CN111440851A - 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域,特别涉及miRNA特异识别的S及其构象改变和滚环等温循环放大检测miRNA的生物传感器,为了解决以上现有技术中检测miRNA的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种检测miRNA的生物传感器,在电极上依次修饰有S1层、RCA产物层。制备方法:对电极进行预处理;将S1层修饰到电极表面;将RCA产物层修饰到电极表面。利用了miRNA的特异性识别实现了对目标物的高特异性检测;利用DNAzyme和滚环等温放大技术,实现了目标物信号的三步放大。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域,特别涉及基于DNAzyme检测miRNA的生物传感器,还涉及其制备方法与应用。
背景技术
MicroRNAs (miRNAs)是一类小型内源性非编码RNAs(17-22个核苷酸),在基因表达、细胞周期和生物学发展等多种生物学过程中起关键作用。在过去的20年里,miRNAs在生物学领域得到了广泛的扩展,相关的基础研究表明,miRNAs作为肿瘤抑制因子或致癌基因,miRNAs的改变可以导致许多疾病特别是人类癌症的发展和进展。这些miRNAs可能成为肿瘤早期诊断和临床管理中潜在的生物标志物的一个新的分支。因此,准确的miRNA分析对于进一步了解miRNA的功能,降低肿瘤的发病率和死亡率具有重要的应用前景。
定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)、northern blotting和microarray等传统方法已被成功开发用于检测miRNA,并取得了相当大的进展。然而,这些突出的策略在miRNA检测中仍存在令人遗憾的缺陷。qRT-PCR技术通常耗时较长,且依赖于热稳定酶。Northern印迹技术有交叉污染和操作复杂性的高风险。灵敏度低、特异性差也是基于微阵列方法尚待解决的问题。此外,miRNAs的固有特征,包括其体积小、在总RNA样品中的表达水平极低、家族成员间的高序列同源性以及易降解等,都严重限制了直接miRNAs分析。因此,微量microRNA的定量和定性检测对于解读microRNA在临床诊断中的作用至关重要,但仍是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂、设备昂贵且需专业人员操作的缺点,提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低的检测miRNA的电化学生物传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的:
一种检测miRNA的电化学生物传感器,在电极上依次修饰S1、RCA产物层;所述的RCA产物层中包括S、环形模板、AgMBs、miRNA-21;所述的环形模板为:5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA与连接探针Ligation probe通过分子内连接反应得到;
所用碱基序列如下:
miRNA-21碱基序列如SEQ No.1所示;具体为:5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’;
S碱基序列如SEQ No.2所示;具体为:5’-AACATCAGGCCG rA AGGCCTGTCC TCGTCCGGCTCGT TGATAAGCTA-inverted dT-3’;
Padlock DNA碱基序列如SEQ No.3所示;具体为:5’-P-AACAATTTGAACTTGTTAAACGCTTCGTCCGGCTCGGA CTATTTGAATT CGGCCTGTT-3’;
Ligation probe 碱基序列如SEQ No.4所示;具体为:5’-TCAAATTGTT AACAGGCCGA-3’;
AgMBs碱基序列如SEQ No.5所示;具体为:5’-GTTCAAATTGTTAAAC rACTA ATTGAATTTGGCCCTAACTCCCC-inverted dT-3’;
S1碱基序列如SEQ No.6所示;具体为:5’-AAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAACC AAATTCAAAAAAA-SH(CH3)6-3’;
所述的S链5’第12个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的AgMBs链5’第16个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的S链、AgMBs链的3’端连有inverteddT;所述的S1链的3’端连有SH(CH3)6。
上述的生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)环形模板构建及银纳米簇的制备;
(2)对电极进行抛光预处理;
(3)将S1层修饰到电极表面;
(4)将RCA产物层修饰到电极表面。
所述的步骤(1)环形模板的构建方法如下:将灭菌水,5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA,连接探针和T4 DNA连接酶缓冲液混匀,95 ℃变性,然后慢慢冷却至室温完成杂交,然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶,反应;之后灭活体系中的T4 DNA连接酶。
所述的步骤(1)银纳米簇的制备方法为:AgMBs核酸序列与pH=7.0磷酸缓冲溶液混合,然后加入AgNO3溶液,Ag+ : DNA=6 : 1,冷却,加入NaBH4还原,剧烈摇晃, 4 ℃黑暗中反应6 h。
所述的步骤(3)将S1层修饰到电极表面,包括以下步骤:将灭菌水,5×PBS缓冲液,TCEP,S1链到步骤(2)的电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
所述的步骤(3)将RCA产物层修饰到电极表面的操作步骤如下:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,10×RCA buffer,环状模板和AgMBs,S,phi29DNA聚合酶,dNTP,然后加入miRNA,最后加入超纯水混合,在37 ℃孵育4 h;
b.取a溶液滴加到预先修饰好的电极上,然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h,清洗。
所述电极为金电极。
上述制备方法制备得到的化学生物传感器,其特征在于,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化,检测待测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法:
a. 5×PBS缓冲液是由以下方法配制:Na2HPO4(10 mM),NaH2PO4(10 mM),NaCl(140mM),KCl(1 mM),MgCl2(1 mM),最终溶液的pH值为7.4。保存于-20℃冰箱,备用。
b. 10×RCA缓冲液是由以下方法配制:Tris(500 mM)、DTT(10 mM)、MgCl2(200mM),最终溶液的pH值为7.5。保存于-20℃冰箱,备用。
c.配置的PBS缓冲液、RCA缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是,将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中,然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。保存于-20℃冰箱,备用。
d.电解液的配置:取4 mL 5×PBS于16 mL灭菌水中,并加入200 µL,100 mM的H2O2溶液,充分混匀待用。电解液需现用现配。
本发明一共用到了8条DNA链,其序列(5’-3’)分别是:
miRNA-21:TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
S:AACATCAGGCCG rA AGGCCTGTCC TCGTCCGGCTC GT TGATAAGCTA-inverted dT
Padlock DNA (P-DNA):P-
AACAATTTGAACTTGTTAAAC GCTTCGTCCGGCTCGGA CTATTTGAATT CGGCCTGTT
Ligation probe (L-DNA):TCAAATTGTT AACAGGCCGA
AgMBs:GTTCAAATTGTTAAAC rACTAA TTGAATTTGG CCCTAACTCCCC-inverted dT
S1:AAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAA-SH(CH3)6
S的下划线部分通过与目标物miRNA特异性结合改变其构象,使得DNAzyme启动切割活性,掉落的核酸链(加粗部分)是引发滚环放大反应的引物。AgMBs中斜体部分可与RCA产物特异性结合,经RCA产物中DNAzyme的切割作用,掉落的核酸链(下曲划线部分)可与S1的曲下划线部分特异性结合,并通过S1与电极之间的Au-S键间接地修饰在电极表面。
本发明中用到了四种酶:T4 DNA连接酶,phi29,ExoI,Exo Ⅲ。
T4 DNA连接酶的作用是,在链接探针的作用下使挂锁探针(P-DNA)连接成环,成环后由ExoI和Exo Ⅲ将环之外的其他序列都降解掉。Phi29的作用是与dNTP作用下,滚环放大。
本发明中需要合成银纳米簇,用于荧光信号检测。
本发明中miRNA的检测是在电极上实现的,通过RCA偶联DNAzyme的方式来实现信号的增大,从而实现miRNA的高灵敏检测,并获得较低的检测下限。
该发明的检测方式是电化学检测,利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极,铂丝为对电极,修饰的金电极为工作电极。在检测之前,先通过Au-S键将S1固定到电极表面。然后将目标物加入到S、环状模板、phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTP的均相溶液,在37 ℃孵育4 h,目标物与适配体序列绑定。在phi29 DNA 聚合酶和DNAzyme作用下完成多倍数反馈放大过程,从而实现信号的放大。将RCA反应后的产物修饰到电极表面,继续孵育2 h。然后用三电极工作体系检测信号峰。电位设置0到-1V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安法读取电信号,检测待测目标物。
本发明基于miRNA与拱形探针的特异性识别,RCA反应,DNAzyme的切割活性构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快,检测限低,特异性高等优点,可以弥补miRNA现有检测方法的缺陷与不足,实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
图1为该发明原理示意图;
图2为实施例2 S浓度优化检测结果图;
图3为实施例3 CT浓度优化检测结果图;
图4为实施例4 AgMBs浓度优化检测结果图;
图5为实施例5 S1浓度优化检测结果图;
图6为实施例6传感器检测miRNA的工作曲线。
本发明的有益效果:
1、高特异性检测
利用miRNA的特异性识别实现了对目标物的高特异性检测。
2、灵敏性高
利用S的构象改变反应,产生引物链并实现了目标物的循环利用,起到了第一步信号增大的作用;利用RCA等温放大技术,实现了信号的第二次循环放大;RCA产物含有DNAzyme,可以重复切割AgMBs,实现了信号的第三次放大,实现了对目标物的高灵敏检测,提高了检测的灵敏度;
3、性能稳定,可工业化生产
该传感器的反应条件温和,反应速度快;由于使用金电极,其电极简便、小型化、易携带、可多次使用;检测原理的主要过程均是在电极上实现的,提高了反应速度,降低了操作的复杂程度,实现了目标物的快速,简单,灵敏的检测;制备方法简单,性能稳定,电极的重复性好,适用于miRNA检测和生物传感器产业化的实际应用;制作电极的工艺成本低,适用于产业化中价廉的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1 环形模板及银纳米簇的制备
(1)将42 μL灭菌水,6 μL线性模板(100 μM),6 μL连接探针(100 μM)和6 μL 10×的T4DNA连接酶缓冲液混匀,95 ℃变性5 min,然后慢慢冷却至室温完成杂交,然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶(60 U/μL),将其在16℃下反应20小时;之后,反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟,灭活体系中的T4 DNA连接酶。
(2)向上述反应体系中加入1 μL核酸外切酶Ⅰ(20 U/μL)和2 μL的核酸外切酶Ⅲ(100 U/μL)37℃下反应2 h;再将反应体系85℃水浴加热10 min,得环形模板,4℃条件下保藏备用。
(3)将15 μL,100 μM AgMBs核酸序列与73 μL的20 mM磷酸缓冲溶液(pH=7.0)混合,然后将6 μL,1.5 mM AgNO3溶液加入体系中,Ag+ : DNA=6:1,在4 ℃下冷却15 min 后,加入6 μL,1.5 mM NaBH4还原,剧烈摇晃1 min,反应在4 ℃黑暗中进行6 h,得到银纳米簇。
如图1所示,目标物miRNA与S链特异性结合改变了S链的结构,激活S链中DNAzyme的活性,在Mg2+的作用下进行切割,释放出trigger链。P-DNA与L-DNA部分序列可以特异性结合,在连接酶和外切酶的帮助下形成环状模板CT,CT与trigger链在dNTPs和phi29聚合酶的作用下进行滚环扩增,扩增产物可以打开银簇发夹AgMBs,在Mg2+的作用下DNAzyme切割AgMBs的rA位点,产生两条短核酸链Sa和Sb:Sa与通过金硫键修饰在电极上的S1部分序列特异性结合,进而固定在电极表面,银纳米簇可以催化过氧化氢从而产生电化学信号;Sb的部分序列可以与CT特异性结合,启动二次滚环扩增,极大增强了信号扩增效率。
实施例2 电化学信号随S浓度的变化
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
a.金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
b.取121 µL灭菌水,44 µL 5×PBS缓冲液,44 µL TCEP(10 µM),11 µL S1链(2 µM),于灭菌离心管中;
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面,在37 ℃下孵育2 h,清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落,下面介绍一下均相溶液中发生的反应,均相反应中的主要步骤:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL,10×RCA buffer 10 μL,5 μL环状模板(100 nM)和2 μL AgMBs(500 nM),5 μL的S(浓度分别为0 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40nM、50 nM),1.25 μL的phi29 DNA聚合酶(1 U/μL),2 μL的dNTP(1 mM),最后加入miRNA(500nM),最后加入59.75 μL超纯水混合,在37 ℃孵育4 h。
b.将10 µL c步反应的溶液滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h;
c.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍,在氮气流下干燥;
d.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1 V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安技术读取AgMBs电信号的变化,检测待测目标物。
结果见图2,从图中可以看出,检测到的电流信号随着S的浓度在0-20 nM区间内增大而增大,当浓度超过20 nM后,电流趋于稳定,所以S的最佳浓度为20 nM。
实施例3 电化学信号随环状模板浓度的变化
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
a.金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
b.取121 µL灭菌水,44 µL 5×PBS缓冲液,44 µL TCEP(10 µM),11 µL S1链(50 nM),于灭菌离心管中;
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落,下面介绍一下均相溶液中发生的反应,均相反应中的主要步骤:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL,10×RCA buffer 10 μL,5 μL环状模板(浓度分别为0 nM、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM)和2 μL AgMBs(500 nM),5 μL的S(20 nM),1.25 μL的phi29 DNA聚合酶(1 U/μL),2 μL的dNTP(1 mM),最后加入miRNA(500 nM),最后加入59.75 μL超纯水混合,在37 ℃孵育4 h。
b.将10 µL c步反应的溶液滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h;
c.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍,在氮气流下干燥;
d.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1 V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安技术读取AgMBs电信号的变化,检测待测目标物。
结果见图3,从图中可以看出,检测到的电流信号随着环状模板的浓度在0-100 nM区间内增大而增大,当浓度超过100 nM后,电流趋于稳定,所以环状模板的最佳浓度为100nM。
实施例4 电化学信号随AgMBs浓度的变化
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
a.金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
b.取121 µL灭菌水,44 µL 5×PBS缓冲液,44 µL TCEP(10 µM),11 µL S1链(50 nM),于灭菌离心管中;
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落,下面介绍一下均相溶液中发生的反应,均相反应中的主要步骤:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL,10×RCA buffer 10 μL,5 μL环状模板(100 nM)和2 μL AgMBs(浓度分别为0 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM),5 μL的S(20 nM),1.25 μL的phi29 DNA聚合酶(1 U/μL),2 μL的dNTP(1 mM),最后加入miRNA(500nM),最后加入59.75 μL超纯水混合,在37 ℃孵育4 h。
b.将10 µL c步反应的溶液滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h;
c.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍,在氮气流下干燥;
d.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1 V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安技术读取AgMBs电信号的变化,检测待测目标物。
结果见图4,从图中可以看出,检测到的电流信号随着银簇分子开关的浓度在0-0.5 μM区间内增大而增大,当浓度超过0.5 μM后,电流趋于稳定,所以银簇分子开关的最佳浓度为0.5 μM。
实施例5 电化学信号随S1浓度的变化
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
a.金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
b.取121 µL灭菌水,44 µL 5×PBS缓冲液,44 µL TCEP(10 µM),11 µL S1链(50 nM),于灭菌离心管中;
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面,在37 ℃下孵育2 h,清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落,下面介绍一下均相溶液中发生的反应,均相反应中的主要步骤:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL,10×RCA buffer 10 μL,5 μL环状模板(100 nM)和2 μL AgMBs(浓度分别为0 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM),5 μL的S(20 nM),1.25 μL的phi29 DNA聚合酶(1 U/μL),2 μL的dNTP(1 mM),最后加入miRNA(500nM),最后加入59.75 μL超纯水混合,在37 ℃孵育4 h。
b.将10 µL c步反应的溶液滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h;
c.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍,在氮气流下干燥;
d.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1 V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安技术读取AgMBs电信号的变化,检测待测目标物。
结果见图5,从图中可以看出,检测到的电流信号随着S1的浓度在0-0.1 μM区间内增大而增大,当浓度超过0.1 μM后,电流趋于稳定,所以S1的最佳浓度为0.1 μM。
实施例6 对miRNA的检测
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
a.金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
b.取121 µL灭菌水,44 µL 5×PBS缓冲液,44 µL TCEP(10 µM),11 µL S1链(浓度分别为0 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM、8 μM),于灭菌离心管中;
c.将10 μL b步溶液滴加到电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
至此电极的修饰过程先告一段落,下面介绍一下均相溶液中发生的反应,均相反应中的主要步骤:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL,10×RCA buffer 10 μL,5 μL环状模板(100 nM)和2 μL AgMBs(0.5 μM),5 μL的S(20 nM),1.25 μL的phi29 DNA聚合酶(1 U/μL),2 μL的dNTP(1 mM),最后加入miRNA(500 nM),最后加入59.75 μL超纯水混合,在37 ℃孵育4 h。
b.将10 µL c步反应的溶液滴加到预先修饰好的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h;
c.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍,在氮气流下干燥;
d.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1 V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安技术读取AgMBs电信号的变化,检测待测目标物。
结果见图6,从图中可以看出检测结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
aacatcaggc cgaggcctgt cctcgtccgg ctcgttgata agcta 45
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
aacaatttga acttgttaaa cgcttcgtcc ggctcggact atttgaattc ggcctgtt 58
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
tcaaattgtt aacaggccga 20
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
gttcaaattg ttaaacctaa ttgaatttgg ccctaactcc cc 42
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
aaaaaccaaa ttcaaaaaaa ccaaattcaa aaaaaccaaa ttcaaaaaaa 50
Claims (9)
1.一种检测miRNA的电化学生物传感器,其特征在于,在电极上依次修饰S1、RCA产物层;所述的RCA产物层中包括S、环形模板、AgMBs、miRNA-21;所述的环形模板为:5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA与连接探针Ligation probe通过分子内连接反应得到;
所用碱基序列如下:
miRNA-21碱基序列如SEQ No.1所示;具体为:5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’;
S碱基序列如SEQ No.2所示;具体为:5’-AACATCAGGCCG rA AGGCCTGTCC TCGTCCGGCTCGT TGATAAGCTA-inverted dT-3’;
Padlock DNA碱基序列如SEQ No.3所示;具体为:5’-P-AACAATTTGAACTTGTTAAACGCTTCGTCCGGCTCGGA CTATTTGAATT CGGCCTGTT-3’;
Ligation probe 碱基序列如SEQ No.4所示;具体为:5’-TCAAATTGTT AACAGGCCGA-3’;
AgMBs碱基序列如SEQ No.5所示;具体为:5’-GTTCAAATTGTTAAAC rACTA ATTGAATTTGGCCCTAACTCCCC-inverted dT-3’;
S1碱基序列如SEQ No.6所示;具体为:5’-AAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAACC AAATTCAAAAAAA-SH(CH3)6-3’;
所述的S链5’第12个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的AgMBs链5’第16个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的S链、AgMBs链的3’端连有inverteddT;所述的S1链的3’端连有SH(CH3)6。
2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)环形模板构建及银纳米簇的制备;
(2)对电极进行抛光预处理;
(3)将S1层修饰到电极表面;
(4)将RCA产物层修饰到电极表面。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)环形模板的构建方法如下:将灭菌水,5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA,连接探针和T4 DNA连接酶缓冲液混匀,95 ℃变性,然后慢慢冷却至室温完成杂交,然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶,反应;之后灭活体系中的T4 DNA连接酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)银纳米簇的制备方法为:AgMBs核酸序列与pH=7.0磷酸缓冲溶液混合,然后加入AgNO3溶液,Ag+ : DNA=6 : 1,冷却,加入NaBH4还原,剧烈摇晃, 4 ℃黑暗中反应6 h。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)将S1层修饰到电极表面,包括以下步骤:将灭菌水,5×PBS缓冲液,三(2-羧乙基)膦TCEP,S1链到步骤(2)的电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)将RCA产物层修饰到电极表面的操作步骤如下:
a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,10×RCA buffer,环状模板和AgMBs,S,phi29DNA聚合酶,dNTP,然后加入miRNA,最后加入超纯水混合,在37 ℃孵育4 h;
b.取a溶液滴加到预先修饰好的电极上,然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h,清洗。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述电极为金电极。
8.采用权利要求2所述的制备方法制备得到的电化学生物传感器,其特征在于,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为0.05 s,采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化,检测待测目标物。
9.采用权利要求2所述的制备方法制备的电化学生物传感器在非疾病诊断上检测miRNA的应用。
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