CN103031306B - 一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用 - Google Patents
一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选和应用。通过SELEX技术获得了能够特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子，接着利用流式细胞仪对适配子的亲和力和特异性做了分析，得出亲和力最强，特异性最好的识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子。该适配子在准确、快速、灵敏检测食品中副溶血性弧菌方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及利用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选获得一种与副溶血性弧菌高亲和力、高特异性识别的寡核苷酸适配子，以及该寡核苷酸适配子在鉴别副溶血性弧菌中的应用，属生物技术领域。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)，系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。副溶血性弧菌是一种在河、海、港口等环境中自然生长的革兰氏阴性嗜盐菌，它广泛分布于海水及多种水产品中，可引起急性胃肠炎，少数情况还能引发败血病，危及生命。副溶血性弧菌引起的食物中毒，在日本、东南亚、美国等国家及中国台北地区较为多见，在世界范围内被公认是一种重要的食源性病原菌。在我国，副溶血性弧菌所致食物中毒，在细菌性食物中毒占有重要地位。许多资料表明，副溶血性弧菌已经成为我国一个严重的食源性公共卫生问题之一。因此建立准确、灵敏、快速的副溶血性弧菌检测技术对于食品安全具有重要意义。
传统的微生物检验，往往既耗时又不灵敏；新发展起来的PCR技术，虽然能缩短检验时间，但灵敏度仍然不高；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配子(aptamer)较之抗体有诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是一种随机生物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20～40个碱基的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最终进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸配体。适配子与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美，甚至优于抗体，加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。
本发明以常见的副溶血性弧菌为目的靶细菌，利用SELEX技术获得了一条能与副溶血性弧菌高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配子，能够快速、灵敏、特异的检测到副溶血性弧菌。
发明内容
本发明目的在于提出特异识别副溶血性弧菌的一条寡核苷酸适配子的序列以及应用。
本发明优点：
1)与蛋白类抗体相比，aptamer合成周期短，成本低；aptamer更稳定；aptamer可直接体外合成、易于标记，使得操作更为简单迅速。
2)该序列是从6条均能识别副溶血性弧菌的aptamers中，选出的亲和力最强，特异性最好的一条aptamer，能高亲和力高特异性识别副溶血性弧菌。
附图说明：
图1VP1-VP6的二级结构
图2VP1-VP6解离常数
图3VP1特异性分析图
具体实施方式：
下面是通过SELEX技术筛选特异性结合副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的方法以及快速检出副溶血性弧菌的应用。
1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)
随机ssDNA文库：
5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’
构建了长度为87nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量在1014以上；引物I：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’；引物II：5’-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，将随机ssDNA文库和引物用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃保存备用。
2、BHL液体培养基培养副溶血性弧菌，37℃摇床培养至对数生长期(OD600＝0.3)，收集菌液1800g 4℃离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mMKCl，100mM NaCl，1mM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。
3、SELEX筛选获得副溶血性弧菌特异的寡核苷酸适配子
1)将ssDNA文库进行PCR扩增，扩增体系为：step 1：ssDNA5μL，引物I、II各5μL，含Mg2+的dNTP 5μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③50℃45s，④72℃1min，⑤go to②，2times，⑥72℃5min⑦end。所得PCR产物作为step 2模板，Round 2：模板1μL，引物I、II各1μL，含Mg2+的dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③50℃45s，④72℃1min，⑤go to②，30times，⑥72℃5min⑦end。所得产物即作为第一轮筛选的文库。在与菌种孵育之前，需将文库于94℃热变性8min，立即冰浴10min。第一轮筛选的投入量为2nM，第二轮至最后为100pmol。
2)将ssDNA文库，1×108细菌，tRNA和BSA，共600μL室温孵育45min，使ssDNA文库与细菌充分结合。
3)5000g 4℃离心5min弃上清，用1×BB清洗3次，分离并去除未与细菌结合的ssDNA。
4)将沉淀(即结合了ssDNA的细菌)溶于100μL 1×PCR缓冲液中，94℃热变性8min，立即冰浴10min，将结合上的ssDNA从细菌上解离下来。
5)5000g 4℃离心5min取上清，此为第一轮与细菌结合的ssDNA，将其作为模板进行PCR扩增，扩增产物用作第二轮的筛选。
扩增体系为：Round 1：ssDNA 2μL，引物II 5μL，含Mg2+的dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③55℃45s，④72℃45s，⑤go to②，2times，⑥72℃1min⑦12℃2min⑧end。所得PCR产物作为Round2模板，Round 2：模板1μL，引物I、II各1μL，含Mg2+的dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③55℃45s，④72℃45s，⑤go to②，30times，⑥72℃1min⑦12℃2min⑧end。
6)重复筛选：重复上述筛选过程，共进行9轮筛选。
7)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析
a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pUC19-T载体，转化E.coli DH5α，从90个克隆中随机挑取26个阳性克隆进行DNA序列测定(分别命名为VP1-VP26)。
b.采用DNAMAN软件对30条序列进行同源性分析，RNAstructure软件对30条序列进行高级结构分析。
c.结合软件分析结果，平均在每个家族选出1-2条结构稳定，能级较低的序列为代表，共6条序列，进行亲和力和特异性鉴定。
4、利用流式细胞仪对6条序列进行亲和力鉴定
1)将上述9条序列及原库对照送至上海生物工程有限公司合成并在5’标记FAM。
FAM-VP1：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaTAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAAGAGGCGCTAG
GAG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-VP2：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaTATTCGTAAAAAACACTGGTACTTTCGCGTAAGTCGTG
T℃tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-VP3：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaCCCGAAGGGTACGGACGTTTGCGGAGTAGTGTACCAC
AAG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-VP4：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaGCGGGCAGCTCCACCGGTAGGCTCCGAGTCATCACGG
TCG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-VP5：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaTTTTGACGAAGTCAGTGCGTCGAAGCGCAAGCATTAC
AGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-VP6：
5’-ataggagtcacgacgaccagaaGGGTAGTGTTGCTGCCCCCGTAGGCAAGGGGAATTGG
GCA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
2)利用流式细胞仪进一步筛选出副溶血性弧菌高亲和力的aptamer。
a.上述9条FAM标记的aptamer及文库分别与1×108细菌室温孵育45min，离心弃上清后，将细胞重溶于300μL 1×BB，上机检测；
b.用GraphPad Prism 5绘制非线性曲线，得出Kd。
5、利用流式细胞仪进行特异性鉴定
a.根据Kd值的结果，得出与副溶血性弧菌亲和力最强的为VP1(Kd＝15.84±0.61)。下面对这条序列做特异性分析。
b.VP1(50nM)分别与大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和化脓链球菌室温孵育45min，离心弃上清后，将细胞重悬于300μL 1×BB，上机检测；
由图3可得出结论：VP1与4种菌种结合，流式细胞仪检测的荧光强度曲线可以明显将副溶血性弧菌与大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和化脓链球菌分开，且副溶血性弧菌的荧光强度峰值右移更加明显，表明VP1可特异性识别副溶血性弧菌。
Claims (1)
1.一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子，其特征在于：所述寡核苷酸适配子的序列如序列表中序列1所示。
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| Selection,characterization,and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars;Joshi R et al.;《Mol Cell Probes》;20081118;第23卷(第1期);全文 * |
| 应用SELEX技术筛选沙门氏菌抗原的适配子;郎春燕等;《食品科学》;20110731;第32卷(第13期);全文 * |
| 郎春燕等.应用SELEX技术筛选沙门氏菌抗原的适配子.《食品科学》.2011,第32卷(第13期), |
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