CN113219031A - Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用 - Google Patents

Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113219031A
CN113219031A CN202110335296.2A CN202110335296A CN113219031A CN 113219031 A CN113219031 A CN 113219031A CN 202110335296 A CN202110335296 A CN 202110335296A CN 113219031 A CN113219031 A CN 113219031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna probe
dna
biosensor
probe
mirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110335296.2A
Other languages
English (en)
Inventor
王冬梅
周欢
刘飞
叶长江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wannan Medical College
Original Assignee
Wannan Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wannan Medical College filed Critical Wannan Medical College
Publication of CN113219031A publication Critical patent/CN113219031A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物传感器领域，公开了一种DNA双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用。本发明提供的DNA双足步行者信号放大器利用催化发夹自组装反应驱动，无需酶参与即可使用，信号放大能力优异，而且成本低廉。本发明提供的生物传感器灵敏度和准确性高，能够实现低丰度生物标志物的定量检测，并且对样品的需求量小，使用方法简单，具有广阔的应用前景。

Description

DNA双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其 使用方法和它们的应用
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，具体涉及一种DNA双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一种调控内源性基因的非编码小RNA单链片段，可用作生物标志物进行监控和检测。近年来，越来越多的研究表明，miRNA表达水平变化可以引起细胞分化、增殖、凋亡等细胞活动的异常，从而使得miRNA成为了一种重要的生物标志物。某些miRNA作为抑癌基因，或者参与了肿瘤的发展，在人体生长、发育、疾病发生发展过程中发挥重要调控作用，被作为癌症诊断和治疗的重要生物标志物。因此，开发简单、灵敏、可靠的方法对miRNA进行检测对于癌症等重大疾病研究具有重要意义。
传统的miRNA分析检测方法包括Northern Blotting、芯片技术、生物荧光检测、定量荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。然而，这些方法往往基于核酸杂交的机理，结合核酸扩增或标记的手段实现检测目的，这使得其往往具有耗时长、费用高、灵敏度不足等缺陷，使其应用和发展受到限制。而且，当采用的样本为体液时，上述方法进行miRNA检测过程中对样品的需求量较大，这使得检测成本进一步提高，当进行医学检测时，样品的大量需求还增加了患者的痛苦。
DNA步行者(DNA Walker)是一种具有自主运动能力和较高生物相容性的信号放大策略，一般指在目标物的触发下，可以沿着设计的轨迹持续行走，并伴有信号增强的一类DNA纳米结构，常用于生物传感器中，用于增强目标生物标志物的信号强度，从而对其进行检测。但是现有的DNA步行者的轨道往往基于燃烧桥机制，是一次性使用的，并且过程中无法避免酶的参与，而酶的不稳定性和高昂价格使得这一方法也受到与传统方法类似的限制，使得DNA步行者的优势受限，在miRNA检测中无法充分发挥其作用。
因此，亟需开发一种能够脱离酶使用的DNA步行者以及基于其开发的生物传感器，以克服现有技术中miRNA检测方法复杂、耗时长、费用高、灵敏度不足、选择性差、样品需求量大等缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的生物标志物检测，尤其是miRNA检测中方法复杂、耗时长、费用高、灵敏度不足、样品需求量大等问题，提供一种基于纳米电极的生物传感器，该生物传感器具有制备和使用方法简单、灵敏度高、选择性好的优点，并且该生物传感器使用中无需酶的参与，进一步降低了检测成本，并且避免了酶的不稳定性对检测结果准确性的影响。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种DNA双足步行者信号放大器，所述DNA双足步行者信号放大器包括：DNA探针W1、DNA探针W2、DNA探针FS和DNA探针HP；
其中，DNA探针W1为发夹结构探针，分为三个部分：W1-1、W1-2和W1-3；
DNA探针W2为发夹结构探针，分为三个部分：W2-1、W2-2和W2-3；
DNA探针HP为发夹结构探针，能够与DNA探针W1的W1-3部分和DNA探针W2的W2-3部分杂交，以打开DNA探针HP的发夹结构并将DNA探针W1和DNA探针W2分别锚定在电极表面；
DNA探针FS为发夹结构探针，能够通过催化发夹自组装反应与DNA探针HP杂交以打开自身发夹结构，替换并释放与DNA探针HP杂交的DNA探针W1或DNA探针W2；
W1-1能够在目标序列的参与下与DNA探针W2的W2-1序列通过催化发夹反应杂交互补；
W1-2和W2-2为调节长度部分，用于调节DNA探针W1和W2的长度；
W1-3和W2-3为与DNA探针HP杂交部分。
本发明第二方面提供一种基于纳米电极的生物传感器，所述生物传感器包括：纳米电极和如上所述的DNA双足步行者信号放大器。
本发明第三方面提供使用如上所述的生物传感器进行目标miRNA检测的方法，该方法包括：
(1)将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS分别溶解于缓冲液中，而后将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS的缓冲溶液混合，获得混合溶液I；
(2)将DNA探针HP溶解于缓冲液中，将HP溶液与还原剂混合，获得混合溶液II，而后将纳米电极浸入混合溶液II，封闭后获得MCH/HP/Au NDE电极；
(3)将样品、与混合溶液I混合，获得混合溶液III，将MCH/HP/Au NDE电极浸入混合溶液III中并对混合溶液III的电信号进行检测和分析，以确定样品中目标miRNA的含量。
本发明第四方面提供如上所述的DNA双足步行者信号放大器、生物传感器或方法在检测生物标志物中的应用。
通过上述技术方案，本发明提供的生物传感器能够实现简单、低成本的生物标志物检测，尤其是miRNA的检测。并且，本发明提供的生物传感器还具有样品需求量小、检测灵敏度高、选择性好等优点。本发明提供的生物传感器使用中还不需要酶的参与，样品和轨道能够重复使用，进一步降低了检测成本。另外，本发明提供的生物传感器信号放大能力优异，且无需人工干预，具有快速、自动化等优点，尤其适合低丰度核酸(例如miRNA)的精准检测，而且，该生物传感器的高精准性使得其在实际检测中能够实现对目标检测物的精准定量。
附图说明
图1是本发明提供的生物传感器的检测原理示意图；
图2是本发明实施例中采用的金纳米盘电极在5mM二茂铁乙腈溶液中的CV扫描图；
图3是本发明实施例中采用的金纳米盘电极在COMSOL中模拟的在5mM二茂铁乙腈溶液中的CV扫描图；
图4是本发明实施例中采用的金纳米盘电极的电极修饰过程中的循环伏安图；
图5是本发明实施例中采用的生物传感器制备过程中的方波伏安图；
图6是本发明实施例中采用的生物传感器中DNA双足步行者信号放大器中的各探针杂交凝胶电泳图；
图7A是实施例2中采用本发明提供的生物传感器进行不同浓度miRNA-21检测时的方波伏安图，图7B是MB峰电流与miRNA-21浓度的对数的线性拟合曲线；
图8为实施例1中本发明提供的生物传感器对目标序列(miRNA-21)和其他miRNA及蛋白(干扰物)的特异性响应信号；
图9为实施例1中采用同一纳米生物传感器连续五天进行样品检测的信号变化结果；
图10为实施例3中对细胞样品中miRNA-21含量的检测结果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述，应当能够理解的是，以下具体实施方式仅用于解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
DNA步行者常用于生物传感器中作为信号放大器使用，增强目标生物标志物(例如包括DNA、RNA、miRNA等的核酸片段和蛋白质等)的信号强度(例如电信号、荧光信号等)，提高检测灵敏度。DNA步行者主要有三大组件：步行组件、轨道组件和驱动组件。本发明的发明人在研究的过程中发现，以目标物诱导的催化发夹自组装反应构成DNA双链(两端有相同的序列作为足)作为双足步行者，与目前本领域常用的蠕动式的单足步行者相比，其采用双足行走，更稳定、高效而且还可以有效避免步行者的脱轨。与现有的一端固定的单臂步行者相比，行走更自由，活动范围更大，信号放大效果更好、灵敏度更高。而且，本发明的发明人还发现，在以催化发夹自组装反应为驱动力，驱动步行者行走时可以不使用酶，并且轨道可加热解链处理后重复使用，与现有的依赖酶的DNA步行者相比成本更低，运转效率更高，并且避免了酶本身的不稳定性造成的检测不稳定，从而使得上述DNA双足步行者更加稳定可靠。
在本发明中，目标物诱导下的催化发夹探针自组装构成双足步行者，目标物可循环使用，即一个目标物可对应N个DNA步行者，DNA步行者能够以类似机器的机械化持续运动，在驱动力的作用下沿着电极表面设计的轨迹多步行走，每一步的行走即引入一个信号探针，使信号在不断的行走中自动富集和放大，将目标物和大量的信号探针关联在一起，从而具有优异的信号放大能力，非常适合低丰度核酸(例如miRNA)的精准检测。
本发明第一方面提供一种DNA双足步行者信号放大器，所述DNA双足步行者信号放大器包括：DNA探针W1、DNA探针W2、DNA探针FS和DNA探针HP；
其中，DNA探针W1为发夹结构探针，分为三个部分：W1-1、W1-2和W1-3；
DNA探针W2为发夹结构探针，分为三个部分：W2-1、W2-2和W2-3；
DNA探针HP为发夹结构探针，能够与DNA探针W1的W1-3部分和DNA探针W2的W2-3部分杂交，以打开DNA探针HP的发夹结构并将DNA探针W1和DNA探针W2分别锚定在电极表面；
DNA探针FS为发夹结构探针，通过催化发夹自组装反应与DNA探针HP杂交以打开自身发夹结构，替换并释放与DNA探针HP杂交的DNA探针W1和/或DNA探针W2；
W1-1能够在目标序列的参与下与DNA探针W2的W2-1序列通过催化发夹反应互补杂交；
W1-2和W2-2为调节长度部分，用于调节DNA探针W1和W2的长度；
W1-3和W2-3为与DNA探针HP杂交部分。
本发明提供的DNA双足步行者信号放大器中，DNA探针W1和W2为其步行组件，DNA探针HP为其轨道组件，DNA探针FS为其驱动组件。上述探针均为发夹结构探针，但各探针之间不能自发进行杂交，只有当目标序列与W1、W2和FS处于同一体系中时，目标序列通过与W1的5’末端暴露的特异性支点相结合而打开W1的发夹结构，与W1-1的部分序列形成杂交双链，而后打开的W1上暴露的另一支点与W2-1的部分序列结合而打开了W2的发夹结构，由于与目标序列相比，W1和W2之间互补序列更多，作用力更强，因此W1-1和W2-1形成部分杂交双链，释放目标序列，而释放出的目标序列又可循环用于下一个步行者的构建。而W1和W2的剩余的部分(即W1-2、W1-3、W2-2和W2-3)则分别位于双链两端，此时催化发夹自组装反应完成，步行组件构建成功。对于探针W1和W2而言，W1-1和W2-1为连接部分，W1-2和W2-2为调节长度部分，W1-3和W2-3则为两足。探针HP由于其5’末端带有修饰(例如巯基修饰)，通过(金-硫键)自组装在纳米电极(例如金纳米电极)表面构成轨道组件，为发夹结构，由于暴露的支点碱基较少，单个的W1或W2不能打开其发夹，但当W1和W2组合成双足步行者，由于临近效应，双足步行者的足可以通过HP上暴露的支点与HP结合，打开其发夹结构，从而锚定在电极表面，这时带电信号标记(例如MB或Fc)的探针FS与打开的HP的另一端暴露的支点相结合，由于互补序列较多，结构更加稳定，通过链置换反应将双足步行者的足替换下来完成驱动，此时HP与FS结合成双链并将信号标记引入电极表面产生电信号，而被替换下来的足继续锚定下一个HP，如此反复，则双足步行者每行走一步就会引入一个信号标记分子，一个步行者可对应N个信号分子，而一个目标序列又对应N个步行者，从而使得本发明提供的DNA双足步行者信号放大器能够不依赖酶即实现对目标序列信号的放大和高效快捷检测。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述DNA探针W1中，W1-1构成茎环结构，W1-2和W1-3为依次连接于W1-1的3’末端的DNA单链。
本发明中，DNA探针W1的总长度可以根据目标序列的特征(例如目标序列的长度等)以及实际检测需要等条件进行调整优化。根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，当目标序列为miRNA-21时，所述DNA探针W1的总长度为6-10nt+48-66bp。其中，W1-1的长度可以为6-10nt(环部)+33-38bp(茎部)，W1-2的长度可以为3-12nt，W1-3的长度可以为12-16nt。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述DNA探针W2中，W2-1构成茎环结构，W2-2和W2-3为依次连接于W2-1的3’末端的DNA单链。
本发明中，DNA探针W2的总长度可以根据目标序列的特征(例如目标序列的长度等)以及实际检测需要等条件进行调整优化。根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，当目标序列为miRNA-21时，所述DNA探针W2的总长度为11-16nt+28-56bp。其中，W2-1的长度可以为11-16nt(环部)+14-28bp(茎部)，W2-2的长度可以为3-12nt，W2-3的长度可以为12-16nt。
根据本发明的优选实施方式，其中，出于双足步行者的长度需满足其双足可以和任意相邻两个HP探针之间杂交的考虑，DNA探针W1和W2中，W1-2和W2-2由n个胸腺嘧啶组成，n为3-12之间的整数，优选6-9之间的整数。
优选地，W1-2和W2-2的序列长度相同。
根据本发明的优选实施方式，其中，W1-3和W2-3的序列相同。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述DNA探针FS与DNA探针HP序列中的至少60-80％，优选至少64-75％的碱基能够互补。
本发明中，DNA探针FS和HP的长度可以根据W1和W2的长度以及目标序列的特点进行调整优化。
据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，当目标序列为miRNA-21时，所述DNA探针FS的总长度可以为12-16nt(环部)+16-31bp(茎部)。
据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，当目标序列为miRNA-21时，所述DNA探针HP的总长度可以为6-12nt(环部)+27-38bp(茎部)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述DNA探针W1和/或W2与DNA探针HP序列中的至少27-39％的碱基能够互补。
为了使检测更加方便快捷，根据本发明的优选实施方式，其中，DNA探针FS的3’末端带有标记(电信号标记)，所述标记可以选自亚甲基蓝和/或二茂铁。
根据本发明，为了使DNA探针HP发挥轨道组件的作用，所述DNA探针HP的5’末端带有修饰，根据一种优选的实施方式，其中，DNA探针HP的5’末端带有巯基修饰。
任意本领域现有的生物标志物均可采用本发明提供的DNA双足步行者信号放大器进行检测，并且可以根据实际需要对输出信号(检测信号)的类型进行选择。根据本发明的优选实施方式，其中，所述目标序列选自DNA、RNA和核酸适配体中的至少一种。例如可以是DNA片段、RNA片段(例如mRNA、miRNA等)。考虑到不同输出信号所对应的检测方法的灵敏度阈值，为了进一步提高本发明提供的DNA双足步行者信号放大器的信号放大能力即检测灵敏度，所述输出信号优选为电信号。
优选地，所述目标序列为RNA，优选为miRNA。
更优选地，所述DNA双足步行者信号放大器包括：
DNA探针W1，序列如SEQ ID NO:1所示，
DNA探针W2，序列如SEQ ID NO:2所示，
DNA探针FS，序列如SEQ ID NO:3所示，3’末端标记有亚甲基蓝，
DNA探针HP，序列如SEQ ID NO:4所示，5’末端修饰有巯基。
本发明第二方面提供一种基于纳米电极的生物传感器，所述生物传感器包括：纳米电极和如前所述的DNA双足步行者信号放大器。
本发明的发明人在研究的过程中发现，生物传感器采用的电极尺寸与其灵敏度呈负相关关系，即，电极尺寸越小，生物传感器的灵敏度越高。因此，采用纳米电极为基底时，与传统大电极(例如已实现标准化生产并可通过市售获得的直径1-5mm的金电极等，例如上海辰华有限公司生产的直径3mm的金电极)相比，生物传感器的传质速率快，灵敏度高的特点，进一步提高了其灵敏度。
任意本领域现有的纳米金电极均可适用于本发明提供的生物传感器，例如直径10-50μm的金电极(例如上海仙仁仪器仪表有限公司生产的金盘微电极)。根据本发明的优选实施方式，其中，所述纳米电极选自金纳米盘电极。所述金纳米盘电极可以为通过商购获得的相关产品，也可以是根据现有技术自行制备获得的相关产品。
优选地，所述纳米电极的尺寸为100-1000nm，优选为800-1000nm。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述生物传感器还包括缓冲液。
任意能够适用于生物标志物检测并且不会影响本发明提供的生物传感器的使用的缓冲液均可适用于本发明。优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲溶液(PBS)和/或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)。所述PBS和/或Tris-HCl缓冲液可以为本领域技术人员根据现有技术自行配制获得的，也可以是商购获得的相关产品。
本发明的发明人在研究的过程中发现，本发明提供的生物传感器由于采用了更为稳定的双足步行者信号放大器，检测更加稳定高效，灵敏度更高，并且不依赖于酶的加入，检测过程更加快速，非常适用于生物标志物，尤其是易降解、对灵敏度要求高的miRNA的检测。
本发明提供的生物传感器可以用于检测任意本领域现有生物标志物。根据本发明的优选实施方式，其中，所述生物传感器为用于检测miRNA的生物传感器。
通过对采用的DNA双足步行者信号放大器进行不同的设计，任意本领域现有用于生物标志物的miRNA均可采用本发明提供的生物传感器进行检测。优选地，所述miRNA选自miRNA-21、miRNA-155、miRNA-141和miRNA-199a中的至少一种。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述生物传感器为用于检测miRNA-21的生物传感器。
为了进一步提高所述生物传感器的灵敏度和检测效率。优选地，所述生物传感器包括：金纳米盘电极和DNA双足步行者信号放大器。
更优选地，所述DNA双足步行者信号放大器包括：
DNA探针W1，序列如SEQ ID NO:1所示，
DNA探针W2，序列如SEQ ID NO:2所示，
DNA探针FS，序列如SEQ ID NO:3所示，3’末端标记有亚甲基蓝，
DNA探针HP，序列如SEQ ID NO:4所示，
缓冲液(例如Tris-HCl、PBS等)。
本发明的优选实施方式中，所述生物传感器不包括酶(如核酸外切酶Ⅲ、限制性内切核酸酶Ⅱ、DNA切割酶等)。
本发明第三方面提供使用如前所述的生物传感器进行目标miRNA检测的方法，该方法包括：
(1)将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS分别溶解于缓冲液中，而后将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS的缓冲溶液混合，获得混合溶液I；
(2)将DNA探针HP溶解于缓冲液中，将HP溶液与还原剂混合，获得混合溶液II，而后将纳米电极浸入混合溶液II，封闭后获得MCH/HP/Au NDE电极；
(3)将样品、与混合溶液I混合，获得混合溶液III，将MCH/HP/Au NDE电极浸入混合溶液III中并对混合溶液III的电信号进行检测和分析以确定样品中目标miRNA的含量。
由于退火后DNA探针能更好的形成发夹结构，从而更利于本发明提供的方法中生物传感器的使用和检测结果的准确性和稳定性。因此，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中，在将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS分别溶解于缓冲液后，需要对其分别进行退火处理，而后再利用退火后的探针缓冲溶液进行混合溶液I的配制。
本领域技术人员可以根据实际需要对步骤(1)中采用的DNA探针W1、W2和FS的浓度进行调整，只要其浓度能够满足检测需要即可。出于缩短检测时间，较容易检测出电信号的目的，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中，所述DNA探针W1、W2和FS的用量使得其在缓冲液中的浓度分别为50nM-1μM、50nM-1μM、1μM-2.5μM。
优选地，步骤(1)中，所述混合溶液I中，DNA探针W1、W2和FS的浓度比为1:1:20-50。由于双足步行者需要W1和W2按1:1杂交形成，因此二者浓度比应严格控制为1:1，以确保检测准确，并且避免浪费试剂造成检测成本增加。
由于退火后DNA探针能更好的形成发夹结构，从而更利于本发明提供的方法中生物传感器的使用和检测结果的准确性和稳定性。因此，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，在将DNS探针HP溶解于缓冲液后，需要对其进行退火处理，而后再利用退火后的HP溶液进行混合溶液II的配制。
本领域技术人员可以根据实际需要对步骤(2)中采用的DNA探针HP的浓度进行调整，只要其浓度能够满足检测需要即可。出于缩短检测时间，较容易检测出电信号的目的，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，所述DNA探针HP的用量使得其在缓冲液中的浓度为0.5μM-2μM。
本领域技术人员可以根据实际需要对步骤(2)中采用的还原剂的用量进行调整，只要其浓度能够满足检测需要即可。为了能较快还原探针HP的双硫键，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，还原剂的用量使得其在所述混合溶液II中的浓度为10μM-20μM。
优选地，步骤(2)中，DNA探针HP与还原剂的浓度比为1：20-40。
只要能够满足检测需要，任意用量的混合溶液II均可适用于本发明提供的方法。出于尽可能减少实验用量，节约检测成本等考虑，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，所述混合溶液II的用量为20-50μL。
任意本领域现有的用于还原核酸中修饰的巯基的还原剂均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或二硫代苏糖醇。
本发明提供的方法中，步骤(3)中所述样品可以含有0-50pM的目标miRNA。若样品中不含目标miRNA，则对混合溶液III的检测不会显示电信号的变化。当样品中含有目标miRNA时，在目标物诱导下产生双足步行者与探针HP杂交，而后带有电信号标记的DNA探针FS与HP竞争杂交形成双链，电极产生电信号，对混合溶液III的检测结果显示出电信号的变化。并且，本领域技术人员可以采用不同浓度的标准样品分别进行检测，绘制标准曲线，实现对目标miRNA的定量检测。本领域技术人员可以根据实际需要对步骤(3)中采用的样品用量即目标miRNA的浓度进行调整，只要目标miRNA的浓度能够达到检测灵敏度即可。根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中，所述样品的用量使得样品中的目标miRNA在所述混合溶液III中的浓度为0.1fM-50pM。也即，本发明提供的方法中，对于0.1fM的目标miRNA即可准确检出。
只要能够满足检测需要，任意用量的混合溶液I均可适用于本发明提供的方法。出于尽可能减少实验用量，节约检测成本等考虑，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中，混合溶液I的用量为20-50μL。
本发明的优选实施方式中，所述方法不包括使用酶(如核酸外切酶Ⅲ、限制性内切核酸酶Ⅱ、DNA切割酶等)的操作。
本发明第四方面提供如前所述的DNA双足步行者信号放大器生物传感器或方法在检测生物标志物中的应用。
本发明提供的DNA双足步行者信号放大器生物传感器或方法可以检测任意本领域现有的生物标志物，例如DNA、RNA、核酸适配体等。根据本发明的优选实施方式，其中，所述生物标志物选自RNA。
优选地，所述生物标志物选自miRNA。
更优选地，所述miRNA选自miRNA-21、miRNA-155、miRNA-141和miRNA-199a中的至少一种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述和说明。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，采用的miRNA-21及DNA探针均为委托上海生工生物工程股份有限公司合成。
以下实施例中使用的生物传感器中所采用的金纳米盘电极按照如下方法制备获得：将直径25μM的金线(长约2cm)装入长度约8cm、内径0.64mm，外径1mm的毛细管中，使用激光拉制仪P-2000(购自美国Sutter公司)将毛细管拉成两根针状毛细管。具体方法为：拉制仪真空状态下加热，温度为420±30℃，加热分4次完成，每次加热40±5s，冷却17±3s，使毛细管与金线充分熔融，加热完成后取下夹具，切换程序拉成针状毛细管，程序设置温度430±30℃，拉力140±10N，速率50±5m/s，加热时间2-3s，拉断后，将毛细管尖端置于显微镜下观察，能看到直径小于100nm的金丝包裹在玻璃中，针状毛细管尾部用钨丝及导电胶连接导电，经过砂纸打磨露出金端，即为金纳米盘电极。金纳米盘的半径可由以下公式来计算得到：
id＝4nFDCba
其中，id代表稳态极限电流；n代表每摩尔分子的电子转移数,D代表扩散系数，F是法拉第常数，Cb代表氧化还原活性物质的浓度，a代表电极半径。
将制备获得的金纳米盘电极在5mM二茂铁(乙腈)溶液中进行CV图扫描，扫速20mV/s，结果如图2所示。从图2中可以看出，随着电极半径的增加，电极的稳态极限电流也增加，且都呈现良好的S型，与COMSOL模拟软件模拟的循环伏安图(图3)对比可以看出，实验与模拟的结果是完全吻合的，模拟的循环伏安曲线是理想状态，没有充电电流，在电位反扫时能够与氧化过程完全重合，呈现完美的“S”型。而实验结果的充电电流也很小，说明电极表面的电子传递动力学完全符合上述公式，没有出现漏液等情况，纳米盘电极制备成功。
以下实施例中，未作特殊说明的情况下，“室温”是指25±3℃。
实施例1
本实施例用于示例性地说明以miRNA-21为目标序列时，本发明提供的生物传感器的制备过程以及验证其选择性和稳定性。
(一)生物传感器的制备
表1
Figure BDA0002997264400000151
*核酸探针FS中，亚甲基蓝连接在3’端的带有下划线的A碱基上。
**核酸探针HP中，5’端具有巯基修饰。
(1)将DNA探针W1、W2、FS(具体序列见表1)分别用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液溶解成50μM的溶液；分别加热至95℃(升温速率为10℃/min)保持5min，再慢慢冷却到室温(降温速率为4℃/min)以退火。退火后，将探针W1和W2溶液用Tris-HCl(pH7.4)缓冲液分别稀释至100nM后混合，而后再加入探针FS溶液(终浓度2μM)混合。
(2)将DNA探针HP(具体序列见表1)用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液溶解成50μM的溶液，加热到95℃保持5min，再慢慢冷却到室温(降温速率为4℃/min)以退火。而后加入TCEP(1mM)避光孵育1h以还原双硫键。然后用Tris-HCl缓冲液将HP探针稀释至1μM。
将金纳米盘电极浸入稀释后的HP溶液中37℃浸泡3h，经Au-S键自组装后，HP修饰在电极表面，得HP/Au电极，经5μM巯基己醇钝化1小时，钝化电极表面(具体钝化效果详见图4)并使HP呈有规则的直立状态，用蒸馏水洗去未修饰探针后获得MCH/HP/Au NDE电极。将该电极浸在PBS(pH7.4,100mM NaCl)缓冲溶液中，4℃保存备用。
每次对电极表面的修饰处理完成后，均采用5mM K3Fe(CN)6和100mM NaCl的混合溶液扫CV图，以检测电极表面电子传递情况。具体扫描条件为：在CHI660D电化学工作站(购自上海辰华公司)上，以金纳米电极为工作电极，铂丝作为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，电位设置0V-0.6V，结果如图4所示，其中，曲线a为裸电极的循环伏安图，曲线b为HP/Au NDE电极的循环伏安图，曲线c为HP/Au NDE电极在巯基己醇(MCH)中钝化后的循环伏安图，曲线d为MCH/HP/Au NDE电极在100nM W1,100nM W2,2μM FS和1pM miRNA-21孵育2h后的循环伏安图。从图4中可以看出，电极上每一步DNA或MCH的修饰，会阻碍电极表面电子传递，对应的CV极限电流下降。说明该miRNA生物传感器制备成功。
(3)将步骤(2)中制备的生物传感器按顺序分别在PBS(10mM,100mM NaCl,5mMMgCl2,pH7.4)缓冲溶液和含2μM FS探针的PBS缓冲溶液(10mM,100mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.4)中各孵育2小时。而后在DNA探针W1、W2、FS和miRNA-21的混合溶液中孵育2小时，该混合溶液中W1探针的浓度为100nM，W2探针的浓度为100nM，FS探针的浓度为2μM，miRNA-21的浓度为1pM。在PBS(10mM,100mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.4)缓冲液中扫SWV图。具体条件为：在CHI660D电化学工作站上，以金纳米电极为工作电极，铂丝作为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，电位设置-0.6V-0V，频率25Hz，振幅0.025mV，结果如图5所示。其中，曲线a为MCH/HP/AuNDE电极的方波伏安图，曲线b为MCH/HP/Au NDE电极在2μM FS的混合溶液中培育2小时后的方波伏安图，曲线c为MCH/HP/Au NDE电极在100nM W1,100nm W2，2μM FS的混合溶液中培育2小时后的方波伏安图，曲线d为MCH/HP/Au NDE电极在100nM W1,100nm W2，2μM FS，1pMmiRNA-21的混合溶液中培育2小时后的方波伏安图。从图5中可以看出，只有当目标物miRNA-21加入，W1、W2和FS才能作用起来，才会有明显的SWV信号。
采用16重量％聚丙烯酰胺凝胶(采用1×TBE缓冲液配制)电泳对本实施例中制备的生物传感器中各探针之间的杂交关系进行验证。具体方法如下：
每孔样品上样量为10μL，上样样品为DNA样品与DNA加样缓冲液按照5:5(v/v)比例配制的混合溶液，其中DNA样品的浓度为2μM。上样顺序为：Marker(左)，miRNA-21(泳道1)，探针W1(泳道2)，探针W2(泳道3)，探针W1+W2(泳道4)，miRNA-21+探针W1+探针W2(泳道5)，探针HP(泳道6)，探针FS(泳道7)，探针HP+FS(泳道8)。电泳条件为：电压110V，时间110min。溴化乙锭染色后，于伯乐公司Gel Doc XR+凝胶成像仪扫描获得电泳图(如图6所示)。
从图6中可以看出，不存在目标序列miRNA-21时，探针W1和W2电泳结果并未出现新的条带(泳道4)，而当存在目标序列miRNA-21时，则会产生分子量更低的新条带(泳道5)，这说明，只有当目标序列miRNA-21存在时，触发催化发夹自组装反应，DNA探针W1和W2才会杂交使得双足步行者成功组装。而泳道6-8中均未出现新条带，这说明了DNA探针HP和FS没有目标序列miRNA-21存在的体系中不会自发地杂交。
(二)生物传感器选择性验证
选择与目标序列(miRNA-21)序列相近的miRNA-199a，miRNA-155，miRNA-141和蛋白分子凝血酶(购自上海睿铂赛公司)作为干扰物(对照)。分别在单独含有miRNA-21(1pM)和其他干扰物(各10pM)的溶液(采用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液配制)中，以及含有miRNA-21(1pM)和其他干扰物(各10pM)的混合溶液(采用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液配制)中，对实验(一)所制得的生物传感器进行SWV扫描。结果详见图8。
从图8中可以看出，当目标序列(miRNA-21)存在时，能够明显检测出其MB信号，即使在含有多种序列相近的干扰物的混合溶液中，本发明提供的生物传感器也能准确检测出目标序列的信号。
(三)生物传感器稳定性验证
将实验(一)中制得的生物传感器浸泡在PBS(10mM,100mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.4)缓冲液中，并连续5天对其进行SWV信号扫描，每次检测完成后将其置于4℃保存。结果如图9所示(横坐标为天数)。
从图9中可以看出，虽然信号值略有下降，但是第5天的信号值仍保留原信号的89％，说明其稳定性良好。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的生物传感器在目标miRNA检测中的应用。
选用miRNA-21作为目标序列，将其采用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液配制成不同浓度梯度的溶液，将实施例1中实验(一)获得的生物传感器在含有100nM W1探针、100nM W2探针、2μM FS探针和不同浓度的目标序列的混合溶液中孵育2小时。然后在PBS缓冲液(10mM,100mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.4)中扫描SWV图，其结果如图7A所示。当miRNA-21浓度从0.1fM增加至50pM时，MB的峰电流也逐渐增强，峰电流与miRNA-21的浓度关系如图7B所示，峰电流与浓度的对数呈线性关系，线性方程为I(pA)＝10.59log C(fM)+12.83，R2＝0.9929。说明本发明提供的生物传感器及方法能够实现miRNA等生物标志物的准确定量检测。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的生物传感器在含目标miRNA的样品检测中的应用。
选用人宫颈癌细胞(Hela，购自中国科学院细胞库，上海)和乳腺癌细胞(MCF-7，购自中国科学院细胞库，上海)作为检测样品。将样品细胞在37℃，5％CO2条件下培养扩增，培养基选用含10重量％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基。采用Trizol试剂(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)进行细胞总RNA提取。
具体提取方法为：将细胞(用量约为1×107-5×107个)，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min，4℃下12000g×15min离心，取上清液，加入异丙醇0.5ml，轻轻混匀，静置10min，4℃下12000g×10min离心，弃上清液，加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃下7500g×5min离心，弃上清。让沉淀的RNA室温下晾干，加入适量的DEPC水(购自生工生物工程(上海)股份有限公司公司)溶解。
取裂解液5mL，加入100nM W1探针，100nM W2探针和2μM FS探针，将实施例1实验(一)中制得的MCH/HP/Au NDE电极浸入其中孵育2小时，取出后用无菌蒸馏水清洗，而后浸入PBS(10mM,100mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.4)溶液中以方波伏安法检测。
图10中示出了细胞数分别为100、1000和10000的样品(分别对应x坐标轴的a、b和c)中检测获得的SWV信号，从中可以看出，当样品中Hela和MCF-7细胞数目增加，其SWV信号也随着增大，且MCF-7细胞的信号要比Hela细胞的信号值大得多，说明MCF-7细胞中miRNA-21的含量明显高于Hela细胞，这与之前的研究结果(例如Analytical Chemistry,2018,90(15),9538-9544；Analytical Chemistry,2015,87(16),8578-8583)一致。说明本发明制备的生物传感器可以实现细胞中miRNA-21的灵敏检测，具有实际检测能力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 皖南医学院
<120> DNA双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它
们的应用
<130> WHI09297-WNMC-CJ
<150> 202110274712.2
<151> 2021-03-15
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> DNA探针W1
<400> 1
tcaacatcag tctgataagc taccatgtgt agatagctta tcagactttt tttcgacatc 60
taacctagct ca 72
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> DNA探针W2
<400> 2
taagctatct acacatggta gcttatcaga ctccatgtgt agattttttt cgacatctaa 60
cctagctca 69
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> DNA探针FS
<400> 3
gatgtcgtct acacatggcg acatctaacc tagcccatgt gtaga 45
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> DNA探针HP
<400> 4
cagtgagcta ggttagatgt cgccatgtgt agacgacatc taacctagc 49

Claims (10)

1.一种DNA双足步行者信号放大器，其特征在于，所述DNA双足步行者信号放大器包括：DNA探针W1、DNA探针W2、DNA探针FS和DNA探针HP；
其中，DNA探针W1为发夹结构探针，分为三个部分：W1-1、W1-2和W1-3；
DNA探针W2为发夹结构探针，分为三个部分：W2-1、W2-2和W2-3；
DNA探针HP为发夹结构探针，能够与DNA探针W1的W1-3部分和DNA探针W2的W2-3部分杂交，以打开DNA探针HP的发夹结构并将DNA探针W1和DNA探针W2分别锚定在电极表面；
DNA探针FS为发夹结构探针，能够通过催化发夹自组装反应与DNA探针HP杂交以打开自身发夹结构，替换并释放与DNA探针HP杂交的DNA探针W1或DNA探针W2；
W1-1能够在目标序列的参与下与DNA探针W2的W2-1序列通过催化发夹反应互补杂交；
W1-2和W2-2为调节长度部分，用于调节DNA探针W1和W2的长度；
W1-3和W2-3为与DNA探针HP杂交部分。
2.根据权利要求1所述的DNA双足步行者信号放大器，其中，DNA探针FS的3’末端带有标记，所述标记选自亚甲基蓝和/或二茂铁；
和/或，DNA探针HP的5’末端带有巯基修饰；
和/或，W1-2和W2-2由n个胸腺嘧啶组成，n为3-12之间的整数，优选为6-9之间的整数；
和/或，W1-3和W2-3的序列相同；
和/或，所述目标序列选自DNA、RNA和核酸适配体中的至少一种；
优选地，W1-2和W2-2的长度相同；
优选地，所述目标序列为RNA，优选为miRNA。
3.一种基于纳米电极的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括：纳米电极和权利要求1或2所述的DNA双足步行者信号放大器。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其中，所述纳米电极选自金纳米盘电极；
优选地，所述纳米电极的尺寸为100-1000nm，优选为800-1000nm。
5.根据权利要求3或4所述的生物传感器，其中，所述生物传感器还包括缓冲液；
优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲溶液和/或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的生物传感器，其中，所述生物传感器为用于检测miRNA的生物传感器；
优选地，所述miRNA选自miRNA-21、miRNA-155、miRNA-141和miRNA-199a中的至少一种。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的生物传感器，其中，所述生物传感器为用于检测miRNA-21的生物传感器；
优选地，所述生物传感器包括：金纳米盘电极和DNA双足步行者信号放大器；
更优选地，所述DNA双足步行者信号放大器包括：
DNA探针W1，序列如SEQ ID NO:1所示，
DNA探针W2，序列如SEQ ID NO:2所示，
DNA探针FS，序列如SEQ ID NO:3所示，3’末端标记有亚甲基蓝，
DNA探针HP，序列如SEQ ID NO:4所示，5’末端修饰有巯基，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
8.使用权利要求3-7中任意一项所述的生物传感器进行目标miRNA检测的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS分别溶解于缓冲液中，而后将DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS的缓冲溶液混合，获得混合溶液I；
(2)将DNA探针HP溶解于缓冲液中，将所得DNA探针HP溶液与还原剂混合，获得混合溶液II，而后将纳米电极浸入混合溶液II，封闭后获得MCH/HP/Au NDE电极；
(3)将样品与混合溶液I混合，获得混合溶液III，将MCH/HP/Au NDE电极浸入混合溶液III中并对混合溶液III的电信号进行检测和分析，以确定样品中目标miRNA的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)中，所述DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS的用量使得其在缓冲液中的浓度分别为50nM-1μM、50nM-1μM、1μM-2.5μM；
和/或，步骤(2)中，所述DNA探针HP的用量使得其在缓冲液中的浓度为0.5μM-2μM；
和/或，步骤(2)中，所述还原剂的用量使得其在所述混合溶液II中的浓度为10μM-20μM；
和/或，步骤(2)中，所述混合溶液II的用量为20μL-50μL；
和/或，步骤(3)中，混合溶液I的用量为20μL-50μL；
优选地，步骤(1)中，所述混合溶液I中，DNA探针W1、DNA探针W2和DNA探针FS的摩尔浓度比为1:1:20-50；
优选地，步骤(2)中，DNA探针HP与还原剂的摩尔浓度比为1：20-40；
优选地，步骤(2)中，所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或二硫代苏糖醇。
10.权利要求1或2中所述的DNA双足步行者信号放大器、权利要求3-7中任意一项所述的生物传感器或权利要求8或9中所述的方法在检测生物标志物中的应用。
CN202110335296.2A 2021-03-15 2021-03-29 Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用 Withdrawn CN113219031A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110274712 2021-03-15
CN2021102747122 2021-03-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113219031A true CN113219031A (zh) 2021-08-06

Family

ID=77084331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110335296.2A Withdrawn CN113219031A (zh) 2021-03-15 2021-03-29 Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113219031A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114674899A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 北京化工大学 一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法
CN114878647A (zh) * 2022-03-18 2022-08-09 江苏省农业科学院 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105973963A (zh) * 2016-04-26 2016-09-28 中南大学 发夹dna支撑双信号分子传感界面的构建方法及应用
JP2017079634A (ja) * 2015-10-27 2017-05-18 国立大学法人 熊本大学 生体試料中の目的とする細胞を検出する方法
CN108169203A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 济南大学 一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用
CN108445067A (zh) * 2018-05-04 2018-08-24 安徽师范大学 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用
CN110146566A (zh) * 2019-06-14 2019-08-20 西南大学 修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用
CN110501411A (zh) * 2019-09-17 2019-11-26 济南大学 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用
CN112251496A (zh) * 2020-10-22 2021-01-22 重庆医科大学 一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017079634A (ja) * 2015-10-27 2017-05-18 国立大学法人 熊本大学 生体試料中の目的とする細胞を検出する方法
CN105973963A (zh) * 2016-04-26 2016-09-28 中南大学 发夹dna支撑双信号分子传感界面的构建方法及应用
CN108169203A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 济南大学 一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用
CN108445067A (zh) * 2018-05-04 2018-08-24 安徽师范大学 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用
CN110146566A (zh) * 2019-06-14 2019-08-20 西南大学 修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用
CN110501411A (zh) * 2019-09-17 2019-11-26 济南大学 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用
CN112251496A (zh) * 2020-10-22 2021-01-22 重庆医科大学 一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王冬梅: "单一纳米电极的制备及应用", 《中国博士学位论文全文数据库（工程科技Ⅰ辑）》 *
陶秀丽: "DNA 步行器的构建及其在生命分析的应用", 《化学传感器》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114878647A (zh) * 2022-03-18 2022-08-09 江苏省农业科学院 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法
CN114878647B (zh) * 2022-03-18 2024-04-09 江苏省农业科学院 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法
CN114674899A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 北京化工大学 一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022095373A1 (zh) 一种检测miRNA的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系
US10605761B2 (en) Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme
Zhang et al. A novel electrochemical cytosensor for selective and highly sensitive detection of cancer cells using binding-induced dual catalytic hairpin assembly
US9335292B2 (en) Electrochemical proximity assay
CN113219031A (zh) Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用
Jiao et al. Electrochemical detection of circRNAs based on the combination of back-splice junction and duplex-specific nuclease
CN109738503B (zh) 一种基于核酸外切酶ⅲ的正反馈放大电化学传感器
Gao et al. Molecular beacon mediated circular strand displacement strategy for constructing a ratiometric electrochemical deoxyribonucleic acid sensor
CN110274941A (zh) 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法
CN108519417B (zh) 一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途
Qian et al. A novel label-free and enzyme-free electrochemical aptasensor based on DNA in situ metallization
CN111440851A (zh) 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用
CN112903786B (zh) 基于无酶级联循环信号放大的血清中循环miRNA的电化学检测方法
Xie et al. A novel electrochemical aptasensor for highly sensitive detection of thrombin based on the autonomous assembly of hemin/G-quadruplex horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme nanowires
Zhao et al. Toehold-mediated strand displacement reaction triggered by nicked DNAzymes substrate for amplified electrochemical detection of lead ion
Chai et al. Ultrasensitive assay of ctDNA based on DNA triangular prism and three-way junction nanostructures
Yan et al. A Simple and Highly Sensitive Electrochemical Biosensor for microRNA Detection Using Target‐Assisted Isothermal Exponential Amplification Reaction
Meng et al. A PCR-free voltammetric telomerase activity assay using a substrate primer on a gold electrode and DNA-triggered capture of gold nanoparticles
CN112410330A (zh) 一种dna探针、通用电化学传感平台及其检测方法与应用
CN108445067B (zh) 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用
CN117368284A (zh) 一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备方法与应用
CN109136334B (zh) 基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法
Kong et al. A homogenous electrochemical sensing DNA sensor by using bare Au electrode based on potential-assisted chemisorption technique
Weng et al. Detection of Epidermal Growth Factor Receptor Gene Status via a DNA Electrochemical Biosensor Based on Lambda Exonucleaseassisted Signal Amplification
Liang et al. Integration of exonuclease III-assisted recycling amplification and multi-site enzyme polymerization labeling for sensitive detection of p53 gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210806

WW01 Invention patent application withdrawn after publication