CN108169203A

CN108169203A - 一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用

Info

Publication number: CN108169203A
Application number: CN201711336220.1A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 王海旺; 刘素; 黄加栋
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN108169203B

Abstract

本发明提供了一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性的生物传感器，包括核酸外切酶III，发卡探针和表面修饰DNA的金纳米。可采用表面增强拉曼检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性。本发明的生物传感器反应条件温和，反应速度快；其检测方法操作简便、检测周期短，检测灵敏度高；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低。

Description

一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于DNA分子机器表面增强拉曼散射检测hOGG1活性的生物传感器及其应用，属于核酸适配体生物传感器领域。

背景技术

DNA分子对活性氧特别敏感，易受到活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的攻击，发生氧化性DNA损伤。DNA分子的主要氧化产物8-氧-鸟嘌呤（8-oxo-Gua）被视为DNA损伤的生物标志物。8-oxo-Gua具有高度的致突变性，在通过DNA聚合酶进行复制时，产生G:C-T:A颠换突变。在哺乳动物细胞中主要通过8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1）介导的碱基切除修复通路清除8-oxo-Gua。hOGG1具有DNA糖基化酶和脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶活性，可以特异性识别和切除DNA双链中因氧化损伤而产生的8-oxo-Gua，从而恢复基因组中正常的G:C配对，在防止8-oxo-Gua致突变作用中发挥着重要作用。可见，hOGG1介导的8-oxo-Gua碱基切除修复可以保护基因组免遭ROS所致的突变型损伤。因此，精确的检测hOGG1在人体内的表达水平具有重要的临床意义。

传统的检测hOGG1活性方法有聚合酶链反应片段长度多态性检测、酶链免疫检测、放射性标签和HPLC等方法，然而，以上这些方法受到放射性物质、昂贵的仪器设备以及复杂耗时等缺陷限制，很难普遍化。为了克服以上缺陷，一些基于比色和荧光的hOGG1活性检测策略发展起来，这些新技术给hOGG1活性检测方面带来了巨大的进步；但在实现更加灵敏、特异性检测hOGG1活性方面还有待进一步改善。

发明内容

针对现有技术中检测hOGG1活性的灵敏度、特异性低等问题，本发明提供一种基于外切酶Ⅲ和DNA分子机器等温扩增技术的生物传感器，实现了对目标物的循环放大，并运用拉曼光谱技术实现精准检测。

本发明的另一目的是提供上述生物传感器在检测hOGG1活性中的应用与检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1）活性的生物传感器，包括核酸外切酶III（ExoIII），发卡探针和表面修饰DNA的金纳米；

所述发卡探针的序列如SEQ No.1所示，3’端起第二个G为8-氧鸟嘌呤（8-oxo-G）；

所述金纳米表面修饰了Walker DNA与Protect DNA杂交链，Track DNA和拉曼染料；所述Walker DNA与Protect DNA杂交链和Track DNA通过硫-金键修饰于金纳米表面；

所述Walker DNA的序列如SEQ No.2所示，5’端修饰巯基（-SH）；

所述Protect DNA的序列如SEQ No.3所示；

所述Track DNA的序列如SEQ No.4所示，5’端修饰巯基（-SH）。

可选地，拉曼染料为2-硝基苯硫酚（DTNB）、4-乙酰氨基苯硫酚或4-邻巯基苯甲酸中任意一种。

可选地，纳米金的制备可以采用金氯酸还原的方法制备获得；还原剂可选用常用还原剂，如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷或硼氢化钠；优选地，纳米金采用金氯酸经柠檬酸钠还原获得。

一种上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（a）分别合成发卡探针、Walker DNA、Protect DNA、Track DNA和金纳米，并配制为溶液；

（b）Walker DNA与Protect DNA杂交形成杂交链，然后在溶液中将杂交链、Track DNA和拉曼染料修饰到金纳米表面。

所述Walker DNA和Protect DNA杂交优选的退火温度为55℃。

可选地，所述拉曼染料的浓度为0.25-3 μM，优选为0.5-2μM，最优选为2 μM。

一种利用上述生物传感器检测hOGG1活性的方法，包括以下步骤：

（1）将ExoIII和发卡探针的溶液加入离心管中，然后分别加入不同hOGG1标准溶液和待测液，混匀，保温反应；

（2）将表面修饰的金纳米的溶液分别加入步骤（1）所得的反应液中，混匀，保温反应；

（3）用拉曼光谱仪检测步骤（2）所得反应液的SERS光谱，根据标准溶液的光谱作标准曲线后，计算待测液中hOGG1含量。

所述步骤（1）中的反应温度为37℃，反应时间为30min。

所述步骤（1）溶液为磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的溶液，PBS中含10mM Tris-HCl，50μM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇（DTT），其pH为7.9。

所述核酸外切酶III的浓度为10-50 U/mL，优选为10-30 U/mL，最优选为30 U/mL。

所述步骤（2）中的反应温度为37℃，反应时间为2-2.5h。

本发明具有以下优点：

本发明的生物传感器利用了hOGG1糖苷酶的特异型识别，利用外切酶Ⅲ的特异性切除实现了对目标物的循环放大；该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用纳米金结合DNA分子机器以及表面增强拉曼检测，其检测方法操作简便、检测周期短，检测灵敏度高；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为修饰不同浓度DTNB的纳米金对检测hOGG1的影响；

图2为检测hOGG1的标准曲线；

图3为生物传感器的工作原理如图；

图4为不同ExoⅢ浓度下检测hOGG1的拉曼光谱强度；

图5为不同反应时间下检测hOGG1的拉曼光谱强度。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 金纳米的制备。

（1）向三口烧瓶中加入200ml超纯水；

（2）取500uL浓度为0.04g/mL的HAuCl₄于离心管中，加200ml超纯水，搅拌加热至沸，搅拌速度450rpm；

（3）在搅拌的条件下，取3ml浓度为1%的柠檬酸三钠溶液快速加入步骤（2）的溶液中，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。

根据530nm处吸光值，上述溶液中金纳米颗粒的浓度约为0.3nM。

实施例2 金纳米的修饰。

（1）Walker DNA和Protect DNA在90℃下变性，在55℃下退火杂交，形成杂交链，4℃下保存备用；

（2）取1mL实施例1中制得的金纳米溶液于离心管中，离心速度13000rpm，离心10 min。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓度为3 nM。移入1mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口，然后，边搅拌边加入12 μL的DTNB溶液（终浓度为2 μM）。

（3）室温放置30 min后，加入150 μL浓度为30 μM的Walker DNA和Track DNA，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。

（4）分多次缓慢加入50 μL PBS缓冲液，加入磁子（提前24 h用王水浸泡后ddH₂O冲洗至中性）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h。

（5）将上述溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次，得表面修饰的金纳米溶液S1。

按照上述方法制备表面修饰的金纳米溶液S2-S6，不同在于DTNB溶液终浓度为0.25、0.5、1、3 μM。

实施例3 不同浓度拉曼染料对hOGG1糖苷酶的影响。

（1）将2 μL ExoⅢ（30U/mL），2μL发卡探针（1U/mL），分别加入6支离心管中，其中5支试管分别加入2 μL hOGG1溶液（1600U/ml），1支试管加入等量PBS溶液；6支试管震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

（2）将上述反应液分别加入20 μL实施例2中表面修饰的金纳米溶液S2-S6（1 nM），放入37℃的水浴锅中反应120min。

（3）用拉曼光谱仪检测步骤（2）所得反应液的SERS光谱。

根据所得到的光谱，分别计算阳性样品和空白样品的SERS光谱的特征峰的峰面积比值，得到不同染料吸附量的金纳米颗粒探针所对应的信背比如图1所示。由图中数据可得，当拉曼染料终浓度为2 μM时，信背比最高。

实施例4 hOGG1糖苷酶的检测。

（1）将2 μL ExoⅢ（30U/mL），2μL发卡探针（1U/mL），分别加入9支离心管中，再分别加入2 μL待测物或不同浓度的hOGG1溶液（0，0.001U/ml，0.005 U/ml，0.01 U/ml，0.05 U/ml，0.1 U/ml，0.5 U/ml，1 U/ml）震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

（2）将上述反应液加入20 μL实施例2中表面修饰的金纳米溶液S1（1 nM），放入37℃的水浴锅中反应120min。

hOGG1浓度从0到1U/mL和待测液的拉曼吸收峰强度如表1所示，标准曲线如图2所示，标准曲线为R=629.38LgC_hoGG1+2075.40相关系数为0.9953，由此计算得待测液中的hOGG1浓度为0.019。

表1

hOGG1糖苷酶浓度(U/mL)	拉曼强度
		0	100
0.001	205
		0.005	620
0.01	810
		0.05	1220
0.1	1490
		0.5	1820
1	2130
		0.019	1000

本生物传感器的工作原理如图3所示：

在发夹探针中设计了一个鸟嘌呤氧化位点，当有目标物hOGG1存在时，hOGG1就会特异性识别并切割鸟嘌呤氧化位点，从而在发夹DNA的3’末端产生凹末端；外切酶Ⅲ特异性的识别双链中3’凹末端并进行切割，从而产生如序列SEQ No. 5的Trigger DNA（5’-TTCATCCCAACCGAC GTACTGAGAGCTAG-3’）。

在通过Au-S修饰了Walker DNA和Track DNA的纳米金离子上，并且由Protect DNA的在Walker DNA末端进行保护；而Trigger DNA可以将Walker DNA末端的保护通过链置换去除，使得Walker DNA和Track DNA邻近进行杂交，从而产生ExoⅢ的酶切位点，将TrackDNA切除并释放Walker DNA，依次循环，就实现了Walker DNA在纳米金离子表面行走，依次将Track DNA进行切除，使得纳米金粒子靠近团聚；此外，通过链置换下来的Trigger DNA和Protect DNA双链也产生了外切酶Ⅲ的酶切位点，ExoⅢ将双链中的Protect DNA切除，释放Trigger DNA进行下一个循环的反应，从而实现了等温扩增循环放大；反应结束后，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对团聚的纳米金进行拉曼光谱扫描。

实施例5 ExoⅢ浓度对检测hOGG1的影响。

（1）将2 μL ExoⅢ（终浓度分别为10 U/mL，20 U/mL，30 U/mL，40 U/mL，50 U/mL），2μL发卡探针（1U/mL），分别加入5支离心管中，再分别加入2 μL hOGG1溶液（1600U/ml），震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

（2）将上述反应液加入20 μL实施例2中表面修饰的金纳米溶液S1（1nM），放入37℃的水浴锅中反应120min。

（3）用拉曼光谱仪检测步骤（2）所得反应液的SERS光谱。

以ExoⅢ浓度为横坐标，以拉曼光谱强度为纵坐标，得不同ExoⅢ浓度下检测hOGG1的拉曼光谱图，如图4所示。由图可知，检测到的拉曼强度随着外切酶Ⅲ的浓度在10-30 U/mL区间内增大而增大，当浓度超过30 U/mL后，吸收峰值开始波动。

实施例6 反应时间对检测hOGG1的影响。

（1）将2 μL ExoⅢ（30 U/mL），2μL发卡探针（1U/mL），分别加入6支离心管中，再分别加入2 μL hOGG1溶液（1600U/ml），震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

（2）将上述反应液加入20 μL实施例2中表面修饰的金纳米溶液S1（1 nM），放入37℃的水浴锅中分别反应30min，60min，90min，120min，150min，180min。

（3）用拉曼光谱仪分别检测步骤（2）所得反应液的SERS光谱。

以反应时间为横坐标，以拉曼光谱强度为纵坐标，得不同反应时间下检测hOGG1的拉曼光谱强度图，如图5所示。由图可知，检测到的拉曼吸收峰值随着反应时间的增加逐渐增加，在120min后趋于平坦。

<110> 济南大学

<120> 一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用

<130> 20171214

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HP

<400> 1

ttcatcccaa ccgacgtact gagagctagc agtacgtcgg ttgggatgaa gactct 56

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Trigger

<400> 2

ttcatcccaa ccgacgtact gagagctag 29

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protect

<400> 3

ctcagtacgt cggttgggat gaa 23

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Walker

<400> 4

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttta ccgacgtact gagtgat 57

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Track

<400> 5

ctcagtacgt cg 12

Claims

1.一种检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性的生物传感器，其特征在于，包括核酸外切酶III，发卡探针和表面修饰DNA的金纳米；

所述发卡探针的序列如SEQ No.1所示，3’端起第二个G为8-氧鸟嘌呤；

所述金纳米表面修饰了Walker DNA与Protect DNA杂交链，Track DNA和拉曼染料；

所述Walker DNA的序列如SEQ No.2所示，5’端修饰巯基；

所述Protect DNA的序列如SEQ No.3所示；

所述Track DNA的序列如SEQ No.4所示，5’端修饰巯基。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，拉曼染料选自2-硝基苯硫酚、4-乙酰氨基苯硫酚或4-邻巯基苯甲酸中任意一种。

3.一种如权利要求1所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，Walker DNA和Protect DNA杂交的退火温度为55℃。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述拉曼染料的浓度为0.25-3 μM。

6.一种利用如权利要求1所述的生物传感器检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将核酸外切酶III和发卡探针的溶液加入离心管中，然后分别加入不同8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶标准溶液和待测液，混匀，保温反应；

（3）用拉曼光谱仪检测步骤（2）所得反应液的SERS光谱，根据标准溶液的光谱作标准曲线后，计算待测液中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的反应温度为37℃，反应时间为30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的反应温度为37℃，反应时间为2-2.5h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，核酸外切酶III的浓度为10-50 U/mL。