拉曼强度
		0	100
0.0005	120
		0.001	205
0.005	620
		0.01	810
0.05	1220
		0.1	1490
0.5	1820
		1	2130

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物传感器及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttcagta tgtagtatct 60

ctttttcaca tactgttttt t 81

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

ttttgagata ctacatac 18

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttcagta tgtagtatct 60

ctttttc 67

Claims

1.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物传感器，其特征在于，包括纳米金溶液、Hairpin Probe、Track DNA、拉曼染料、均相反应液；

所述的Hairpin Probe序列如SEQ No.1所示；

所述的Track DNA序列如SEQ No.2所示；

所述的Hairpin Probe和Track DNA的5’端修饰-SH；

所述的均相反应液，包括内切酶IV、外切酶Ⅲ、待测物UDG、缓冲液；

所述的缓冲液为10mM Tris-HCL、50mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH=7.9；

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备纳米金溶液；

（3）将修饰后的的纳米金溶液与均相反应溶液混合；

所述的步骤（2），包括以下步骤：

S1 向纳米金溶液中边搅拌边加入拉曼染料溶液；

S2 加入修饰了-SH的底物探针 Hairpin Probe 和 Track DNA，混合均匀；

S3 按照1μL/min的速度加入50 μL PB缓冲液，搅拌均匀，1μL/min的速度加入27 μLPBS缓冲液，4 ℃放置48 h；

S5加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存待用。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的内切酶IV浓度为1 U/mL，所述的外切酶Ⅲ浓度为10U/mL，待测物UDG的浓度为1 U/mL。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。

4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的步骤（3）的反应条件为37℃，反应时间是1h。

5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的步骤（3）中拉曼染料的终浓度为0.5-3.0μM。