CN105158320A - 基于核酸适配体检测卡那霉素的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的生物传感器，本发明采用在电极上依次修饰有HAP2层，Helper层，均相反应混合液的方法制备而成。本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用卡那霉素的aptamer作为识别物质实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；利用核酸工具酶，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用，从而提高了检测灵敏度。

Description

基于核酸适配体检测卡那霉素的电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于目标诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的电化学生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

卡那霉素（Ka）是一种氨基糖苷类抗生素，是由链霉菌的发酵产生的，被广泛用于治疗误译诱导的感染和间接抑制蛋白质合成期间易位。和其他氨基糖甙类一致，Ka可以在动物体中累积并且转移到食物链中，这可能对人类健康引起潜在的危险，比如出现失去听力，肾脏毒性和药物过敏反应。欧盟组织已经确定了可食用组织和牛奶中Ka的最大残留量。目前报道的检测Ka的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光共振方法。这些方法有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测Ka是至关重要的。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测卡那霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的生物传感器。同时还涉及其制备方法。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2与Helper的混合液修饰到电极表面；

（3）将均相反应产物层修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选将HAP2与Helper的混合液修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μL的10μM的HAP2与Helper的混合液滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。

所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1,Primer，phi29DNA聚合酶，dNTPs，Nt.AlwI内切酶和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）将孵育好的混合混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

（3）将（2）中的混合溶液与ExoⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2与Helper的混合液固定在电极表面。然后将反应后的均相溶液与ExoⅢ一起修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h完成电极表面的循环放大过程。最后使电极上的HAP折叠成发夹构象，电活性物质（MB）靠近电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。

本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：

HAP1：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGACTCAGAGATCCATATGGAACCCCCA-3’(SEQ:ID:NO:1)；

Primer：5’-TGGGGGTT-3’(SEQ:ID:NO:2)；

HAP2：5’-MB-GCTTAGCCTCAACCCATTGTTCTAAGCTTTT-SH-3’(SEQ:ID:NO:3)；

Helper：5’-GGGTTGAGGCTAAGCCGACT-3’(SEQ:ID:NO:4)；

其中HAP1的下划线标注部分是目标物卡那霉素的aptamer，点下划线标注的是内切酶Nt.AlwI的识别序列。HAP2的3’端修饰-SH，通过Au-S共价键将HAP2固定在金电极表面，5’端修饰电活性物(MB)，可以在一定的电位下发生氧化还原反应。通过测量MB信号的变化来定量检测卡那霉素。

本发明中用到了三种酶：phi29DNA聚合酶，ExonucleaseⅢ和Nt.AlwI内切酶。phi29DNA聚合酶在引物与模板的作用下，沿着模板链从5’端向3’端生长，聚合出与模板链碱基完全互补的序列。ExonucleaseⅢ能够特异性的切割双链DNA的3’平末端或凹末端，而对3’的凸末端与DNA单链却不起作用。Nt.AlwI可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：GGATCNNNNN，切割位点是最后两个碱基之间。

本发明中卡那霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过三步循环的方式来实现信号的放大，从而实现卡那霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：HAP1由三部分组成：aptamer，内切酶Nt.AlwI的识别序列和引物（primer）的互补序列。当有卡那霉素存在时，由于aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，可以将HAP1打开，使HAP1上内切酶Nt.AlwI的识别序列和引物（primer）的互补序列以单链的形式暴露在外面。随后均相中的primer可以通过碱基互补配对与打开的HAP1杂交成一定的双链。在phi29DNA聚合酶的作用下，primer以打开的HAP1为模板生长成完全互补的杂交双链，并释放出目标物卡那霉素，游离出来的卡那霉素可以继续打开别的HAP1，然后重复上述过程。此为第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）。

由于HAP1上有内切酶Nt.AlwI的识别序列，在聚合酶长出互补双链时，内切酶会在长出的新链上切出一个缺口，再结合phi29的链置换功能，可将aptamer的互补链（a*）置换下来，并源源不断的产生很多的a*。产生的a*与HAP1的杂交稳定性远大于HAP1本身，所以a*可以作为二级目标物打开HAP1，并引发第二步循环放大（二级目标物诱导的循环放大）。

第三步的循环放大是在电极表面发生的，上述两步循环放大的结果都是产生大量的a*。首先在金电极表面修饰一层捕获探针（HAP2）与Helper的混合液，在Helper存在的条件下，两条链以杂交双链的形式固定在电极表面。然后将均相反应后的产物滴加到修饰好的金电极表面。由于a*与Helper的熔链温度高于Helper与HAP2，所以a*能把电极表面的Helper链置换下来，形成稳定的杂交双链。在ExoⅢ的作用下，可以将杂交双链中的Helper链水解，重新暴露出游离的单链a*，可用来置换其余的Helper链。在没有Helper存在时，固定在电极表面的HAP2可自身折叠形成发夹构型，使修饰在5’端的电活性物质靠近电极表面，产生很强的电化学信号。此为第三步循环放大（电极表面的循环放大）。具体反应原理图如图1所示。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2h。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，外切功能的核酸外切酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补卡那霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用卡那霉素的aptamer作为识别物质实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；

2、利用具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，实现了目标物的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；

3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合聚合酶，生成了大量可作为二级目标物的a*，实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度；

4、利用外切酶的切割作用，实现了电极表面a*的循环利用，实现了第三步的循环放大；

5、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

6、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；

7、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

8、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；

9、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的HAP2与Helper的混合液（10μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、不同浓度的HAP1（1μM，2μM，5μM，10μM，15μM，20μM）,Primer（10μM），phi29DNA聚合酶（2μL），dNTPs（2μL），Nt.AlwI内切酶（1μL）和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h。

b、将孵育好的混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

c、将（b）中的混合溶液与ExoⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

PBS缓冲液的pH值为7.4。

10X的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

结果见表1，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP1的浓度在0-10μM区间内增大而增大，当浓度超过10μM后，电流趋于稳定。所以HAP1的最佳浓度为10μM。

表1

。

实施例2

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的HAP2与Helper的混合液（10μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1（10μM）,不同浓度的Primer（1μM，2μM，5μM，10μM，15μM，20μM），phi29DNA聚合酶（2μL），dNTPs（2μL），Nt.AlwI内切酶（1μL）和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h。

b、将孵育好的混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

c、将（b）中的混合溶液与ExonucleaseⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

结果见表2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着Primer的浓度在0-10μM区间内增大而增大，当浓度超过10μM后，电流趋于稳定。所以Primer的最佳浓度为10μM。

表2

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实施例3

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL不同浓度的HAP2与Helper的混合液（1μM，2μM，5μM，10μM，15μM，20μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1（10μM）,Primer（10μM），phi29DNA聚合酶（2μL），dNTPs（2μL），Nt.AlwI内切酶（1μL）和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h。

b、将孵育好的混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

c、将（b）中的混合溶液与ExoⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

结果见表3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP2的浓度在0-10μM区间内增大而增大，当浓度超过10μM后，电流趋于稳定。所以HAP2的最佳浓度为10μM。

表3

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实施例4

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的HAP2与Helper的混合液（10μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1（10μM）,Primer（10μM），phi29DNA聚合酶（2μL），dNTPs（2μL），Nt.AlwI内切酶（1μL）和不同浓度的待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h。

b、将孵育好的混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

c、将（b）中的混合溶液与ExoⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。检测结果表4所示，a到i分别为5pM，10pM，50pM，100pM，500pM，1nM，5M，10nM。图中我们可以看到，在卡那霉素的浓度在5pM到10nM时，卡那霉素浓度的对数与电流大小成正比关系，拟合曲线：I=0.1245+0.2613lgC（I是电流，C是卡那霉素的浓度），同时，我们在5pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于5pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即表中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为5pM。

表4

。

<110>济南大学

<120>基于核酸适配体检测卡那霉素的电化学传感器及其制备方法

<160>2

<210>1

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(46)

<223>引物

<400>1

TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGACTCAGAGAT30

CCATATGGAACCCCCA46

<210>2

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(8)

<223>引物

<400>2

TGGGGGTT8

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>引物

<400>3

GCTTAGCCTCAACCCATTGTTCTAAGCTTT30

T31

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>4

GGGTTGAGGCTAAGCCGACT20

Claims (5)

1.一种基于核酸适配体检测卡那霉素的电化学传感器，其特征在于，由以下步骤制备而成：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2与Helper的混合液修饰到电极表面；

（3）将均相反应产物层修饰到电极表面；

所述HAP2的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:3所示；

所述Helper的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（2）具体为：将10μL的浓度为10μM的HAP2与Helper的混合液滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。

3.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（3）具体为：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、10μM的HAP1，10μM的Primer，phi29DNA聚合酶，dNTPs，Nt.AlwI内切酶和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）将孵育好的混合溶液放在65℃的恒温箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶与Nt.AlwI内切酶失活；

（3）再与ExoⅢ一同滴加到修饰好HAP2与Helper的混合液的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；

所述HAP1的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1所示；

所述Primer的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（1）具体为：电极在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

5.根据权利要求1或4所述的电化学传感器，其特征在于，所述电极为金电极。