CN107037103A

CN107037103A - 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN107037103A
Application number: CN201710338108.5A
Authority: CN
Inventors: 黄加栋; 裴倩倩; 刘素; 王玉; 王虹智; 郭玉娜
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2017-05-15
Publication date: 2017-08-11
Anticipated expiration: 2037-05-15
Also published as: CN107037103B

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器，并提供了其制备方法。本发明是由以下步骤制备而成的：在电极上依次修饰有HAP2层，均相反应混合液。本发明利用了核酸适配体的特异性识别，利用鼠伤寒沙门氏菌的aptamer作为识别物质实现了对目标物鼠伤寒沙门氏菌的高特异性检测；利用核酸工具酶，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用。

Description

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器，还涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器的制备方法。

背景技术

沙门氏菌为两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其他都有周身鞭毛。沙门氏菌是一种常见的人畜共患病原体，不仅能够引起胃肠炎，还会引起败血症、伤寒及肠外灶性感染等多种症候群。尤其以鼠伤寒沙门氏菌为代表的病原菌在食品安全、环境监测、疾病预防等方面造成了巨大的威胁，对人体健康造成了很大危害，因而受到人们的强烈关注。近年来，鼠伤寒沙门氏菌检测技术有了很大的进展，由十分困难的传统分离培养法到免疫学检测方法发展成为今天的分子生物学检测技术。毫无疑问，检测方法的进展在便利鼠伤寒沙门氏菌检测的同时，也将更好地为了解鼠伤寒沙门氏菌奠定了基础。但是也存在着操作复杂、耗时长，灵敏度不高等技术问题。

发明内容

本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂、耗时长和需要专业操作人员的缺陷，提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低和检测速度快的基于核酸外切酶Ⅲ辅助的层叠信号放大的电化学生物传感器用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。

本发明还提供了检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：

Aptamer:5’- AGTAATGCCCGT AGTTATTCAAA GATGAGTAGG AAAAGA- 3’（SEQ ID NO.1）；

Primer：5’-CCTACTCATC AAAA ACGGGCATTACT-3’(SEQ ID NO.2)；

HAP1:5’ - CCACCAGCCCTACT CATCAAATAATTTTTTAGTAGGGCTGGTGG

TTGATGAGTAGG – 3’(SEQ ID NO.3)；

HAP2: 5’- SH - CTT CCTACT GAAG (MB) TAAAGATG AGTAGG GCTGGTGG – 3’(SEQ IDNO.4)。

其中Aptamer的下划线部分是Primer下划线部分的互补序列，HAP1的黑体标注是Primer黑体标注的互补序列，HAP2的斜体黑体标注是HAP1斜体黑体标注的互补序列。HAP2的5’端修饰-SH，通过Au-S共价键将HAP2固定在金电极表面，HAP2环中间修饰上电活性物(MB)，可以在一定的电位下发生氧化还原反应。通过测量MB信号的变化来定量检测鼠伤寒沙门氏菌。

本发明中只用到了一种酶：Exonuclease Ⅲ。Exonuclease Ⅲ能够水解双链DNA的3’端，对双链DNA突出的3’端和单链没有水解作用，因此，Exonuclease Ⅲ对放大检测DNA提供了更加通用的平台。

本发明中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过三步循环的方式来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：首先，HAP1由三个区域组成：区域1含有和primer部分相同的序列，区域2作为茎部固定发夹的结构，区域3能够完全地与primer杂交。当有鼠伤寒沙门氏菌存在时，由于aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，释放出primer。随后均相中的primer的部分序列可以通过碱基互补配对与HAP1的3¢端单链序列（区域3）杂交成一定的双链。在Exonuclease Ⅲ的作用下，开始从HAP1的3¢端水解，直至双链水解完，释放出primer和区域1（二级目标物）。然后primer与其他的HAP1再次进行杂交，然后重复上述过程。引发第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）。

在第一步循环放大过程中释放的二级目标物也可以与HAP1进行杂交，然后在Exonuclease Ⅲ的作用下，水解杂交双链，释放出二级目标物。二级目标物可与其他HAP1再次进行杂交，然后重复上述过程，并引发第二步循环放大（二级目标物诱导的循环放大）。

第三步的循环放大是在电极表面发生的，上述循环放大的结果是产生大量的二级目标物。首先在金电极表面修饰一层HAP2。然后将均相反应后的产物滴加到修饰好的金电极表面。二级目标物与HAP2杂交双链的熔链温度高于HAP2本身，所以二级目标物能把HAP2打开，在HAP2的3¢端形成平末端的稳定杂交双链。在Exonuclease Ⅲ的作用下，可以从HAP2的3¢端开始水解，释放出二级目标物，再次打开其他的HAP2。水解之后，固定在电极上的HAP2剩余的单链两端的碱基互补配对，形成发夹构型，使修饰的电活性物质靠近电极表面，产生很强的电化学信号。此为第三步循环放大（电极表面的循环放大）。

在均相反应中，反应条件为37 ℃，反应时间是2 h。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2修饰到电极表面；

（3）将均相反应产物修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选将HAP2修饰到电极表面的操作步骤如下：将10 μL的HAP2(10 μM)滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h。

所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液(10 mM Bis Tris Propane-HCl，10mM MgCl₂,1 mM DTT，pH 7.0)、2 μL aptamer (1 mM)、2 μL primer (1 mM)、2 μL HAP1(10mM)、2 μL Exonuclease Ⅲ(20 U/μL)和2 μL待测目标物加入离心管中，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；

（2）将（1）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2(10 mM)的电极上，将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2 h，清洗。

所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定在电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37 ℃孵育2 h完成电极表面的循环放大过程。最后使电极上HAP2剩余的单链折叠成发夹构象，电活性物质（MB）靠近电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，外切功能的Exonuclease Ⅲ辅助层叠信号放大以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用鼠伤寒沙门氏菌的aptamer作为识别物质实现了对目标物鼠伤寒沙门氏菌的高特异性检测；

2、利用Exonuclease Ⅲ对双链DNA 3’端的水解作用，释放出primer与二次目标物循环利用，实现了第一、二步循环放大，提高了检测的灵敏度；

3、利用外切酶的切割作用，实现了电极表面二次目标物的循环利用，实现了第三步的循环放大；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；

6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中鼠伤寒沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1 HAP1浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 HAP2浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 Exonuclease Ⅲ浓度优化检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2修饰到电极表面；

（3）将均相反应产物修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

反应原理图如图1所示。

实施例1

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10 μL的HAP2（10 μM）滴加到电极表面，在37 ℃孵育2 h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液(10 mM Bis Tris Propane-HCl，10 mMMgCl₂,1 mM DTT，pH 7.0)、2 μL aptamer (1 mM)、2 μL primer (1 mM)、2 μL HAP1（1 μM，3 μM，6 μM，10 μM，15 μM，20 μM）、2 μL Exonuclease Ⅲ(20 U/μL)和2 μL待测目标物加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；

b、将（1）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2(10 mM)的电极上，将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2 h，清洗。

c、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10 min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

PBS缓冲液是由方法配制：Na₂HPO₄ (10 mM)、NaH₂PO₄(10 mM)、 NaCl (140 mM)、 KCl(1 mM)、MgCl₂ (1 mM)、CaCl₂(1 mM)，最终溶液的pH值为7.4。

10×的NEBuffer缓冲液是随外切酶一起买来的，可直接使用。

配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP1的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。所以HAP1的最佳浓度为10 μM。

实施例2

电极修饰过程的主要步骤如下：

b、将10 μL的HAP2（1 μM，3 μM，6 μM，10 μM，15 μM，20 μM）分别滴加到电极表面，在37℃孵育2 h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

a、将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液(10 mM Bis Tris Propane-HCl，10 mMMgCl₂,1 mM DTT，pH 7.0)、2 μL aptamer (1 mM)、2 μL primer (1 mM)、2 μL HAP1（10 μM）、2 μL Exonuclease Ⅲ(20 U/μL)和2 μL待测目标物加入离心管中，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；

b、将（1）中的混合溶液分别滴加到修饰好HAP2（1 μM，3 μM，6 μM，10 μM，15 μM，20 μM）的电极上，将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2 h，清洗。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP2的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。所以HAP2的最佳浓度为10 μM。

实施例3

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液(10 mM Bis Tris Propane-HCl，10 mMMgCl₂,1 mM DTT，pH 7.0)、2 μL aptamer (1 mM)、2 μL primer (1 mM)、2 μL HAP1（10 μM）、2 μL Exonuclease Ⅲ（5 U，10 U，15 U，20 U，25 U，30 U）和2 μL待测目标物加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；

b、将（1）中的混合溶液分别滴加到修饰好HAP2（10 μM）的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2 h，清洗。

e、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10 min，共清洗3次。

结果见图4，从图中可以看出，检测到的电流信号随着Exonuclease Ⅲ的浓度在0-20 U区间内增大而增大，当浓度超过20 U后，电流趋于稳定。所以Exonuclease Ⅲ的最佳浓度为20 U。

实施例4

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液(10 mM Bis Tris Propane-HCl，10 mMMgCl₂,1 mM DTT，pH 7.0)、2 μL aptamer (1 mM)、2 μL primer (1 mM)、2 μL HAP1（10 μM）、2 μL Exonuclease Ⅲ（20 U）和2 μL待测目标物（9.5，9.5×10，9.5×10²，9.5×10³，9.5×10⁴，9.5×10⁵，9.5×10⁶cfu mL^-1）加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2h；

检测结果如下表所示：

。

从以上表可以看出，本发明在鼠伤寒沙门氏菌浓度为9.5cfu mL^-1 时仍呈线性关系，所以本发明可以灵敏的检测该浓度的鼠伤寒沙门氏菌。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>济南大学

<120>一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器及其制备方法

<160>2

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(39)

<223>引物

<400>1

AGT AAT GCC CGT AGT TAT TCA AAG ATG AGT 30

AGG AAA AGA 39

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>2

CCT ACT CAT CAA AAA CGG GCA TTA CT 26

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(56)

<223>引物

<400> 3

CCA CCA GCC CTA CTC ATC AAA TAA TTT TTT 30

AGT AGG GCT GGT GGT TGA TGA GTA GG 56

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(35)

<223>引物

<400> 4

CTT CCT ACT GAA GTA AAG ATG AGT AGG GCT 30

GGT GG 35

Claims

1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学生物传感器，其特征在于，由以下步骤制备而成：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2修饰到电极表面；

（3）将均相反应产物修饰到电极表面；

所述HAP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤（2）将HAP2修饰到电极表面的操作步骤如下：将10 μL ，10 μM的HAP2滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h。

3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将8 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer缓冲液、2 μL ，1 mM aptamer 、2 μL， 1 mMprimer 、2 μL，10 mM HAP1、2 μL ，20 U/μL Exonuclease Ⅲ和2 μL待测目标物加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；

（2）将（1）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2 h，清洗；

所述aptamer 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述primer的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述HAP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，对电极进行预处理的具体步骤为，电极在0.3µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电极为金电极。