CN103913446A

CN103913446A - 一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法

Info

Publication number: CN103913446A
Application number: CN201410070122.8A
Authority: CN
Inventors: 王周平; 段诺; 吴世嘉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2014-07-09

Abstract

本发明涉及一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法。利用染料AccuBlue在自身游离状态，或与单链DNA共存时只发出微弱的荧光，与双链DNA共存时会与之结合使得荧光信号显著增强的特性，加上AccuBlue不具有膜穿透性，从而不会与细胞核内的DNA发生反应，结合适配体的高亲和力和高特异性识别能力，构建了免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法。并且分别以副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌为模式分析物，设计了“signal on”和“signal off”两种检测模式。检测线性范围均为50～10⁶cfu/mL检出限分别为35和25cfu/mL。本发明用于致病菌检测具有经济、快速、灵敏、准确等优点。

Description

一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法

技术领域

本发明涉及食源性致病菌分析检测领域，尤其涉及利用适配体识别技术和免标记荧光染料检测食源性致病菌的方法。

背景技术

寡核苷酸适配体，是通过体外筛选技术-SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数富集的配体系统进化)筛选得到的一小段DNA或RNA分子，能够与相应配体发生特异性紧密结合。因适配体靶标广泛、亲和力高特异性好等优点，使其在基础研究、分析检测、临床诊断治疗与新药研发等方面均显示了广阔的应用前景。近年来，得益于适配体与靶标的高亲和力、高特异性，以及易于标记等优良属性，基于适配体的生物传感器也得到了显著的发展，诸如电化学传感器，荧光传感器，化学发光传感器等。其中，基于荧光的适配体传感器是目前最为常用的检测方法，这主要是因为该方法操作简单，灵敏度高，而且还可用于高通量分析。然而这些已有的方法都需要在适配体一端标记上荧光基团或荧光淬灭基团，或是荧光能量供体和能量受体，这样的标记工作既费时费力又消耗成本。因此，研究免标记的适配体荧光传感器检测技术显得尤为必要。

近年来，基于适配体与靶标结合后形成的空间构象可以与一些荧光染料或是聚合物特异性结合的特性构建起来的免标记适配体荧光传感器已有比较多的报道，不过具有此种特性的染料并不多，而且并不是任何一种适配体与靶标结合后都能形成与荧光染料特异性结合的构象，所以使用范围比较局限。而PicoGreen、SYBR Green等染料具有在游离或是与单链DNA共存的情况下，只发出微弱的荧光，而与双链DNA共存时，荧光强度显著增强的特性，基于此种染料构建的适配体的免标记检测技术，无需特殊的荧光染料，也无需特殊的空间构象，因而应用范围十分广泛。然而上述两种染料都具有膜穿透性，当目标物为细菌、细胞时，则会与细胞核内的DNA发生结合，从而对检测结果产生极大的干扰，因而不适合用于细菌或细胞的检测。

因此本发明利用一种新型的荧光染料AccuBlue，它不但具有在游离状态，或与单链DNA共存时只发出微弱的荧光，与双链DNA共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强的特性，而且还不具有膜穿透性，从而不会与细胞核内的DNA发生识别，结合适配体的高亲和力和高特异性识别，构建了免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法。并且分别以副溶血性弧菌和沙门氏菌为模式分析物，设计了“signal on”和“signal off”两种检测模式。实验结果表明，所构建的方法灵敏度高，特异性好。值得关注的本发明方法的原理仅基于DNA杂交，因此可广泛用于检测各类食品危害物，为保障食品安全提供了新思路，新方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加经济、快速、准确、灵敏的利用免标记荧光染料适配体传感器检测食源性致病菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为利用一种不但具有在游离状态，或与单链DNA共存时只发出微弱的荧光，与双链DNA共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强的特性，而且还不具有膜穿透性的荧光染料-AccuBlue，构建了免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法。其特征在于设计了两种检测模式，第一种为“signal on”的检测模式，首先适配体与目标菌在室温下孵育一段时间后形成适配体-目标物的复合物，接着将与适配体互补的DNA和AccuBlue染料加入到该复合物中，这样未能与目标菌结合的游离的适配体则会与互补DNA杂交形成双链DNA(dsDNA)，AccuBlue染料能够插入到dsDNA中从而引起荧光信号的显著增强。理论上，目标菌的浓度越高，体系中未能与目标菌结合的游离的适配体则越少，这样能够与互补DNA杂交形成的dsDNA也就越少，使得插入到dsDNA中的AccuBlue染料也越少，从而荧光信号就越小，据此可进行定量分析，检测原理如图1-A所示。第二种为“signal off”的检测模式，首先适配体与互补DNA杂交形成dsDNA，接着加入AccuBlue染料，AccuBlue染料与dsDNA结合从而引起荧光信号的显著增强，然后加入目标菌，目标菌会特异性与dsDNA中的适配体结合，使得互补DNA从dsDNA中脱离下来，双链结构被打开使得AccuBlue染料游离出来，进而引起荧光信号的降低。理论上，目标菌的浓度越高，被脱离下来的互补DNA也就越多，游离出来的AccuBlue染料也就越多，与双链DNA结合的AccuBlue染料越少，从而荧光信号也就越低，据此可进行定量分析，检测原理如图1-B所示。

上述的免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法中，所述的适配体由本实验室通过whole-bacteria SELEX技术筛选得到。其中与副溶血性弧菌具有高亲和力和高特异性的适配体序列为5’-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3；与鼠伤寒沙门氏菌具有高亲和力和高特异性的适配体序列为5’-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3；由生工生物工程(上海)有限公司合成。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.利用了荧光染料AccuBlue，在其游离状态，或是与单链共存的状态下，只显现出微弱的荧光，一旦与双链DNA共存，其荧光信号显著增强，并且该染料无膜穿透性，不会与细胞核内DNA结合，从而不会对实验结果产生干扰。

2.本发明方法是一种共性的检测方法，不仅可广泛用于其他致病菌的检测，还可应用于蛋白类、小分子类物质的检测。

附图说明

图1.基于适配体识别免标记荧光分析检测食源性致病菌的原理图：A是基于“signal on”的模式，B是基于“signal off”的模式。

图2.本发明方法检测不同浓度的副溶血性弧菌与荧光变化的线性曲线图(A)，不同浓度的副溶血性弧菌引起的荧光光谱图(A中插图)；本发明方法检测其他细菌的结果，其中副溶血性弧菌浓度为10⁴cfu/mL，其他细菌浓度为10⁵cfu/mL(B)；本发明方法检测不同浓度的沙门氏菌与荧光强度变化的线性曲线图(C)，不同浓度沙门氏菌引起的荧光光谱图(C中插图)；本发明方法检测其他细菌的结果，其中沙门氏菌的浓度为10⁴cfu/mL，其他细菌浓度为10⁵cfu/mL(D)。

具体实施方式

下面的实例将具体说本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例1：本发明的检测方法在检测副溶血性弧菌中的应用

先将副溶血性弧菌的适配体(5μL，10μmol/L)与150μL含不同浓度的副溶血性弧菌混合于室温下孵育45min，接着加入副溶血性弧菌适配体的互补DNA(5μL，10μmol/L)于37℃下杂交反应30min，最后加A350μL100×AccuBlue染料，避光反应3min后立即上机检测荧光信号。当体系中不存在被测物副溶血性弧菌时，副溶血性弧菌适配体与其互补链形成双链结构，与AccuBlue染料结合，此时得到的荧光强度(F₀)最大，之后随着副溶血性弧菌浓度的增大，形成的适配体/目标菌体的复合物越多，游离的适配体越少，从而适配体与互补链形成的双链DNA也就越少，在加入AccuBlue染料后引起的荧光信号就越小(F)。在最优的实验条件下，副溶血性弧菌在50～10⁶cfu/mL浓度范围内与相对荧光强度(F₀-F)呈线性相关(y=197.23x+15.688，R2=0.9956)(图2-A)，最低检出限为35cfu/mL。

实例2：本发明的检测方法在检测沙门氏菌中的应用

首先将沙门氏菌的适配体(5μL，10μmol/L)与其互补DNA(5μL，10μmol/L)混合杂交以形成dsDNA，其中快速形成dsDNA的方法为：先95℃水浴10min，再缓慢冷却到室温。接着加入350μL100×AccuBlue染料，避光反应5min后立即上机检测荧光信号，再加入150μL含不同浓度的沙门氏菌于室温下孵育45min，再次上机检测荧光信号。在没有目标菌体的条件下，适配体与互补链形成的双链DNA在AccuBlue染料的作用下呈现出明显的荧光信号(F₀)，当加入目标菌体沙门氏菌后，沙门氏菌特异性与适配体结合形成适配体/目标菌体的复合物，从而使得适配体从原先的双链DNA结构中解离下来，双链DNA的减少使得荧光强度也随之降低(F)(图2-C)，在实验选定的最佳条件下，沙门氏菌在50～10⁶cfu/mL的浓度范围内与相对荧光强度(F₀-F)呈线性关系(y=183.72x+30.79，R²=0.9957)(图2-C)，并且最低检测限为25cfu/mL。

实例3：本发明的检测方法在检测其他食源性致病菌中的应用

对于“signal on”模式的检测方法，选取了食品中常见的食源性致病菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和大肠杆菌，按照本发明方法的操作步骤对这些样品进行测定，观察荧光信号的变化。结果显示(图2-B)，由目标菌种副溶血性弧菌(10⁴cfu/mL)引起的荧光信号的改变非常显著，而其他细菌在浓度大于副溶血性弧菌10倍的情况下，也只引起了荧光强度微小的改变。该结果证明“signal on”模式基于适配体免标记荧光分析检测副溶血性弧菌的方法具有高度特异性和专一性。

同样地，对于“signal off”模式的检测方法，选取了食品中常见的食源性致病菌如副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和大肠杆菌，按照本方法的操作步骤对这些样品进行测定，观察荧光强度的变化。结果显示(图2-D)，由目标菌种沙门氏菌(10⁴cfu/mL)引起的荧光强度的改变非常显著，而其他细菌在浓度大于沙门氏菌10倍的情况下，也只引起了荧光强度微小的改变。由此可推断“signal off”模式基于适配体免标记荧光分析检测沙门氏菌的方法可用于特异性检测沙门氏菌。

实例4：本发明的检测方法在检测虾肉中副溶血性弧菌和鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌的应用

25g冷冻的新鲜虾肉绞碎，与225mL含3％NaCl(w/v)的碱性蛋白胨混合均质10min，同样的25g冷冻的新鲜鸡胸肉绞碎，与225mL PBS(pH7.4)混合均质10min，然后过滤去除大颗粒和悬浮物，取上清作为实际样品。

每个虾肉样品中注入浓度在1×10⁴～1×10⁵cfu/mL副溶血性弧菌，该浓度为平板计数法所得，然后按照“signal on”模式的检测方法对样品中副溶血性弧菌进行检测，检测结果如表1所示。

表1.“signal on”模式检测虾肉样品中副溶血性弧菌

SD：standard deviation(n=5)

每个鸡胸肉样品中注入浓度在5×10⁴～5×10⁵cfu/mL沙门氏菌，该浓度为平板计数法所得，然后按照“signal off”模式的检测方法对样品中沙门氏菌进行检测，检测结果如表2所示。

表2.“signal off”模式检测鸡肉样品中沙门氏菌

SD：standard deviation(n=5) 。

Claims

1.一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：设计了两种检测模式，第一种为“signal on”的检测模式，首先适配体与目标菌结合形成适配体-目标菌的复合物，接着加入与适配体互补的DNA和AccuBlue染料，未能与目标菌结合的游离的适配体则会与互补DNA杂交形成双链DNA，AccuBlue染料能够插入到dsDNA中从而引起荧光信号的显著增强。第二种为“signal off”的检测模式，首先适配体与互补DNA杂交形成双链DNA，接着加入AccuBlue染料，AccuBlue染料与双链DNA结合从而引起荧光信号的显著增强，然后加入目标菌，目标菌会特异性与双链DNA中的适配体结合，使得互补DNA从双链DNA中脱离下来，双链结构被打开使得AccuBlue染料游离出来，进而引起荧光信号的降低。根据荧光信号的检测实现对待测样品中副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述的染料AccuBlue，在其游离状态，或是与单链共存的状态下，只显现出微弱的荧光，一旦与双链DNA共存，其荧光信号显著增强，并且该染料无膜穿透性，不会与细胞核内DNA结合。