CN104897742A - 基于核酸适配体检测四环素的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于核酸适配体检测四环素的生物传感器，包括金电极及修饰于金电极上的capture probe层、probe A和assistant probe层，同时提供了传感器的制备方法，本发明提供的生物传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补四环素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

Description

基于核酸适配体检测四环素的生物传感器及其制备方法

技术领域    

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测四环素的生物传感器，同时还涉及其制备方法。

背景技术   

四环素是一种广谱抑制剂，高浓度时具杀菌作用。该品对弧菌、鼠疫杆菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等革兰氏阴性菌抗菌作用良好。多年来由于四环素类的广泛应用，临床常见病原菌包括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐药，并且，同类品种之间存在交叉耐药。大量资料证实，长期反复使用四环素，有可能影响牙齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良（牙齿表面不光滑，出现小凹陷）或牙齿畸形。因此，确定食品及农产品中的四环素的残留量已经变得至关重要。

目前，主要用来检测四环素的方法包括液相色谱质谱联用技术（LC–ESI-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）。但是这两种方法都存在自身不可避免的缺点与限制。例如：需要较为昂贵的仪器设备，专业的操作人员以及复杂的样品预处理过程。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中四环素的残留量。

发明内容   

为了解决以上现有技术中检测四环素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测四环素的生物传感器。还涉及其制备方法

本发明还提供了基于核酸适配体检测四环素的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

Apatamer：5’-CGACGCACAGTCGCTGGTGCGTACCTGGTTGCCGTTGTGT-3’  （SEQ ID NO：1）  ；

Probe A：5’-TGTGTTGCCACGCAGC-3’（ SEQ ID NO：2）；

HAP：5’-GCTGCGTGGCAACACAGCTGCCTGTGTTGCCACGCAGC-3’（ SEQ ID NO：3）；

Assistant probe：5’-GCTGCGTGCGTTAGATCC-3’（ SEQ ID NO：4）；

Capture probe：5’-SH-GCTGCGTGGCAACACAGCTGCCTGTGTTGCCACGCAGC-MB-3’（ SEQ ID NO：5）；

其中aptamer与probe A组成半杂交的桥形探针。

本发明中用到了两种酶：Exonuclease Ⅲ和Nt.AlwI 内切酶。Exonuclease Ⅲ能够特异性的切割DNA双链的3’平末端或凹末端，而对3’的凸末端与DNA单链却不起作用。Nt.AlwI可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：GGATCNNNNN，切割位点是最后两个碱基之间。

本发明中四环素的检测是在均相溶液中实现的，通过两步循环的方式来实现信号的放大，从而实现四环素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：桥型DNA双链的一条链是目标物四环素的适配体，当有四环素存在时，由于适配体与目标物之间的特异性结合，将适配体从桥形探针上竞争下来，从而使适配体的互补链游离（A）在均相溶液中。Probe A序列又与HAP的3’段伸出的部分完全互补，故可以形成互补配对的双链。使HAP的3’凸末端变成3’平末端，该构象可以被Exonuclease Ⅲ沿着3’端切割，直到HAP的环端单链，同时释放环HAP上的5’段序列。本发明中设计该部分序列与probe A的序列完全一样，所以循环一次就会产生多产生一条probe A，从而起到放大信号的作用。为了更灵敏的检测到痕量的四环素，进一步降低该发明的最低检测限，在信号的产生过程中，我们设计了第二步的循环放大。

在信号的产生过程中，首先在金电极表面修饰一层捕获探针，该探针的一端用巯基（-SH）修饰，通过Au-S的共价结合可以将捕获探针很好的固定在金电极表面。然后将均相反应后的产物及辅助探针一起滴加到修饰好的电极表面。在assistant probe与均相中的A的协同作用下，会在电极表面形成一种Y形的构象。并在辅助探针与捕获探针杂交的序列中形成一个Nt.AlwI的切割位点，由于酶的切割，使得捕获探针上的电活性物质远离电极表面，从而使电化学信号降低。游离出来的assistant probe与probe A可以继续结合电极上剩余的捕获探针，从而起到循环放大的目的。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2h。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将capture probe层修饰到电极表面；

（3）将probe A和assistant probe层修饰到电极表面。

所述capture probe层的厚度为10±2nm、capture和assistant probe层的厚度为20±2nm。

所述的制备方法，优选将capture probe层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μM的capture probe 10μL滴加到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。

所述的制备方法，优选将probe A和assistant probe修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、桥形探针和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）向离心管中加入HAP、Exonuclease Ⅲ，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（3）将孵育好的混合溶液与assistant probe一同滴加到修饰好capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将capture probe 固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液与辅助探针一起修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h使均相中的A和assistant probe与电极表面的capture probe 完成杂交反应产生Y形构型，然后用Nt.AlwI切割辅助探针与捕获探针杂交产生的切割位点，从而使MB远离电极表面，然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有外切功能的核酸外切酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补四环素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用四环素的适体作为识别物质实现了对目标物四环素的高特异性检测；

2、利用外切酶的切割作用，实现了probe A的循环利用并产生相同序列的链，起到了信号放大的作用；

3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合probe A与assistant probe的协同作用将电极表面的发夹信标打开，实现了第二步循环放大。信号的两次循环放大实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；

6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中四环素的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明   

图1为该实验的原理图；

图2为实施例2传感器检测的工作曲线；

图3为实施例2的检测结果坐标图；

图4为生物传感器的结构示意图。

其中，1为金电极，2为capture probe层；3为probe A和assistant probe层。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

电极修饰过程的主要步骤如下：

a、金电极1首先在0.3μM和0.05μM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL发夹形的capture probe（10μM）滴加到电极表面，在室温下(25℃)孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面得capture probe层2；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10X的缓冲液（buffer），1μL，浓度为10μM的桥形探针的DNA链和目标物加入到预先准备好的灭菌的离心管中，震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、继续向a步的离心管中加入HAP（10μM），Exonuclease Ⅲ（1μL），震荡30s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育2h；

c、将b步反应后的溶液与assistant probe（10μM），Nt.AlwI（1μL）均匀混合，然后将混合溶液（10μL）滴加到预先修饰好capture probe的电极上，然后将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2h，得probe A和assistant probe层3；

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

PBS缓冲液是由方法配制：Na₂HPO₄ (10mM)，NaH₂PO₄ (10mM), NaCl (140mM), KCl (1mM), MgCl₂ (1mM), CaCl₂ (1mM), 最终溶液的pH值为7.4。

10X的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。

实施例2

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、金电极首先在0.3μM和0.05μM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的capture probe（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10X的缓冲液（buffer），桥形结构的DNA链（10μM）和1μL不同浓度的目标物（100pM，500pM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM）加入到预先准备好的灭菌的离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、继续向a步的离心管中加入HAP（10μM），Exonuclease Ⅲ（1μL）。震荡30s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育2h；

c、将b步反应后的溶液与assistant probe（10μM），Nt.AlwI（1μL）均匀混合，然后将混合溶液（10μL）滴加到预先修饰好capture probe的电极上。然后将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2h；

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。检测结果如图2和图3所示，a到i分别为 100pM，500pM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM。图中我们可以看到，在四环素的浓度在100pM 到 1μM时，四环素浓度的对数与电流大小成正比关系，拟合曲线：I=8.02+0.67lgC（I是电流，C是四环素的浓度），同时，我们在100pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为100pM。

                                                  

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于核酸配体检测四环素的生物传感器，其特征在于，包括金电极，金电极上从里向外依次修饰有capture probe层、probe A和assistant probe层。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述capture probe层的厚度为10±2nm、capture和assistant probe层的厚度为20±2nm。

3.一种权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将capture probe层修饰到电极表面；

（3）将probe A和assistant probe层修饰到电极表面。

4.所述capture probe的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述probe A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述assistant probe的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将capture probe层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μM的capture probe 10μL滴加到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将probe A和assistant probe层修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、10μM桥形探针和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）向离心管中加入10μM  HAP、1μLExonuclease Ⅲ，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（3）将孵育好的混合溶液与10μM assistant probe一同滴加到修饰好capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；

所述桥形探针由aptamer与probe A半杂交而成；

所述aptame的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述HAP 的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，对电极的预处理方法为：电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。