CN105238852A - 基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法，本发明通过Primer的不断产生和循环利用来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。本发明制备的生物传感器特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。通过这种检测方法，沙门氏菌检测限在5-15cfu/mL，检测范围是1×10-1×107cfu/mL。

Description

基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比率。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研究表明鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。调查中，鼠伤寒沙门氏菌感染数量占当年沙门氏菌感染总量的17%。同时，在我国境内已发现的290余种沙门氏菌血清型中,鼠伤寒沙门氏菌也是最常见的血清型之一。
目前，主要用来检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括生化鉴定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺点与限制，需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程,耗时一周左右,不利于快速、准确地对食品中的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。因此,有必要建立一种高效快速检测鼠伤寒沙门氏菌的新方法。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测鼠伤寒沙门氏菌的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。通过这种检测方法，沙门氏菌检测限在5-15cfu/mL，检测范围是1×10-1×107cfu/mL(cfu为菌落总数)。
本发明还提供了基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到了5条DNA链，分别是：HAP1、HAP2、Primer、Aptamer、Helper。
其序列分别为：
HAP1：5’-AGTAATGCCCGAAAAGGAAAAGA GGAGACTTTTCGGGCATTACTCGTACAAGTAATGCCATAA-3’（SEQIDNO:1）；
HAP2：5’-SH-AGCCAGTCTCAG GGAAAAGTGGCT-MB-3’（SEQIDNO:2）；
Primer：5’-TCTTTTCC TTTT CGGGCATTACT -3’（SEQIDNO:3）；
Aptamer：5’-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3’（SEQIDNO:4）；
Helper：5’-AGTAATGCCCGAAAA CTGAGAC-3’（SEQIDNO:5）。
Aptamer是目标物鼠伤寒沙门氏菌的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密结合。其中5’端（斜体部分）和3’端（黑体部分）分别与Primer的3’端（斜体部分）和5’端（黑体部分）杂交，当有目标物存在时，Aptamer会优先于目标物结合从而释放Primer。
其中发夹结构的序列HAP1中，加粗序列部分为Primer的互补序列，划线部分为酶切序列，3’端斜体部分为Primer的部分互补序列，是暴露的，当Primer存在时，可与其互补结合，在Phi29DNA聚合酶作用下以HAP1为模板，从3’端向5’端延伸，并将发夹打开。得到的双链在酶切位点处切开，产生新的Primer，实现一级放大。
HAP2的5’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将HAP2固定在电极表面，3’端修饰有亚甲基蓝（MB）。当HAP2维持发夹状的时候，MB是与电极表面接近的，有较大的电信号；当Primer的5’端（黑体部分）和Helper的3’端分别与HAP2的黑体部分和划线部分相结合时，Primer的3’端（划线部分）与Helper的5’端（划线部分）结合，这种两两结合的构象形成了三条链的Y型构象，由内切酶在HAP2的酶切位点处切开，释放Primer和Helper，循环利用，完成二级放大。
本发明中用到了两种酶：Phi29DNA聚合酶和Nt.BsmAI内切酶。Phi29DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，Nt.BsmAI内切酶在双链序列5’…GTCTCNN…3’两个N之间进行切割。
本发明中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相反应和电极表面中实现的，通过Primer的不断产生和循环利用来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：在有目标物鼠伤寒沙门氏菌存在的情况下，目标物与Aptamer结合，将原本与Aptamer结合的Primer引物竞争下来释放。被释放的Primer与HAP1暴露的3’端部分结合，在Phi29DNA聚合酶与dNTP的共同作用下，以HAP1结构为模板、Primer为引物发生延伸，在Nt.BsmAI内切酶的酶切位点处切割，释放新产生的Primer序列，得到Primer产物。
在均相反应中，Primer引物竞争反应条件为37℃，反应时间是1h，聚合反应条件为37℃，反应时间是2h。
电极表面发生的反应有：把均相反应中得到的Primer产物层低价到HAP2修饰好的电极表面，HAP2的发夹打开，与Primer、Helper两两杂交，形成Y型构象，由内切酶在HAP2的酶切位点处切开，释放Primer和Helper，循环利用。
在电极反应中，反应条件均为37℃，反应时间是2h。
一种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，在电极上依次修饰有HAP2层、Primer产物层。
所述的生物传感器，HAP2层的厚度为10±2nm，Primer产物层的厚度为30±2nm。
所述的生物传感器，HAP1（摩尔）、HAP2（摩尔）、Primer（摩尔）、Aptamer（摩尔）、Helper（摩尔）、聚合酶（活力）、连接酶（活力）和dNTP（活力）的摩尔与活性的比为1：10：1：1：1：40：40：2。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将HAP2层修饰到电极表面；
（3）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，37℃，孵育2h。
所述的制备方法，优先将HAP2层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μM的HAP2取10μL滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。
所述的制备方法，操作步骤如下：
（1）将灭菌水，Aptamer、Primer和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；
（2）将10×的buffer缓冲液、HAP1、Helper、dNTP、聚合酶和内切酶加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（3）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
所述的制备方法，优选所述电极为金电极。
该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h使均相中的Primer产物和Helper与电极表面的HAP2完成杂交反应，从而将HAP2打开并酶切，使MB远离电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的DNA聚合酶的链延伸和置换作用，酶切放大作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补鼠伤寒沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用鼠伤寒沙门氏菌的适体作为识别物质实现了对目标物鼠伤寒沙门氏菌的高特异性检测；
2、利用了内切酶的切割作用，实现了引物不断产生和重复利用；
3、利用聚合酶的聚合作用，实现了引物不断产生，起到了信号放大的作用；
4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；
6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中鼠伤寒沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；
8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下(37℃)孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Aptamer（1μL），1μL不同浓度的Primer链（浓度分别为20μM，10μM，5μM，2μM，1μM）和目标物加入到预先准备好的灭菌的1号-5号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上5个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、HAP1（1μL）、Helper（2μL）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
由表1，可以看出电流随Primer浓度的增高先降低后不变，所以我们得出结论在Primer浓度为10umol/mL时为最优浓度。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、PBS缓冲液是由方法配制：Na2HPO4(10mM)，NaH2PO4(10mM),NaCl(140mM),KCl(1mM),MgCl2(1mM),CaCl2(1mM),最终溶液的pH值为7.4。
10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
2、配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。
表1
实施例2
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Primer（1μL），1μL不同浓度的Aptamer链（浓度分别为20μM，10μM，5μM，2μM，1μM）和目标物加入到预先准备好的灭菌的1号-5号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上5个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、HAP1（1μL）、Helper（2μL）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。表2
由表2，可以看出电流随Aptamer浓度的增高先降低后不变，所以我们得出结论在Aptamer浓度为10μmol/mL时为最优浓度。
实施例3
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育1h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Primer（1μL），Aptamer链（1μL）和目标物加入到预先准备好的灭菌的1号-5号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上5个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、分别加入HAP1（浓度分别为40μM，60μM，80μM，100μM，120μM）、Helper（2μL）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
表3
HAP1浓度（μM） 电流（μA）
40 16.78
60 13.56
80 11.03
100 7.73
120 7.95
由表3，可以看出电流随HAP1浓度的增高先降低后不变，所以我们得出结论在HAP1结构浓度为100μmol/mL时为最优浓度。
实施例4
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的不同浓度的HAP2（20μM，10μM，5μM，2μM，1μM）分别滴加到准备好的5根电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Primer（1μL），Aptamer链（1μL）和目标物加入到预先准备好的灭菌的1号-5号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上5个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、HAP1（1μL）、Helper（2μL）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的5根电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
表4
HAP2浓度（μM） 电流（μA）
1 15.98
2 16.96
5 11.43
10 4.75
20 4.89
由表4，可以看出电流随HAP2浓度的增高先降低后不变，所以我们得出结论在HAP2结构浓度为10μmol/mL时为最优浓度。
实施例5
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
电极修饰过程的主要步骤如下：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育1h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Primer（1μL），Aptamer链（1μL）和目标物加入到预先准备好的灭菌的1号-5号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上5个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、分别加入HAP1（1μL）、Helper（20μM，10μM，5μM，2μM，1μM）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
表5
HAP2浓度（μM） 电流（μA）
1 16.77
2 14.56
5 10.13
10 3.95
20 4.09
由表5，可以看出电流随Helper浓度的增高先降低后不变，所以我们得出结论在HAP2结构浓度为10μmol/mL时为最优浓度。
实施例6
一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：
a、金电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10μL的HAP2（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；
至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
a、将灭菌水，Primer（1μL），Aptamer链（1μL）和目标物（0，1×101，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106，1×107cfu/mL）加入到预先准备好的灭菌的1号-8号离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育1h；
b、分别向以上8个离心管中加入10×的buffer缓冲液（1μL）、HAP1（1μL）、Helper（2μL）、dNTP（1μL）、聚合酶（1μL）和内切酶（1μL），震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。
d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
表6
目标物浓度（cfu /mL） 电流（μA）
0 18.05
1×101 16.32
1×102 14.33
1×103 9.97
1×104 5.21
1×105 1.89
1×106 0.69
1×107 0.73
表6中表示的是在最优的实验条件下，用本发明中构建的传感器检测不同浓度的目标物时，目标物的浓度与所测得电流的对应关系。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，由以下方法制备而成：（1）对电极进行预处理，取金电极，在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗；
（2）将10μM的HAP2取10μL滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h；
（3）将灭菌水，Aptamer、Primer和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；再将10×的buffer缓冲液、HAP1、Helper、dNTP、聚合酶和内切酶加入以上离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；
所述的HAP1、HAP2、Primer、Aptamer、Helper、聚合酶、连接酶和dNTP的摩尔与活性的比为1：10：1：1：1：40：40：2；
所述聚合酶为Phi29DNA聚合酶；
所述内切酶为Nt.BsmAI内切酶；
HAP1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
HAP2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
Primer的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
Aptamer的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
Helper的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。
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