CN102127592B - 快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的pcr方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法及试剂盒，通过比较确定从人工污染的婴儿配方奶粉中高效提取阪崎肠杆菌的方法并进行评价。以阪崎肠杆菌基因为靶基因进行扩增，构建目的重组质粒作为标准品进行定量，并构建内标重组质粒加到反应体系内与靶基因共同扩增，监测反应体系，排除假阴性。对荧光定量反应体系进行优化，并确定荧光定量方法和人工污染的检测限，并进行实际检测。本发明检测速度快，特异性好，使用步骤简单，可重复性高，可进一步实现双重或多重实时PCR，完成多种食源性致病菌的同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分子信标荧光定量PCR方法及其试剂盒。
背景技术
阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽胞杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属。因阪崎肠杆菌是肠道正常菌群中的一种，属条件致病菌，一直未被临床引起重视，直到1961年英国的Uremenyi和Frank两位医生首次报告了由该菌引起的两例脑膜炎病例，随后丹麦、美国、荷兰、希腊、冰岛、比利时等国家相继报道了多起新生儿阪崎肠杆菌感染事件。
在食品行业，阪崎肠杆鼠(Enterobacter Sakazakii)也是近年来受到广泛关注的食源性病原菌。2002年国际食品微生物标准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群、危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的致病菌，国家食源性疾病监测网自2007年起把阪崎肠杆菌列为婴儿配方食品重点监测病原菌。据已经报道的多起病例来看，阪崎肠杆菌对婴幼儿、老人、艾滋病人和器官移植病人等免疫力低下人群感染，总体死亡率高达80％，且愈后后遗症多为神经系统缺陷，危害极其严重。
阪崎肠杆菌的检测技术
(1)阪崎肠杆菌的常规检测技术
目前国内较为常用的培养检测方法主要有两种：一种是来自FDA的检测程序“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离与计数”，第二种方法是DFI(Druggan-Forsythe-Iversen)法。这两种方法自2002年被推荐公布以来，一直是各国沿用的阪崎肠杆菌鉴定检测的方法，缺点是时间太长，需时5天左右，所需试剂繁多。
(2)阪崎肠杆菌的分子生物学检测技术
主要是利用荧光定量PCR技术检测阪崎肠杆菌，进一步提高了阪崎肠杆菌的检测水平。但是当前阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测主要是通过SYBR Green I荧光染料和Taqman探针法来完成。其中SYBRGreen I荧光染料法是通过一种可以非特异地结合双链DNA小沟的荧光染料，它嵌合进DNA双链(dsDNA)，但不结合单链。因此在每个PCR循环结束时，检测荧光强度的变化就可以知道DNA增加的量。其优点在于不需要探针的设计，使检测方法变得简单，同时也降低了检测的成本。然而由于荧光染料能够和任何dsDNA结合，它也能与非特异的双链如引物二聚体、非特异扩增产物等结合。因此常常会使实验产生假阳性的信号。Taqman探针是一种线形的寡核苷酸，当探针完整时，荧光物质受到淬灭物质的制约，不能发出荧光，而当在PCR反应过程中，TaqDNA聚合酶将Taqman探针分解后，5`端的荧光物质便会游离出来发出荧光，通过检测反应体系中的荧光强度，则可以达到检测PCR产物扩增量的目的。Taqman探针法产生较低的荧光背景，具有较高的灵敏性和稳定性，其荧光光谱具有较高的分辨率，而且探针的保存时间较长，具有很高的可重复性以及特异性。但是由于其探针的结构为线性的，因此其特异性还有待于进一步提高。
发明内容
本发明的一个目的是建立分子信标法荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法。
本发明的另一个目的是提供阪崎肠杆菌的检测试剂盒。
本发明提供的建立分子信标法荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，包括以下几个步骤：
1、阪崎肠杆菌的培养；
2、制备阪崎肠杆菌基因组DNA；
3、构建目的重组质粒，作为标准品绘制标准曲线进行定量；
4、构建内标重组质粒，与目的基因在同一反应体系内同时扩增，监测反应体系，排除假阴性；
5、建立分子信标荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，优化反应条件；
6、对3种从婴儿配方奶粉中高效提取阪崎肠杆菌的方法进行比较；
7、确定分子信标荧光定量方法的灵敏度；
8、人工污染样品，确定检测限；
9、实际检测，确定该方法的特异性、灵敏度、符合率。
其中阪崎肠杆菌基因所包含的ompA基因的核苷酸序列为
ccgggctaaa aattcactca agaatggtgc attaattgtt tttaggataa atcctggtac 60
agatttgttc tcgcgctctg cgttagagtg attgtggcga atgaacggcc agacgggcga 120
tttcgtccgg tttcacactt tacgagtgtt taaaattgcc gcaaaaatgt taaattttgc 180
tttcgcaagt tgtttttttt catatgcctg acggacttca cacttgtaag tttccaacta 240
cgttgtagac tttacctcgc cagggtgctc atcaataaac cgacaatatc ggtagagtaa 300
ccattgagct ataaccccgg tgaaggattt aaccgtgaac ttttcctccc ggaaaagcgc 360
atggcctttt tggatgataa cgaggcgcaa aaaatgaaaa agacagctat cgcgattgca 420
gtggcactgg ctggcttcgc taccgtagcg caggccgcac cgaaagataa cacctggtat 480
gcaggcggca aactgggctg gtcccagttc cacgataccg gttttattcc taacgacggt 540
ccgactcacg aaagccagct gggcgcaggc gcgttcggtg gttaccaggt taacccgtac 600
gttggcttcg aaatgggcta cgactggctg ggccgcatgc cgtataaagg cgacactgta 660
aacggcgctt tcaaagctca gggcgtacag ctgaccgcta aactgggtta cccggtaacc 720
gacgatctgg acgtttacac ccgtctgggc ggcatggtat ggcgtgctga ttcctcttct 780
aacatcgctg gcgacgacca cgacaccggc gtttctcctg tattcgcagg cggcgttgag 840
tgggcaatga ctcgcgacat cgctacccgt ctggaatacc agtgggttaa caacatcggc 900
gacgcacaga ctgttggcgc gcgtccggac aacggcatgc tgagcgtagg tgtttcctac 960
cgtttcggtc agcaggaaga tgcagctccg gttgtagctc cggctccggc tccggctccg1020
gaagtacaga ccaagcactt caccctgaag tctgacgttc tgttcaactt caacaaagct1080
accctgaaac cggaaggcca gcaggcgctg gatcagctgt actctcagct gagcaacctg1140
gatccgaaag acggttctgt agtggttctg ggcttcaccg accgtatcgg ttctgacgct1200
tacaaccagg gtctgtctga gaaacgtgct cagtctgttg ttgactacct gatctccaaa1260
ggtatcccgt ccaacaagat ctccgcacgt ggtatgggcg aatccaaccc ggtcactggc1320
aacacctgtg acaacgtgaa agctcgtgca gctctgatcg actgcctggg tccggatcgt1380
cgcgtagaga tcgaagttaa aggcgttaaa gacgttgtaa ctcagccgca ggcttaagtt1440
atacgttaag aaaaaccccg cccaggcggg gttttttgtt tctggcgttc atgtttctgc1500
cggaataagt tcagagactg gctttgcgcc tgtcatcaac gtctgttgtg ttttcggaag1560
ggtttatcat caccgcaggc atcacatttt gccctgcaat cgctgcgcta tgctccgggc1620
aagcgtgtca gcctgacgtt ttgcggcgcc tcgcccgcgt tactctttct tacccagcag1680
tgcctgcaaa tcctgtttca gcgtcgacat atgattttca tacttctctt tacgctcggc1740
atcttcaatc agctgcacga tggtttctga aagcgtaatc ccgcgacgct gcgcaagccc1800
ggccagtcgc tgccagacca taaactccag atcgatagac tttttacggg tatgctgatg1860
ctcggcatta aaatgccgct tacgacgggc gcgaatcgtc tgtttaaggc ggttttgcag1920
cgccgggttc atatgcttct cgatccagcc cagcactctt accggttcgt tttccatacc1980
cagcaagaga tccaccgcct ctttcgctgc gctggcttcg acatagcggg ttatcagctc2040
gccttcg2047
其中内标重组质粒的标准序列为：
ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaatccggGGACAACGGCATGCTGA
其中PCR反应体系(25μL)为：10×PCR缓冲液2μL、引物对和分子信标(10μmol/L)各1μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、模板DNA 2μL、水16.8μL。
其中PCR反应条件为：94℃ 3min；94℃ 60s；60℃ 60s，；40个循环。
其中ompA基因特异性引物序列为
5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-3
5-TCAGCATGCCGTTGTCC-3
其中分子信标为：荧光信号FAM-ctgcat-CGGCGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL淬灭信号。
一种快速检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR试剂盒，其特征在于包括：
A、阪崎肠杆菌重组质粒标准品；
B、内标重组质粒；
C、含有分子信标的PCR缓冲液(包括dNTP各种PCR相关成分)；
D、含有Taq酶的储存液；
E、去离子水。
本发明建立分子信标法荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，通过比较确定从人工污染的婴儿配方奶粉中高效提取阪崎肠杆菌的方法并进行评价。以阪崎肠杆菌基因为靶基因进行扩增，构建目的重组质粒作为标准品进行定量，并构建内标重组质粒加到反应体系内与靶基因共同扩增，监测反应体系，排除假阴性。对荧光定量反应体系进行优化，并确定荧光定量方法和人工污染的检测限，并进行实际检测。
本发明的特色和创新之处：
(1)本研究率先在国内将分子信标技术用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的检测；
(2)利用内标质粒有效排除假阴性，提高检测效率；
(3)方便、快捷、高通量，对食品标本仅需1d时间，可进一步实现双重或多重实时PCR，完成多种食源性致病菌的同时检测。
(4)装配成试剂盒使用安全，特异性好，使用步骤简单，可重复性好，同时将检测时间由原来的5d缩短至1d，节省了人力物力，为企业及时的反馈产品信息，也为监管部门快速应对食品安全问题提供了有力的技术支持，产生良好的社会效益。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是PCR扩增曲线图。
图3是特异性曲线图。
具体实施方式
实验材料：
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC29544株；ATCC 51007株；ATCC 51024株；甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaschottmuelleri)；乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella pafatyphi B)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；肠炎沙门氏菌(Salmonella enreritidis)；宋内氏志贺氏菌(shigella sonnei)；痢疾志贺氏菌(Shlgella dysenteriae)；鲍氏志贺氏菌(Shlgellaboydii)；福氏志贺氏菌(Shlgella flexnei)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Enterobacteo yersinia)；普通变形杆菌(Proteus vuLgaris)；单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大肠杆菌(Eseheriehiaeoli)均购自中国普通微生物菌种保藏中心。
实施例1：
试剂盒的组成和配制
1、DNA提取液：包括以下成分10×TE(0.1M Tris-HCL，0.1M EDTApH8.8)；50ug/ul溶菌酶；1％SDS；0.2ug/ul的蛋白酶K。
2、10×PCR反应液：包括100mM KCL；1200mM Tris-HCL；1％Triton x-100；15mM MgSO4；100mM(NH4)2SO4；1mg/mL BSA；
3、标准阳性模板：标准阳性模板为含有阪崎肠杆菌保守基因ompA 265个碱基的核苷酸片段的pGEMT-easy载体构成。
4、特异性引物及分子信标：
5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-3
5-TCAGCATGCCGTTGTCC-3
荧光信号FAM-ctgcat-CGGGGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL淬灭信号。
5、内标重组质粒
标准内标对照是含有人MICA基因和阪崎肠杆菌分子信标的序列的人工合成序列构建的pUC18T重组质粒，其标准序列为：
ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaatccggGGACAACGGCATGCTGA
6、阴性质控标准品
阴性质控标准品为无菌双蒸水。
实施例2：试剂盒的敏感度试验
1、阪崎肠杆菌的培养
购买阪崎肠杆菌的标准菌株，经细菌肉汤培养过夜备用。
2、制备阪崎肠杆菌基因组DNA。
菌株经细菌肉汤培养过夜后，菌体用500ul TE buffer悬浮，加入终浓度为50ug/ul溶菌酶，37℃作用1h，然后再加入终浓度为1％SDS和0.2ug/ul的蛋白酶K，55℃作用1h后，用酚-氯仿抽提DNA。
3、PCR扩增条件：PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液2μL、引物对和分子信标(10μmol/L)各1μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、模板DNA 2μL、水16.8μL。PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 60s，60℃ 60s，40个循环；实时观察扩增曲线。见图2。
实施例3：试剂盒的特异性试验
用取自中国普通微生物菌种保藏中心的甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella schottmuelleri)；乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonellapafatyphi B)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；肠炎沙门氏菌(Salmonella enreritidis)；宋内氏志贺氏菌(shigellasonnei)；痢疾志贺氏菌(Shlgella dysenteriae)；鲍氏志贺氏菌(Shlgella boydii)；福氏志贺氏菌(Shlgella flexnei)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Enterobacteo yersinia)；普通变形杆菌(ProteusvuLgaris)；单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大肠杆菌(Eseheriehiaeoli)为对照，与阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)ATCC29544株；ATCC 51007株；ATCC 51024株的DNA，以及阳性对照质粒、内标重组质粒，各取5uL为模板，进行PCR反应。同时设阴性对照。
PCR反应条件为：PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液2μL、引物对和分子信标(10μmol/L)各1μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、模板DNA 2μL、水16.8μL。
PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 60s，60℃ 60s，40个循环。
结果只有阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC29544株、ATCC 51007株以及阳性对照和内标检测到荧光值。而甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella schottmuelleri)；乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella pafatyphi B)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；肠炎沙门氏菌(Salmonella enreritidis)；宋内氏志贺氏菌(shigella sonnei)；痢疾志贺氏菌(Shlgelladysenteriae)；鲍氏志贺氏菌(Shlgella boydii)；福氏志贺氏菌(Shlgella flexnei)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Enterobacteoyersinia)；普通变形杆菌(Proteus vuLgaris)；单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大肠杆菌(Eseheriehiaeoli)均为阴性。见图3；说明试剂盒具有良好的特异性。
以上实施例是对本发明的进一步描述，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明说做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明权利要求范围内。
序列表
ccgggctaaa aattcactca agaatggtgc attaattgtt tttaggataa atcctggtac 60
agatttgttc tcgcgctctg cgttagagtg attgtggcga atgaacggcc agacgggcga 120
tttcgtccgg tttcacactt tacgagtgtt taaaattgcc gcaaaaatgt taaattttgc 180
tttcgcaagt tgtttttttt catatgcctg acggacttca cacttgtaag tttccaacta 240
cgttgtagac tttacctcgc cagggtgctc atcaataaac cgacaatatc ggtagagtaa 300
ccattgagct ataaccccgg tgaaggattt aaccgtgaac ttttcctccc ggaaaagcgc 360
atggcctttt tggatgataa cgaggcgcaa aaaatgaaaa agacagctat cgcgattgca 420
gtggcactgg ctggcttcgc taccgtagcg caggccgcac cgaaagataa cacctggtat 480
gcaggcggca aactgggctg gtcccagttc cacgataccg gttttattcc taacgacggt 540
ccgactcacg aaagccagct gggcgcaggc gcgttcggtg gttaccaggt taacccgtac 600
gttggcttcg aaatgggcta cgactggctg ggccgcatgc cgtataaagg cgacactgta 660
aacggcgctt tcaaagctca gggcgtacag ctgaccgcta aactgggtta cccggtaacc 720
gacgatctgg acgtttacac ccgtctgggc ggcatggtat ggcgtgctga ttcctcttct 780
aacatcgctg gcgacgacca cgacaccggc gtttctcctg tattcgcagg cggcgttgag 840
tgggcaatga ctcgcgacat cgctacccgt ctggaatacc agtgggttaa caacatcggc 900
gacgcacaga ctgttggcgc gcgtccggac aacggcatgc tgagcgtagg tgtttcctac 960
cgtttcggtc agcaggaaga tgcagctccg gttgtagctc cggctccggc tccggctccg1020
gaagtacaga ccaagcactt caccctgaag tctgacgttc tgttcaactt caacaaagct1080
accctgaaac cggaaggcca gcaggcgctg gatcagctgt actctcagct gagcaacctg1140
gatccgaaag acggttctgt agtggttctg ggcttcaccg accgtatcgg ttctgacgct1200
tacaaccagg gtctgtctga gaaacgtgct cagtctgttg ttgactacct gatctccaaa1260
ggtatcccgt ccaacaagat ctccgcacgt ggtatgggcg aatccaaccc ggtcactggc1320
aacacctgtg acaacgtgaa agctcgtgca gctctgatcg actgcctggg tccggatcgt1380
cgcgtagaga tcgaagttaa aggcgttaaa gacgttgtaa ctcagccgca ggcttaagtt1440
atacgttaag aaaaaccccg cccaggcggg gttttttgtt tctggcgttc atgtttctgc1500
cggaataagt tcagagactg gctttgcgcc tgtcatcaac gtctgttgtg ttttcggaag1560
ggtttatcat caccgcaggc atcacatttt gccctgcaat cgctgcgcta tgctccgggc1620
aagcgtgtca gcctgacgtt ttgcggcgcc tcgcccgcgt tactctttct tacccagcag1680
tgcctgcaaa tcctgtttca gcgtcgacat atgattttca tacttctctt tacgctcggc1740
atcttcaatc agctgcacga tggtttctga aagcgtaatc ccgcgacgct gcgcaagccc1800
ggccagtcgc tgccagacca taaactccag atcgatagac tttttacggg tatgctgatg1860
ctcggcatta aaatgccgct tacgacgggc gcgaatcgtc tgtttaaggc ggttttgcag1920
cgccgggttc atatgcttct cgatccagcc cagcactctt accggttcgt tttccatacc1980
cagcaagaga tccaccgcct ctttcgctgc gctggcttcg acatagcggg ttatcagctc2040
gccttcg2047
Claims (6)
1.一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是包括以下几个步骤：
(1)阪崎肠杆菌的培养；
(2)制备阪崎肠杆菌基因组DNA；
(3)构建阪崎肠杆菌重组质粒，作为标准品绘制标准曲线进行定量；
(4)构建ompA内标重组质粒，与目的基因在同一反应体系内同时扩增，监测反应体系，排除假阴性；
(5)建立分子信标荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，优化反应条件；
(6)对3种从婴儿配方奶粉中高效提取阪崎肠杆菌的方法进行比较；
(7)确定分子信标荧光定量方法的灵敏度；
(8)人工污染样品，确定检测限；
(9)实际检测，确定该方法的特异性、灵敏度、符合率；
其中ompA基因特异性引物序列为
5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-3
5-TCAGCATGCCGTTGTCC-3
其中分子信标为：荧光信号FAM-ctgcat-CGGCGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL淬灭信号。
2.如权利要求1所述的快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是阪崎肠杆菌基因所包含的ompA基因的核苷酸序列为
ccgggctaaa aattcactca agaatggtgc attaattgtt tttaggataa atcctggtac 60
agatttgttc tcgcgctctg cgttagagtg attgtggcga atgaacggcc agacgggcga 120
tttcgtccgg tttcacactt tacgagtgtt taaaattgcc gcaaaaatgt taaattttgc 180
tttcgcaagt tgtttttttt catatgcctg acggacttca cacttgtaag tttccaacta 240
cgttgtagac tttacctcgc cagggtgctc atcaataaac cgacaatatc ggtagagtaa 300
ccattgagct ataaccccgg tgaaggattt aaccgtgaac ttttcctccc ggaaaagcgc 360
atggcctttt tggatgataa cgaggcgcaa aaaatgaaaa agacagctat cgcgattgca 420
gtggcactgg ctggcttcgc taccgtagcg caggccgcac cgaaagataa cacctggtat 480
gcaggcggca aactgggctg gtcccagttc cacgataccg gttttattcc taacgacggt 540
ccgactcacg aaagccagct gggcgcaggc gcgttcggtg gttaccaggt taacccgtac 600
gttggcttcg aaatgggcta cgactggctg ggccgcatgc cgtataaagg cgacactgta 660
aacggcgctt tcaaagctca gggcgtacag ctgaccgcta aactgggtta cccggtaacc 720
gacgatctgg acgtttacac ccgtctgggc ggcatggtat ggcgtgctga ttcctcttct 780
aacatcgctg gcgacgacca cgacaccggc gtttctcctg tattcgcagg cggcgttgag 840
tgggcaatga ctcgcgacat cgctacccgt ctggaatacc agtgggttaa caacatcggc 900
gacgcacaga ctgttggcgc gcgtccggac aacggcatgc tgagcgtagg tgtttcctac 960
cgtttcggtc agcaggaaga tgcagctccg gttgtagctc cggctccggc tccggctccg1020
gaagtacaga ccaagcactt caccctgaag tctgacgttc tgttcaactt caacaaagct1080
accctgaaac cggaaggcca gcaggcgctg gatcagctgt actctcagct gagcaacctg1140
gatccgaaag acggttctgt agtggttctg ggcttcaccg accgtatcgg ttctgacgct1200
tacaaccagg gtctgtctga gaaacgtgct cagtctgttg ttgactacct gatctccaaa1260
ggtatcccgt ccaacaagat ctccgcacgt ggtatgggcg aatccaaccc ggtcactggc 1320
aacacctgtg acaacgtgaa agctcgtgca gctctgatcg actgcctggg tccggatcgt1380
cgcgtagaga tcgaagttaa aggcgttaaa gacgttgtaa ctcagccgca ggcttaagtt1440
atacgttaag aaaaaccccg cccaggcggg gttttttgtt tctggcgttc atgtttctgc1500
cggaataagt tcagagactg gctttgcgcc tgtcatcaac gtctgttgtg ttttcggaag1560
ggtttatcat caccgcaggc atcacatttt gccctgcaat cgctgcgcta tgctccgggc1620
aagcgtgtca gcctgacgtt ttgcggcgcc tcgcccgcgt tactctttct tacccagcag1680
tgcctgcaaa tcctgtttca gcgtcgacat atgattttca tacttctctt tacgctcggc1740
atcttcaatc agctgcacga tggtttctga aagcgtaatc ccgcgacgct gcgcaagccc1800
ggccagtcgc tgccagacca taaactccag atcgatagac tttttacggg tatgctgatg1860
ctcggcatta aaatgccgct tacgacgggc gcgaatcgtc tgtttaaggc ggttttgcag1920
cgccgggttc atatgcttct cgatccagcc cagcactctt accggttcgt tttccatacc1980
cagcaagaga tccaccgcct ctttcgctgc gctggcttcg acatagcggg ttatcagctc2040
gccttcg2047。
3.如权利要求1所述的快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是内标重组质粒的标准序列为：
ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgc
atgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaat
ccggGGACAACGGCATGCTGA。
4.如权利要求1所述的快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是25μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μL、引物对和10μmol/L分子信标各1μL、10mmol/L dNTPs 2μL、5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL、模板DNA 2μL、水16.8μL。
5.如权利要求1所述的快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 60s；60℃60s，；40个循环。
6.一种快速检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR试剂盒，其特征在于包括：
A、阪崎肠杆菌重组质粒标准品；
B、内标重组质粒；
C、含有分子信标的PCR缓冲液；
D、含有Taq酶的储存液；
E、去离子水；
还包含一对引物，引物序列为
5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-3
5-TCAGCATGCCGTTGTCC-3
其中分子信标为：荧光信号FAM-ctgcat-CGGCGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL淬灭信号。
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