CN103014163A

CN103014163A - 一种基于适配体识别的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法

Info

Publication number: CN103014163A
Application number: CN2012105527816A
Authority: CN
Inventors: 王周平; 袁京磊; 俞晔; 段诺; 吴世嘉; 夏雨; 马小媛
Original assignee: ZHANGJIAGANG EENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU; Jiangnan University
Current assignee: ZHANGJIAGANG EENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU; Jiangnan University
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提供了一种基于适配体识别的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法，其基本原理是在微孔板表面包被亲和素，用生物素化沙门氏菌适配子、纳米金标记的巯基化沙门氏菌适配子识别目标沙门氏菌，在此基础上，再利用银增强技术进一步放大检测信号，实现可视化检测。本方法具有特异性强、灵敏度高、简单、快速的优点，为快速检测环境中的鼠伤寒沙门氏菌提供了可能。

Description

一种基于适配体识别的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法

技术领域

本发明主要是通过鼠伤寒沙门氏菌适配体对沙门氏菌的特异性识别，并且通过金标银染的方法来实现可视化检测的。本发明涉及到分子生物学和微生物学的方法及技术，属于生物技术领域。

背景技术

沙门氏菌是兼性厌氧革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科细菌，是肠杆菌科中最重要的病原菌属之一。沙门氏菌引起的沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，此外，沙门氏菌可感染多种食物。欧洲食安局在总结报告中指出，沙门氏菌是欧洲食源性疾病爆发事件的最常见原因。在我国细菌性食物中毒中，70％～80％是由沙门氏菌引起。据美国疾控中心报告，沙门氏菌感染占全部食源性疾病发病人数的9.7％，死亡人数的30.6％。

目前沙门氏菌的检测方法主要包括传统的检测方法以及近年来发展起来的快速检测的方法。传统的检测方法主要是应用国标法进行检测。国标法是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法。此法通过预增菌、选择性增菌、分离、平板划线培养、然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并进行生化和血清检测以做出鉴定。这种传统的检测法至少需4～7天才能得出明确的结果，很难满足及时、快速评价食品中微生物安全性的需求。近年来，许多快速的检测方法逐步应用到了对沙门氏菌的检测中，这些快速的检测方法主要涉及到电化学、PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但是这些快速检测方法在检测的灵敏度、检测时间以及特异性上存在着一些缺陷。

寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。它能够与特异性的靶物质进行高亲和力和特异性的结合，所以能够特异性、高亲和力识别靶物质。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。

发明内容

鉴于现有检测技术在检测的灵敏度、检测时间以及特异性上存在的缺陷，本发明主要是针对这些缺陷，提供了一种快速、简单、特异性强、可视化检测沙门氏菌的新方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

首先制备粒径在12nm左右的纳米金。然后制备纳米金-沙门氏菌适配体探针。将亲和素包被酶标板，再加入生物素修饰的沙门氏菌适配体，然后加入样品；再加入纳米金-适配体探针，最后银染显色，从而达到可视化检测。

本发明的优点：

(1)由于适配体能够高亲和力和特异性的与靶物质结合，因此本方法所用的纳米金-适配体能够特异性的识别沙门氏菌，从而保证了本方法所具有的高的特异性。

(2)本发明中所涉及的纳米金、纳米金-适配体探针的制备等操作，具有简单、易于操作的优点，因此，本发明具有简单、易于操作的优势。

(3)本发明对沙门氏菌的检测限比较低，达到了10cfu/mL，而且在10⁶-10cfu/mL范围内线性良好(R²＝0.9913)

附图说明

图1是对制备的纳米金进行表征；

图2是特异性实验；a.沙门氏菌b.副溶血性弧菌c.化脓链球菌d.金黄色葡萄球菌e.阪崎杆菌f.大肠杆菌g.单增李斯特菌

图3是标准曲线；

具体实施方式：

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：应用基于适配体识别-金标银染的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法检测水样

1、合成生物素和巯基修饰的鼠伤寒沙门氏菌适配体(上海生工生物工程股份有限公司完成)。

生物素修饰的适配体：5’-biotin-C6-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATTATG ACA G-3’。

巯基修饰的适配体：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATGACA G-3’。

2、制备纳米金。

用王水(体积比为3∶1的浓盐酸和浓硝酸)浸泡相关容器，再用超纯水清洗，烘干。利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备纳米金：

1)在容器中加入99.16mL超纯水(≥18.2Ω)和0.84mL 2.5％氯金酸溶液，用转子搅拌均匀，煮沸10min。2)加入10mL 1％的柠檬酸三钠溶液，溶液立即变为深蓝黑色，继续煮沸10min。3)停止加热，持续搅拌15min。在室温下冷却，得到了酒红色的纳米金溶液。并通过透射电子显微镜以及紫外-可见吸收图谱对所制备的纳米金进行表征。

3、制备纳米金-适配体探针

取400μL纳米金至于1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心35min。吸出200μL的上清液，将浓度为10^-4M巯基修饰的沙门氏菌寡核苷酸适配体10μL加入到纳米金溶液中。37℃摇床孵育24h。将5mg SDS加入到纳米金-适配体溶液中，逐次加入1M的NaCl，使NaCl的终浓度达到0.36M，每次加入NaCl后，超声处理10s左右。37℃陈化24h。4℃14000rpm离心35min，吸出上清，再用1×PBS(0.1M NaCl，10mmol/LNa₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7.0)溶解沉淀，如此重复2次，以去除未连接到纳米金上的适配体，保存在4℃条件下备用。

4、亲和素包被酶标板

将亲和素(1mg/mL)用碳酸盐包被液(Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29g，100mL H₂O：pH 9.6)按1∶100稀释，每孔包被200μL，置于4℃环境，12h。用1×PBS洗涤3次，拍干。

5、牛血清蛋白(BSA)封闭酶标板

每孔加入100μL 1％BSA，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤3次，拍干。

6、每孔加入10μL浓度为10^-5M的生物素修饰的沙门氏菌适配体，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤3次，拍干。

7、每孔加入30μL的样品，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤3次，拍干。

8、每孔加入30μL的纳米金-适配体探针，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤1次，拍干；再用0.02mol/L的PBN缓冲液(0.3mol/L NaNO₃和10mmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7)洗涤两次，每次3min，拍干，以除去微孔板中游离的纳米金探针。

9、银增强显色

配制阿拉伯胶溶液(A)，100g阿拉伯胶溶于200mL超纯水中；配制柠檬酸缓冲液(B)，25.5g柠檬酸和23.5g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中；配制还原剂溶液(C)，0.85g氢醌溶于15mL超纯水中，避光；配制银试剂(D)，0.11g硝酸银溶于15mL超纯水，避光。分别取A液60mL，B液10mL，C液15mL，将上述三种溶液于银染前30min混合均匀。迅速加入D液15mL，混合均匀，每孔中迅速加入100μL，且避光。100s-140s后用超纯水终止反应。

10、酶标仪检测吸光度值

将酶标板置于酶标仪中，检测样品在630nm波长处的吸光度值。根据630nm处的吸光度值计算相应的鼠伤寒沙门氏菌的数量。

表1实际水样的检测

Claims

1.一种基于适配体识别的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法，其步骤为：

1)合成生物素和巯基修饰的鼠伤寒沙门氏菌适配体。

2)制备纳米金

3)制备纳米金-适配体探针

4)亲和素包被酶标板.

5)牛血清蛋白(BSA)封闭酶标板

6)每孔加入10μL浓度为10^-5M的生物素修饰的沙门氏菌适配体，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤3次，拍干。

7)每孔加入30μL的样品，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤3次，拍干。

8)每孔加入30μL的纳米金-适配体探针，37℃摇床30min。用1×PBS洗涤1次，拍干；再用0.02mol/L的PBN缓冲液(0.3mol/L NaNO₃和10mmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7)洗涤两次，每次3min，拍干，以除去微孔板中游离的纳米金探针。

9)银增强显色

10)酶标仪检测吸光度值。