CN106906277A - 一种检测卡那霉素的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的生物传感器。具体制备方法为：制备方法：对电极进行预处理；将HAP2层修饰到电极表面；将均相反应混合液修饰到电极表面。本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用卡那霉素的aptamer作为识别物质实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；利用核酸工具酶，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用。

Description

一种检测卡那霉素的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于目标诱导的核酸适配体构象变化和lambda核酸外切酶检测卡那霉素的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素。对多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、普罗菲登菌属、耶尔森菌属等均有良好作用；流感杆菌、布鲁菌属、脑膜炎球菌、淋球菌等对本品也大多敏感，对铜绿假单胞菌无效。对葡萄球菌属中甲氧西林敏感株和结核分枝杆菌也有一定作用，其他革兰阳性细菌如溶血性链球菌、肺炎链球菌、肠球菌和厌氧菌等对本品多数耐药性。但是卡那霉素在人类危害性高的时期可有听力及肾损害，可引起胃肠道反应：恶心、呕吐、食欲不振、腹胀、腹泻，偶有过敏反应、皮疹、药热等，严重者可有休克死亡，也可有神经系统症状，心肌抑制、呼吸衰竭等。
目前报道的检测Ka的方法包括毛细管电泳法，表面等离子体共振方法，高效液相色谱法和荧光共振方法。这些方法有特异性和灵敏度低，检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测Ka是至关重要的。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测卡那霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的生物传感器。本发明还提供了基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测卡那霉素的生物传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：
Helper：5′-AGGAGTGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAATTC-3’ （SEQ ID NO:1）；
Primer：5’-GAATTCGGCCCACTCCT-3’(SEQ ID NO:2)；
HAP1：5’-P-AGGAGTGGGCCGAATTCTCCTCAGCT-3’ (SEQ ID NO:3)；
HAP2：5’-AACCCGAAGCTGAGGAGGGTAGGGCGGGTTGGGTTT-SH-3’ (SEQ ID NO:4)。
本发明中用到了两种酶：Nb.BbvCI限制性核酸内切酶，Lambda核酸外切酶。Lambda核酸外切酶是一种高持续性核酸外切酶，作用于双链DNA，沿5’→3’方向逐步切去双链DNA中5’修饰了磷酸基团的单链中的单核苷酸。Nb.BbvCI可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：5’-GC↓TGAGG-3’。
本发明中卡那霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过两步循环的方式来实现信号的放大，从而实现卡那霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：拱形探针是由aptamer和primer通过杂交形成，当有卡那霉素存在时，由于aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，primer可以释放同时把HAP1打开，使HAP1和primer杂交，未互补序列以单链的形式暴露在外面，λ核酸外切酶可以识双链中5’修饰磷酸基团的那条单链并水解，此时primer释放可以继续打开下一个HAP1，然后重复上述过程，引发第一次循环放大。
随后均相中剩下的单链sDNA通过碱基互补配对与通过金硫键修饰固定在电极表面上的HAP2的茎部杂交成的双链。双链中有Nb.BbvCI内切酶的识别位点，在其作用下，暴露出hemin的aptamer，在hemin的存在下，能与它的aptamer特异性结合形成G四联体结构，游离出来的sDNA可以继续结合HAP2，产生更多的G-四联体结构，在hemin和K+存在下形成过氧化物酶还原H2O2，产生电子传递，通过电化学方法检测产生电流信号，然后重复上述过程。此为第二步循环放大。
在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2h。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将HAP2修饰到电极表面；
（3）将均相反应产物层修饰到电极表面。
所述的制备方法，HAP2修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μL的HAP2溶液滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。
所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：
（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1, Primer，aptamer，lambda核酸外切酶，待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（2）将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5min，使lambda核酸外切酶失活；
（3）将Nb.BbvCI与（2）中的溶液混合，取10μL滴加到修饰好HAP2电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；
（4）将hemin滴加在（3）反应后的电极表面上，将电极继续放在37℃的恒温箱孵育40min，清洗。
所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
所述的制备方法，优选所述电极为金电极。
该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定在电极表面。然后将反应后的均相溶液与Nb.BbvCI一起修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h完成电极表面的循环放大过程。最后使电极上的HAP折叠成G四联体，然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取双氧水电信号的变化，检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，外切功能的核酸外切酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，以及G四联体结构的氧化还原双氧水的特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补卡那霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用卡那霉素的aptamer作为识别物质实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；
2、利用具有水解单侧双链结构的功能的Lambda核酸外切酶，实现了primer的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；
3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，暴露了大量的hemin的aptamer，并实现了sDNA的重复利用，实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度；
4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；
6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；
8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1HAP1浓度优化检测结果图；
图3为实施例2 hemin浓度优化检测结果图；
图4为实施例3 HAP2浓度优化检测结果图；
图5为实施例4传感器检测的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将HAP2修饰到电极表面；
（3）将均相反应产物层修饰到电极表面。
所述的制备方法，优选将HAP2修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μL的HAP2滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。
所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：
(1) 将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP1, Primer，Helper，Lambda核酸外切酶，待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（2）将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5min，使Lambda核酸外切酶失活；
（3）将Nb.BbvCI与（b）中的溶液混合，取10μL滴加到修饰好HAP2电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；
（4）将hemin滴加在（3）反应后的电极表面上，将电极继续放在37℃的恒温箱孵育40min，清洗。
所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
所述的制备方法，优选所述电极为金电极。原理图如图1。
该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定在电极表面。然后将反应后的均相溶液与Nb.BbvCI一起修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h完成电极表面的循环放大过程。最后使电极上的HAP折叠成G四联体构象，能够氧化还原双氧水。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取氧化还原双氧水电信号的变化，检测待测目标物。
实施例1
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10 μL的HAP2（10 μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将3μL灭菌水，5μL 10×的buffer缓冲液、4μL不同浓度的HAP1（5 μM，10 μM，25 μM，50 μM，75 μM，100μM）, 2μLPrimer（10 μM），lambda核酸外切酶（1 μL），2μL Helper（50 μM），和2μL待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
b、将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5min，使Lambda核酸外切酶失活；
c、将Nb.BbvCI（1μL）与（b）中的溶液混合，均相20μL，取10μL滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
e、将 hemin（20μM）滴加在清洗过的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育40min，用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取氧化还原双氧水电信号的变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
PBS缓冲液是由方法配制：Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM), NaCl (140 mM), KCl(1 mM), MgCl2 (1 mM), CaCl2 (1 mM), 最终溶液的pH值为7.4。
10X的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。
结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP1的浓度终浓度在0-10μM区间内增大而增大，当浓度超过10μM后，电流趋于稳定。所以HAP1的最佳浓度为10μM。
实施例2
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将3μL灭菌水，5μL 10×的buffer缓冲液、4μL不同浓度的HAP1（50 μM）, 2μLPrimer（10 μM），lambda核酸外切酶（1 μL），2μL Helper（100 μM），和2μL待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h。b、将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5min，使lambda核酸外切酶失活；
c、将Nb.BbvCI（1μL）与（b）中的溶液混合，均相20μL，取10μL滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
e、将不同浓度的hemin（0，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM）滴加在清洗过的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育40min，用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取氧化还原双氧水电信号的变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着hemin的浓度在0-20 μM区间内增大而增大，当浓度超过20 μM后，电流趋于稳定。所以hemin的最佳浓度为20 μM。
实施例3
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10 μL不同浓度的HAP2（1 μM，2 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）滴加到电极表面，在37℃孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将3μL灭菌水，5μL 10×的buffer缓冲液、4μL不同浓度的HAP1（50 μM）, 2 μLPrimer（10 μM），lambda核酸外切酶（1 μL），2μL Helper（100 μM），和2μL待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
b、将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5min，使lambda核酸外切酶失活；
c、将Nb.BbvCI（1μL）与（b）中的溶液混合，均相20μL，取10μL滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
e、将hemin（20μM）滴加在清洗过的电极上，将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育40min，用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取氧化还原双氧水的电信号的变化，检测目标物。
结果见图4，从图中可以看出，检测到的电流信号随着HAP2的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。所以HAP2的最佳浓度为10 μM。
实施例4
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
a、金电极首先在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将3μL灭菌水，5μL 10×的buffer缓冲液、4μL不同浓度的HAP1（50 μM）, 2μL Primer（10 μM），lambda核酸外切酶（1 μL），2μL Helper（100 μM），和2μL不同浓度待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
b、将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5 min，使lambda核酸外切酶失活；
c、将Nb.BbvCI（1μL）与（b）中的溶液混合，均相20μL，取10μL滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
e、将hemin（20μM）滴加在清洗过的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育40min，用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。检测结果如图5所示，a到i分别为 100pM，500pM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM。图中我们可以看到，在卡那霉素的浓度在100pM 到 1μM时，卡那霉素浓度的对数与电流大小成正比关系，拟合曲线：I=0.80515+0.49126lgC（I是电流，C是卡那霉素的浓度），同时，我们在100pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为100pM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>济南大学
<120>一种检测卡那霉素的生物传感器及其制备方法
<160>2
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物
<400>1
AGG AGT GGG GGT TGA GGC TAA GCC GAA TTC 30
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(17)
<223>引物
<400>2
GAA TTC GGC CCA CTC CT 17
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>引物
<400> 3
AGG AGT GGG CCG AAT TCT CCT CAG CT 26
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(36)
<223>引物
<400> 4
AAC CCG AAG CTG AGG AGG GTA GGG CGG GTT 30
GGG TTT 36

Claims (5)

1.一种检测卡那霉素的生物传感器，其特征在于，由以下步骤制备而成：
（1）对电极进行预处理；
（2）将HAP2修饰到电极表面；
（3）将均相反应产物层修饰到电极表面；
所述HAP2的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（2）HAP2修饰到电极表面的操作步骤如下：将10Μl 10μM的HAP2溶液滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（3）将均相反应产物层修饰到电极表面的操作步骤如下：
（1）将3μL灭菌水，5μL 10×的buffer缓冲液、4μL 50 μM的HAP1， 2μL 10 μM Primer，1μL lambda核酸外切酶，2μL 100 μM Helper，和2μL待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（2）将孵育好的混合溶液放在75℃的恒温箱中孵育5 min，使lambda核酸外切酶失活；
（3）将1μL Nb.BbvCI与（2）中的溶液混合，取10μL滴加到修饰好HAP2的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；
（4）用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
（5）将20μM hemin滴加在清洗过的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育40min，用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；
所述Helper的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述primer的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述HAP1的序列如SEQ ID NO:3所示。
4. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，对电极进行预处理操作为，电极在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述电极为金电极。
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