CN108445067B - 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 - Google Patents
一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108445067B CN108445067B CN201810418796.0A CN201810418796A CN108445067B CN 108445067 B CN108445067 B CN 108445067B CN 201810418796 A CN201810418796 A CN 201810418796A CN 108445067 B CN108445067 B CN 108445067B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- probe
- mirna
- double
- gold
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 67
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 38
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 21
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 15
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 claims description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylhexan-1-ol Chemical compound CCCCCC(O)S AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 claims description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 61
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 22
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 15
- 238000004365 square wave voltammetry Methods 0.000 description 15
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- UBCZLWARZCERJD-UHFFFAOYSA-N cyclopentane;2-cyclopentylacetonitrile;iron Chemical compound [Fe].[CH]1[CH][CH][CH][CH]1.N#CC[C]1[CH][CH][CH][CH]1 UBCZLWARZCERJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108091057645 miR-15 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器、制备方法及其应用，与现有技术相比，本发明为了放大电化学响应，使用“ΔIMB+ΔIFc”作为响应信号来定量测定miRNA浓度。与现有技术相比，与现有技术相比，本发明提供的电化学传感器的灵敏度高，选择性高，检测限低，不需要复杂的操作步骤和样品预处理，操作简单，且可以很快的得到结果；仪器小、轻便、廉价，花费小；电极尺寸小，传质速率快，检测更灵敏。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器、制备方法及其应用。
背景技术
RNA(Ribonucleic Acid)存在于生物细胞中以及部分病毒、类病毒中，是由核糖核苷酸分子经磷酸二酯键缩聚而成的长链分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA 是基因表达的关键调控因子,参与调控细胞周期、细胞增殖、分化、凋亡、代谢和转录。
MicroRNA(miRNA)是一类包含18-25个核苷酸长的非编码内源性RNA单链。虽然这些分子是非编码的，但它们在基因表达中起着至关重要的作用。它们可以通过与mRNA的3'非翻译区的互补结合来调节植物和动物中基因表达。
最近，证明了miRNA在癌症中起重要作用。不规则的miRNA表达和许多疾病有关联，例如神经障碍、肿瘤、心血管和自身免疫性疾病。miRNA在癌细胞中的表达失调、在癌症细胞中变异的miRNA表达的独特模式可以作为诊断指纹。因此，在多原发性和转移性癌症中miRNA 的表达水平被用于构建能够通过其原发部位识别癌症转移的miRNA分类器。两种最有特点的肿瘤抑制miRNA是miR-15和miR-16。B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)是发达国家最常见的成人白血病，与染色体区域的丢失有关。该区域包含miR-15和miR-16，其在约70％的CLL 患者中丢失。因此，miRNA是癌症生物标志物的良好候选物，并且可能预示诊断，预后和预测。
RNA生物标志物的研究发展迅速，涌现了大量高性能的RNA检测方法。这些方法大多基于分子生物学技术，如定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、微阵列和RNA测序。但这些方法通常须要一些繁琐的样品预处理步骤和昂贵的仪器。此外，为了避免样本的异质性，在体液中检测RNA生物标记物需要相对较大的样本容量。为获得相对稳健、准确和有效的方法，产生了几种基于纳米技术的RNA传感方法，包括光学和电化学方法。这些方法取样程序是比较简单的，能进行快速的分析。其中，电化学方法已经达到了超高灵敏度和选择性，具有多路复用分析的潜力。电化学RNA传感器的问题仍然存在，例如室温下RNA通常不稳定、易降解， RNA的制备和提取困难，生物环境复杂，RNA的长度各异、短RNA的检测困难等。
纳米技术的快速发展引领了新型生物传感技术的发展。例如光学传感器、纳米孔传感器、电化学生物传感器等。通常，一个有效的生物传感器主要由两个部分组成：一个受体(它专门识别目标分析物)和识别生物分子相互作用的传感器(信号生成和增强元素)，并将这种相互作用转化为信号进行测量。电化学RNA传感器大多是基于靶RNA序列与电极表面结合的互补受体(主要是DNA寡核苷酸)的杂交。用探针对RNA进行杂交，可以得到一个可测量的电化学信号。然后，对RNA的检测主要通过伏安法、安培法和阻抗法来进行。与此同时，也使用基于芯片的纳米结构微电极对RNA生物标志物进行多路复用检测，并开发出了少量的超灵敏电化学方法。发夹DNA探针是生物标志物筛选中用途最广泛的寡核苷酸探针之一，通常用于RNA 检测的光学和电化学分析。
目前，RNA检测技术步骤繁琐、耗时，仪器昂贵，测定复杂、灵敏度低等。在体液中检测RNA生物标记物需要相对较大的样本容量。室温下RNA通常不稳定、易降解，生物环境复杂，RNA的长度各异。且miRNA的长度短，检测困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器及其制备方法，灵敏度高，选择性高，检测限低，成本低。
本发明还提供了一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器检测miRNA-16的应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供的一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)将探针1P-MB与DTT缓冲溶液混合均匀后，静置；然后加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，再加入乙醇，混合，离心，除去上清液，干燥，即得处理后的探针1；
2)将步骤1)处理后的探针1用缓冲溶液溶解后，将金纳米线电极浸入探针1缓冲溶液中，孵育后，用巯基己醇封闭，得MB/NWE电极；
3)再将MB/NWE电极置于探针2P-Fc缓冲溶液中，杂交，探针2与探针1通过碱基对的互补配对，得Fc/MB/NWE电极，即为双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器。
步骤1)具体为：
将1OD的探针1与100uL DTT缓冲溶液混合均匀后，静置；然后加入200uL质量浓度6％的乙酸溶液和50uL 3M的乙酸钠溶液，再加入100％乙醇1.6mL，混匀，6000r/min转下离心5分钟，除去上清液，35℃恒温环境下通风一夜，干燥，即得处理后的探针1；
步骤1)探针1P-MB序列：5’-HS-SH-C6-TGG CAG CAC ATT GCC G-C6-MB-3’；
所述DTT缓冲溶液的制备方法为：
4mg DTT用100uL 0.1M pH8.5的tris-HCl缓冲溶液溶解。
步骤1)中所述静置时间为2-3h，优选在室温下静置。
步骤2)具体为：
将步骤1)处理后的探针1用0.01M的pH7.4的PBS缓冲溶液溶解，稀释到5uM；将金纳米线电极浸入探针1缓冲溶液中，恒温37℃下孵育8-12小时；然后室温下将电极浸入100uL浓度10uM的巯基己醇溶液中，封闭2小时，得MB/NWE电极。因探针1一端连有巯基，金硫键作用将探针1接在电极上。修饰完后使用巯基己醇封闭两小时，使P-MB链有序，用蒸馏水洗去未修饰的探针。探针1的一端连有亚甲基蓝，且探针1易于形成颈环结构，在0.01M的PBS溶液中扫SWV(方波伏安法)。
步骤2)中所述金纳米线电极的制备方法为：
将直径25um的2cm金微米线装入长度8cm、内径0.64mm、外径1mm毛细管中央，在P-2000 激光拉制仪下加热并水平拉断，在真空状态下，加热温度400-460℃，加热四个循环，每个循环加热15-25s，冷却35-45s，使得毛细管与金属丝熔融包裹严实；然后将加热温度设置为 400-460℃，拉力130-150N，速率45-55m/s,在该条件下拉断，之后使用钨丝连通导电，经过磨擦金面露出，即为金纳米盘电极，用氢氟酸刻蚀金纳米盘电极，获得金纳米线电极。
步骤3)具体为：
将MB/NWE电极置于含2uM探针2P-Fc的0.01M PBS溶液中，恒温37℃下杂交8-12小时，探针2与探针1通过碱基对的互补配对，使探针1的颈环结构解开形成较稳定的双链结构阻碍亚甲基蓝的电子传递，得到Fc/MB/NWE电极，即为双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器。
所述探针2P-Fc序列：5’-CGC CAA TAT TTA CGT GCT GCT A-C6-Fc-3’；
还包括步骤4)：将该生物传感器与miRNA-16杂交，验证该传感器对目标RNA的特异性灵敏响应。
步骤4)具体为：将购来的miRNA-16目标物，加入无菌水配成2uM的miRNA-16溶液，37℃下将Fc/MB/NWE电极与200uL 2uM的miRNA-16溶液杂交8-12小时，以验证所构建生物传感器对RNA-16的灵敏响应。杂交后的电极在含有5mM MgCl2和140mM NaCl的0.01M PBS 缓冲溶液中浸泡处理，然后再检测，由于高离子强度下，Mg离子有利于核糖核苷酸的互补配对(杂交和解链)。
所述miRNA-16目标物序列：5’-UAG CAG CAC GUA AAU AUU GGC G-3’；
进一步的，步骤4)中所述PBS缓冲溶液pH范围在6-8，优选为7.5。
本发明提供的一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器，采用上述方法制备得到。
本发明提供的一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器检测miRNA-16的应用，具体检测方法为：
将制备的双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器与不同浓度的miRNA-16杂交，杂交后的电极在含有5mM MgCl2和140mM NaCl的0.01M PBS中处理后，检测SWV响应，构建杂交前后MB和Fc峰电流变化值之和与miRNA-16的浓度的对数的线性关系，实现对miRNA-16的检测。
进一步的，miRNA-16的浓度分别为100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM。
所述得到的线性关系为：(ΔIMB+ΔIFc)(pA)＝296.38+21.059lgCmiRNA(M)(R2＝0.9916)。
与现有技术相比，本发明为了放大电化学响应，使用“ΔIMB+ΔIFc”作为响应信号来定量测定miRNA浓度。与现有技术相比，本发明提供的电化学传感器的灵敏度高，选择性高，检测限低，不需要复杂的操作步骤和样品预处理，操作简单，且可以很快的得到结果；仪器小、轻便、廉价，花费小；电极尺寸小，传质速率快，检测更灵敏。
附图说明
图1为本发明检测原理图；
图2为金纳米盘电极和刻蚀后的金纳米线电极在5mM二茂铁乙腈溶液中的CV，扫速为 50mV/s；
图3为金纳米线电极在5mM二茂铁乙腈溶液中的循环伏安曲线(A线)与COMSOL模拟数据(B线)的对比图，电极半径15nm，长40nm，扫速为50mV/s；
图4A为MB/NWE电极在0.01M PBS溶液中的方波伏安响应；
图4B为Fc/MB/NWE电极在0.01M PBS溶液中的方波伏安响应；
图4C为与目标miRNA杂交后的Fc/MB/NWE电极在0.01M PBS溶液中的方波伏安响应；
图5为不同pH所对应的峰电流；
图6A为不同浓度的miRNA-16处理Fc/MB/NWE电极后的SWV响应；a-h目标物浓度为0、 100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM；
图6B为MB和Fc峰值电流与miRNA浓度的对数的线性拟合曲线；miRNA浓度从100fM到 100nM；
图7为MB和Fc峰电流变化值之和与miRNA浓度的对数的线性关系，miRNA浓度从100fM 到100nM；
图8为对不同碱基序列的RNA的特异性响应。由上至下分别为空白，完全错配RNA，多碱基错配RNA，单碱基错配RNA，miRNA-16；不同序列的RNA浓度均为2uM；单碱基错配RNA序列：5’-UAG CAG CAC GCA AAU AUU GGC G-3’；多碱基错配RNA序列：5’-UUG UAG UAC ACAAAA AUA GUG G-3’；完全错配RNA序列：5’-AGU UCA GGU CUU GGC GAA CAU C-3’；
图9为与目标杂交前和被目标杂交解链后组装探针二的RNA生物传感器的电化学响应；
图10为Fc/MB/NWE电极在连续七天测量的SWV响应。
具体实施方式
实施例1
一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)取4mg DTT用100uL 0.1M，pH8.5的tris-HCl缓冲溶液充分溶解，制成DTT缓冲溶液；将1OD探针1P-MB溶液与DTT缓冲溶液混合均匀后，室温静置3h；然后加入200uL质量浓度6％的乙酸溶液和50uL 3M的乙酸钠溶液，在加入100％乙醇1.6mL，混匀，6000r/min 离心，除去上清液，35℃恒温环境下通风一夜，干燥，即得处理后的探针1；
2)将步骤1)处理后的探针1用0.01M的pH7.4的PBS溶解，稀释到5uM,将以激光拉制法制备的直径60nm的金纳米线电极浸入其中，恒温37℃孵育12h后，然后室温下将处理后的电极浸入100uL浓度10uM的巯基己醇溶液中，封闭2小时，得MB/NWE电极，因探针1一端连有巯基，金硫键作用将探针一接在电极上。修饰完后使用巯基己醇封闭两小时，使P-MB 链有序，用蒸馏水洗去未修饰的探针。探针1的一端连有亚甲基蓝，且探针一易于形成颈环结构，在0.01M的PBS溶液中扫SWV。具体条件为：在配有三电极系统的CHI660D电化学工作站上进行,纳米电极作为工作电极，铂(Pt)丝作为辅助(对)电极，银/氯化银(Ag/AgCl) 电极作为参比电极。其电位设置为0.5V至-0.05V，频率25Hz，振幅0.025mV，结果如图4A，在-0.28V附近有较强的亚甲基蓝信号，表明带亚甲基蓝的DNA单链成功接在电极上，此为 MB/NWE电极。
3)再将MB/NWE电极浸入含2uM探针2P-Fc的0.01M PBS溶液，恒温37℃下杂交12小时，探针2与探针1通过碱基对的互补配对，得Fc/MB/NWE电极；探针2与探针1通过碱基对的互补配对，使探针1的颈环结构解开形成较稳定的双链结构阻碍亚甲基蓝的电子传递。如图4B在PBS中的SWV在0.18V处附近出现较强的Fc峰，且-0.28V处MB的峰信号减小，说明Fc/MB/NWE电极制备成功，即为双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器。
4)将该生物传感器与1uM miRNA-16杂交，杂交后的电极在含有5mM MgCl2和140mMNaCl 的0.01M PBS缓冲溶液中浸泡处理，以方波伏安法进行检测。其SWV如图4C，-0.28V处峰信号增强,0.18V处信号减小。说明制备的的双标记信号放大RNA传感器对目标物具有灵敏响应。
步骤2)中所述金纳米线电极的制备方法为：
将直径25um的2cm金微米线装入长度约8cm、内径0.64mm、外径1m的毛细管中央，在P-2000激光拉制仪下加热并水平拉断。在真空状态下，加热温度400-460℃，加热四个循环，每个循环加热15-25s，冷却35-45s，使得毛细管与金属丝熔融包裹严实。然后将加热温度设置为400-460℃，拉力130-150N，速率45-55m/s,在该条件下拉断。拉断之后仪器会显示拉制时间，一般在3-4s为正常。将这两段具有超细尖端的毛细管在显微镜下观察；可看到直径小于100纳米的金丝被包裹在尖锐的尖端中，之后使用钨丝连通导电。经过磨擦金面露出，即为金纳米盘电极，用氢氟酸刻蚀金纳米盘电极，获得金纳米线电极。使用刻蚀的方法制备了尺寸不同的金纳米线电极。金纳米线的长度可由如下公式来进行计算：
iqss是极限电流，n是每摩尔分子转移电子数目，F是法拉第常数，D是扩散系数，Cb是溶液的浓度，r0是电极半径，A为金纳米线电极的表面积。
图2是半径约15nm的纳米盘电和经1：4(V/V)的氢氟酸中刻蚀后的电极的二茂铁表征图。刻蚀前是半径约15nm的金纳米盘电极，在5mM二茂铁(乙腈)中的循环伏安曲线呈现很好的 S型。在氢氟酸溶液中刻蚀10s，将外层玻璃刻蚀掉，得到了图2中刻蚀后的曲线。与盘电极比较，刻蚀后的电极其稳态伏安电流明显增大。通过comsol模拟软件可以得出刻蚀后的纳米线(红色)长约40nm。图3是该金纳米线电极的实验数据(A线)与模拟数据(B线)的对比图。模拟数据是在半径15nm、长40nm的纳米线，在扫速50mV/s、溶液为5mM二茂铁的条件下，得到的稳态伏安响应。可以看出，实验与模拟的结果是完全吻合的，说明使用的模拟软件是正确的、合理的，是能够与实验数据拟合的。模拟数据的循环伏安曲线没有充电电流，在电位反扫时能够与氧化过程完全重合，呈现完美的“S”型。而实验结果的充电电流也很小，说明制备的纳米线电极很成功。
上述制备的MB/NWE电极、Fc/MB/NEW电极和制得的双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器与目标miRNA-16杂交后在0.01M PBS溶液中的方波伏安响应。结果如图4A、图4B和图4C。
溶液是pH值对实验的结果有显著影响，主要是影响生物传感器中RNA的活性和指示小分子MB和Fc的活性。改变步骤4)中所用PBS检测液的pH值，观察方波伏安响应的峰强度变化。溶液pH范围在6～8之间变化，分别作SWV。由于-0.28V处的峰变化很小，故以0.18V处的峰值电流为对象，从图3可以看出，当pH为7.5时，还原峰最大，因此pH7.5时为最优条件，如图5。
本发明检测原理如图1所示，在没有目标物存在时，金纳米电极的表面发生有两个氧化还原反应发生，但双链结构阻碍了亚甲基蓝分子的电子传递，二茂铁分子更容易传递电子，就出现了图中b曲线。当目标物与其中一条链结合时，将该链从电极上解离下来，带亚甲基蓝分子的RNA链恢复单链结构,在Mg离子的存在下，形成颈环结构，MB的电化学信号增强，如图a曲线。实验使用的是方波伏安法(SWV),电位区间为0.5V至-0.5V，目标RNA的检测是通过分析亚甲基蓝还原峰电流的增大值和二茂铁还原峰电流的减小值之和。
生物传感器选择性的研究：
为了验证上述制备的传感器对miRNA-16具有特异性响应，选择了四种不同碱基序列的 RNA，浓度均为2uM，杂交时间12h。如图8，分别为空白，完全不互补的RNA，多碱基错配的 RNA，单碱基错配的RNA和完全互补的miRNA-16。可以看出在没有RNA存在的空白中，亚甲基蓝峰较小，二茂铁峰较大；与完全不互补的RNA杂交后，在PBS中的SWV与空白相比几乎没有变化；与多碱基错配的RNA配对后，其电化学信号变化值约为目标物的10％；而单碱基错配的RNA其电化学信号的变化约为30％。这个结果显示本发明制备的传感器的选择性优越。
生物传感器再生性的研究：
传感器的可再生性是评价传感器性能的重要指标，决定着传感器可否重复利用。已知 Fc/MB/NWE电极与目标杂交可使探针二与探针一解链。如图9所示，A是与目标杂交之前的 Fc/MB/NWE电极，其双链结构影响亚甲基蓝分子的电子传递，形成A的曲线。在于目标杂交后，双链被解开，将于目标杂交后的电极，浸入2uM的探针二溶液中孵育12小时，得到了B 的曲线。在解链重组前后，电极的重现性很好。说明本发明制备的电极是可再生的、可重复利用的。
生物传感器稳定性的研究：
图10是本发明制备的RNA生物传感器在连续七天内在pH7.5的0.01M PBS溶液中的电化学响应，实验检测后将传感器置于冰箱中冷藏。可以看出亚甲基蓝和二茂铁的信号大小有轻微的有降低。这种情况出现的原因可能是RNA和标记小分子的活性在低温下随时间增加而有所降低。七天后的信号仍保留了原值的93.3％，表明本发明制备的传感器稳定性良好。
实施例2
一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器检测miRNA-16的应用，具体为：
将实施例1制备的Fc/MB/NEW电极放入配制好的200uL不同浓度的目标miRNA-16的溶液中。为了使目标miRNA能够更好的杂交，选择的条件为37℃恒温下杂交12h。杂交后的电极在含有5mM MgCl2和140mM NaCl的0.01M PBS缓冲溶液中浸泡处理，其SWV如图6A所示，a曲线是目标物浓度为0的空白对照，当目标miRNA浓度从100fM变化100nM时，可观察到MB 的峰电流渐渐增强，Fc的峰随之减小。如图6B显示的是亚甲基蓝与二茂铁的电流信号(扣除空白后)与目标物miRNA-16浓度的关系，发现两个峰信号的大小均和目标物浓度的对数成线性。因此将亚甲基蓝的增大值和二茂铁的减小值之和作为我们最终信号的变化值，即：
ΔI＝ΔIMB+|ΔIFc|
这种方式可使制备的传感器对特定RNA的电化学响应实现信号放大。
使用“ΔIMB+ΔIFc”作为响应信号来定量测定miRNA浓度，结果如图7所示，可以观察到，“ΔIMB+ΔIFc”值也随着miRNA浓度的增加而线性增加。在RNA浓度从100fM到100nM，相应的线性关系是(ΔIMB+ΔIFc)(pA)＝296.38+21.059lgCmiRNA(M)(R2＝0.9916)，可以看出该传感器的线性响应范围相对较宽。
实施例3
将制备的传感器用于人的血液样品环境下RNA的微量检测。将50uL的血清加入到10mL0.01M的PBS缓冲溶液中作环境溶液。取该环境溶液5mL加入5uL 5uM/L的miRNA-16标准液，将实施例1制备的Fc/MB/NEW电极与该样品孵育12小时，在含有5mM MgCl2和140mM NaCl的0.01M PBS缓冲溶液中浸泡处理，以方波伏安测定。后依次在该溶液中加入5uL 5uM/L的miRNA-16标准溶液,记录电化学信号变化。通过标准加入法在人体血清环境下检测回收率，如表1所示。
表1
从表1可以得到，回收率保持在96.0％～104.6％左右，说明本发明制备的传感器能够成功的在复杂样品环境中实现对miRNA-16的灵敏响应，具备实际样品检测的能力。
Claims (8)
1.一种双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将探针1P-MB与DTT缓冲溶液混合均匀后，静置；然后加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，再加入乙醇，混合，离心，除去上清液，干燥，即得处理后的探针1；
2)将步骤1)处理后的探针1用缓冲溶液溶解后，将金纳米线电极浸入探针1缓冲溶液中，孵育后，用巯基己醇封闭，得MB/NWE电极；
3)再将MB/NWE电极置于探针2P-Fc缓冲溶液中，杂交，探针2与探针1通过碱基对的互补配对，得Fc/MB/NWE电极，即为双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器；
步骤1)所述探针1P-MB序列：5’-HS-SH-C6-TGG CAG CAC ATT GCC G-C6-MB-3’；
所述探针2P-Fc序列：5’-CGC CAA TAT TTA CGT GCT GCT A-C6-Fc-3’；
所述双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器检测miRNA-16。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：
将步骤1)处理后的探针1用0.01M的pH7.4的PBS缓冲溶液溶解，稀释到5uM；将金纳米线电极浸入探针1缓冲溶液中，恒温37℃下孵育8-12小时；然后室温下将电极浸入100uL浓度10uM的巯基己醇溶液中，封闭2小时，得MB/NWE电极。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述金纳米线电极的制备方法为：
将直径25um的2cm金微米线装入长度8cm、内径0.64mm、外径1mm毛细管中央，在P-2000激光拉制仪下加热并水平拉断，在真空状态下，加热温度400-460℃，加热四个循环，每个循环加热15-25s，冷却35-45s，使得毛细管与金属丝熔融包裹严实；然后将加热温度设置为400-460℃，拉力130-150N，速率45-55m/s,在该条件下拉断，之后使用钨丝连通导电，经过磨擦金面露出，即为金纳米盘电极，用氢氟酸刻蚀金纳米盘电极，获得金纳米线电极。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：
将MB/NWE电极置于含2uM探针2P-Fc的0.01M PBS溶液中，恒温37℃下杂交8-12小时，探针2与探针1通过碱基对的互补配对，使探针1的颈环结构解开形成较稳定的双链结构阻碍亚甲基蓝的电子传递，得到Fc/MB/NWE电极。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤4)：将该生物传感器与miRNA-16杂交，验证该传感器对目标RNA的特异性灵敏响应。
6.一种权利要求1-5任一项所述制备方法制备得到的双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器。
7.一种权利要求1-5任一项所述制备方法制备得到的双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器检测miRNA-16的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测方法为：
将制备的双信号无酶的信号放大RNA纳米生物传感器与不同浓度的miRNA-16杂交，杂交后的电极在含有5mM MgCl2和140mM NaCl的0.01M PBS中处理后，检测SWV响应，构建杂交前后MB和Fc峰电流变化值之和与miRNA-16的浓度的对数的线性关系，实现对miRNA-16的检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810418796.0A CN108445067B (zh) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810418796.0A CN108445067B (zh) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108445067A CN108445067A (zh) | 2018-08-24 |
| CN108445067B true CN108445067B (zh) | 2020-07-03 |
Family
ID=63202903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810418796.0A Active CN108445067B (zh) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108445067B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109856216B (zh) * | 2019-03-07 | 2021-04-27 | 南宁师范大学 | 差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法 |
| CN111187806B (zh) * | 2020-01-09 | 2021-01-08 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法 |
| CN113219031A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-08-06 | 皖南医学院 | Dna双足步行者信号放大器、基于纳米电极的生物传感器及其使用方法和它们的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105973963A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-09-28 | 中南大学 | 发夹dna支撑双信号分子传感界面的构建方法及应用 |
| CN106434903A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-22 | 青岛大学 | 检测基因p53的比率电化学dna传感器修饰电极及其制备方法 |
| CN107290406A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-10-24 | 中南大学 | 用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法 |
| CN107287596A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-10-24 | 安徽师范大学 | 一种Au@Pt核壳结构纳米电极、制备方法及其应用 |
-
2018
- 2018-05-04 CN CN201810418796.0A patent/CN108445067B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105973963A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-09-28 | 中南大学 | 发夹dna支撑双信号分子传感界面的构建方法及应用 |
| CN106434903A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-22 | 青岛大学 | 检测基因p53的比率电化学dna传感器修饰电极及其制备方法 |
| CN107287596A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-10-24 | 安徽师范大学 | 一种Au@Pt核壳结构纳米电极、制备方法及其应用 |
| CN107290406A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-10-24 | 中南大学 | 用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| An exonuclease-assisted amplification electrochemical aptasensor of thrombin coupling "signal on/off" strategy;Ting Bao 等;《Analytica Chimica Acta》;20141217;第70-76页 * |
| Liang Wu等.Sensitive Electrochemical Aptasensor by Coupling "Signal-on" and"Signal-off" Strategies.《Analytical Chemistry》.2013, * |
| Ratiometric electrochemical proximity assay for sensitive one-step protein detection;Kewei Ren等;《Scientific Reports》;20140312;第1-6页 * |
| Sensitive Electrochemical Aptasensor by Coupling "Signal-on" and"Signal-off" Strategies;Liang Wu等;《Analytical Chemistry》;20130806;第8397-8402页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108445067A (zh) | 2018-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuan et al. | Simultaneously electrochemical detection of microRNAs based on multifunctional magnetic nanoparticles probe coupling with hybridization chain reaction | |
| Mandli et al. | Electrochemical DNA sandwich biosensor based on enzyme amplified microRNA-21 detection and gold nanoparticles | |
| EP3279651B1 (en) | Methods using microelectrodes and biosensing devices incorporating the same | |
| Xiao et al. | Ultrasensitive electrochemical microRNA-21 biosensor coupling with carboxylate-reduced graphene oxide-based signal-enhancing and duplex-specific nuclease-assisted target recycling | |
| Zhang et al. | Sensitive electrochemical biosensor for MicroRNAs based on duplex-specific nuclease-assisted target recycling followed with gold nanoparticles and enzymatic signal amplification | |
| Liu et al. | Simple, sensitive and label–free electrochemical detection of microRNAs based on the in situ formation of silver nanoparticles aggregates for signal amplification | |
| Keshavarz et al. | Recent trends in electrochemical microRNA biosensors for early detection of cancer | |
| Ebrahimi et al. | Design, development and evaluation of microRNA-199a-5p detecting electrochemical nanobiosensor with diagnostic application in Triple Negative Breast Cancer | |
| Liu et al. | An ultrasensitive electrochemical miRNAs sensor based on miRNAs-initiated cleavage of DNA by duplex-specific nuclease and signal amplification of enzyme plus redox cycling reaction | |
| Zhou et al. | A simple label-free electrochemical aptasensor for dopamine detection | |
| CN108445067B (zh) | 一种双信号无酶的信号放大rna纳米生物传感器、制备方法及其应用 | |
| Jiao et al. | Electrochemical detection of circRNAs based on the combination of back-splice junction and duplex-specific nuclease | |
| Hu et al. | An electrochemical biosensor for sensitive detection of microRNAs based on target-recycled non-enzymatic amplification | |
| Yaman et al. | One-pot synthesized gold nanoparticle-peptide nanotube modified disposable sensor for impedimetric recognition of miRNA 410 | |
| Tang et al. | Dual-signal amplification strategy for miRNA sensing with high sensitivity and selectivity by use of single Au nanowire electrodes | |
| Bharti et al. | Electrochemical biosensor for miRNA-21 based on gold-platinum bimetallic nanoparticles coated 3-aminopropyltriethoxy silane | |
| Fredj et al. | Neutravidin biosensor for direct capture of dual-functional biotin-molecular beacon-AuNP probe for sensitive voltammetric detection of microRNA | |
| Xiang et al. | Sensitive detection of microRNAs using hemin/G-quadruplex concatamers as trace labels and RNA endonuclease-aided target recycling for amplification | |
| Wu et al. | Dual cycle amplification and dual signal enhancement assisted sensitive SERS assay of MicroRNA | |
| Bahri et al. | Laser-Induced graphene electrodes for highly sensitive detection of DNA hybridization via consecutive cytosines (polyC)-DNA-based electrochemical biosensors | |
| Ensafi et al. | A novel diagnostic biosensor for distinguishing immunoglobulin mutated and unmutated types of chronic lymphocytic leukemia | |
| Xu et al. | A facile approach for fabrication of three-dimensional platinum-nanoporous gold film and its application for sensitive detection of microRNA-126 combining with catalytic hairpin assembly reaction | |
| Zhou et al. | Construction of a sensitive ratiometric electrochemical sensing platform for DNA methylation detection based on the design of multistep DNA amplification circuits | |
| Hu et al. | An electrochemical biosensor for highly sensitive detection of microRNA-377 based on strand displacement amplification coupled with three-way junction | |
| Xiong et al. | One-step triggered branched DNA nanostrucuture for ultra-sensitive electrochemical detection of microRNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |