CN103497963A - 一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量pcr检测的质粒标准分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阪崎肠杆菌的质粒标准分子，该质粒标准分子的制备方法和定量方法及其应用。该质粒标准分子包含阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，该质粒标准分子的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。本发明利用紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体发射质谱（HR-ICP-MS）对该质粒标准分子进行定量，保证了其良好的溯源性。本发明的质粒标准分子解决了阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证阪崎肠杆菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为阪崎肠杆菌实时荧光PCR方法检测提供了可靠的质量控制方法。

Description

一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的制备方法、定量方法及其应用。

背景技术

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是乳制品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌。从1961年开始，世界范围内由该菌引起的新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎的病例相继被报道，阪崎肠杆菌被作为一种重要的食源性病原菌受到关注。多份研究报告已表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿及早产儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎的主要感染渠道，总体死亡率高达80%，故已引起世界多国相关部门的重视。

目前阪崎肠杆菌的检测方法分为两类,一类是传统的培养及其改进方法，依赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差;一类是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光PCR方法，主要是针对阪崎肠杆菌区别于肠杆菌科其它细菌的多个靶基因，选择特异序列，建立PCR以及实时荧光PCR方法。阪崎肠杆菌PCR相关检测方法近年来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为食源性病原微生物的可靠检测方法。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研究和应用，但是针对阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实际阪崎肠杆菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测的质粒标准分子。

实时荧光PCR检测阪崎肠杆菌的原理

采用实时荧光PCR技术可特异性扩增阪崎肠杆菌基因组中外膜蛋白基因（ompA）序列。设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子）。PCR方法中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度）。

标准物质

标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。

质粒标准分子

质粒标准分子是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，而且纯度较高；同时操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种阪崎肠杆菌的质粒标准分子，该质粒标准分子包含阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

其中所述的外膜蛋白基因（ompA）基因，编码合成外膜蛋白A，该蛋白广泛存在于原核生物的细胞外膜和真核生物的细胞器外膜中，具有为外膜提供通透性，维持外膜结构稳定的作用，所述基因序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

本发明的质粒标准分子，较佳地含有阪崎肠杆菌荧光PCR检测的靶基因外膜蛋白基因（ompA）序列，本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO：2所示。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如上所述阪崎肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气流量较佳地为10L/min～25L/min，最佳地为16.86L/min，辅助气流量较佳地为0.5L/min～3.0L/min，最佳地为0.88L/min，雾化气流量为较佳地为0.5L/min～1.5L/min，更佳地为1.123L/min，功率较佳地为1200W～1400W，最佳地为1350W。

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS）。

其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

③取适量DNA（根据仪器的需要）至比色杯中（nanodrop直接点在检测区域），记录仪器读数；

④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为ng/μL。

（2）HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线。

④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷含量。

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准物质是如上所述的质粒标准分子。

其中所述的阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法为本领域常规的实时荧光定量PCR方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：一种如上所述的阪崎肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：

①人工合成阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

②将步骤①所得阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列克隆至克隆载体上，得到阪崎肠杆菌的质粒标准分子。

步骤①所述人工合成的方法较佳地包括全基因合成该序列，或者通过PCR扩增技术获得该序列。

本发明所述质粒标准分子pXL07构建方法较佳地包括以下步骤：

①在NCBI（美国国立生物技术信息中心）的Genbank中查询阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列；

②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位点加至所选择序列的5’端和3’端。

③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子pXL07。

所述的质粒载体可以是任何常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19。

④测序验证质粒标准分子的序列。

⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。

所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒标准分子作为实时荧光PCR方法检测阪崎肠杆菌的标准物质的能力。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明利用全基因人工合成的方法构建了含有阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测靶基因外膜蛋白基因（ompA）序列的质粒标准分子，并利用紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体发射质谱（HR-ICP-MS）对其进行定量，保证了其良好的溯源性。本发明的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的优点，同时本发明解决了阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证阪崎肠杆菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为阪崎肠杆菌实时荧光PCR方法检测提供质量控制。

附图说明

图1是本发明质粒标准分子pXL07的图谱。

图2是本发明所得质粒标准分子pXL07稳定性检测结果图。

图3是用本发明质粒标准分子pXL07建立的实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1质粒标准分子的构建

实验试剂和实验仪器：

质粒大量提取试剂盒（OMEGA），其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯生化试剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。

实验方法包括以下步骤：

1、在GenBank中搜索阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，

2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点。ompA基因序列长度为1425bp，两端加上HindⅢ酶切位点。

3、将处理后的序列送至宝生物工程（大连）有限公司，由其负责进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。将所得全长基因克隆至质粒载体pUC19中，构建获得包含外膜蛋白基因（ompA）基因的质粒标准分子，将其命名为pXL07（该质粒标准分子的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示），其中第450位到第1875位为外膜蛋白基因（ompA）基因序列，所得质粒标准分子的图谱如图1所示。

4、大量培养含有包含所得pXL07的重组大肠杆菌，利用质粒大量提取试剂盒（OMEGA）提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子pXL07。经过紫外分光光度计以及电泳进行纯度分析，将质粒DNA标准分子置于-20℃保存，抽提质粒的方法包括以下步骤：

a、将100～200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上清；

b、加入12mL SolutionⅠ(含有RNase A)，振荡充分混匀；

c、加入12mL SolutionⅡ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体充分裂解；

d、加入16mL SolutionⅢ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的白色沉淀；

e、≥12000×g，4℃离心10分钟；

f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中（置于50mL收集管中），5000×g室温离心5分钟；

g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室温离心5分钟；

h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer（无水乙醇稀释）清洗吸附柱；

i、重复上述清洗步骤；

j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；

k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3mLTE缓冲液，室温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的质粒标准分子溶液，保存在-20℃。

5、测序验证质粒标准分子pXL07

将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分别为北京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍捷基（上海）贸易有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术有限公司、上海生工生物技术有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来说，序列长度与定量有直接关系，通过8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于定值的要求（详见ISO导则35，标准物质定值部分的具体要求）。

序列考察公式：序列正确率=正确碱基数目/碱基总数。

测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100%。

实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取等步骤得到高纯度的质粒标准分子pXL07，经测序验证，质粒标准分子插入片段序列与设计完全相符，其中第450位到第1875位为外膜蛋白基因（ompA）基因序列。

实施例2质粒标准分子pXL07的均匀性检验

均匀性是表征物质中一种或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通过测量取自不同包装单元（如瓶、包等）或取自同一包装单元不同位置的规定大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制（生产）过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其量值不会受到分装等因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液（pH7.5）。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

1、按照《JJG1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，从各质粒DNA标准物质中随机抽取15瓶。

2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值。

3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为：抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著性差异，则应满足下式的统计要求。

$F=\frac{\frac{Q_1}{v_1}}{\frac{Q_2}{v_2}}\≤F_{\mathrm{\α}}({\mathrm{\ν}}_1,{\mathrm{\ν}}_2)$

其中组间差方和计算公式为：

$Q_1=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{n}_i{(\stackrel{\‾}{x_i}-\stackrel{\stackrel{\‾}{\‾}}{x})}^2$

组内差方和计算见公式为：

$Q_2=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=1}{\overset{\mathrm{nj}}{\mathrm{\Σ}}}{(x_{\mathrm{ij}}-{\stackrel{\‾}{x}}_i)}^2$

ν₁＝m-1（组间自由度）

ν₂＝N-m（组内自由度）

质粒标准分子pXL07均匀性检验结果如表1所示：

表1质粒标准分子pXL07均匀性检验数据（单位：ng/μL）

样品	重复1	重复2	重复3	平均值
					1	86.8	86.2	87	86.7
2	86	86	86.2	86.1
					3	86.5	85.1	85.9	85.8
4	85.5	87	86	86.2
					5	86.3	86	86.3	86.2
6	86.1	86.4	86.3	86.3

7	85.7	86	86.6	86.1
					8	85.3	85.4	86.4	85.7
9	86.1	85.5	86.2	85.9
					10	85.5	85.5	85.6	85.5
11	85.3	86	85.9	85.7
					12	86.1	85.9	86.1	86.0
13	85.9	86.2	87.7	86.6
					14	86.3	86.1	86.3	86.2
15	85.3	85.8	85.9	85.7

表2质粒标准分子pXL07的均匀性统计结果

质粒DNA标准物质	Q1	Q2	F值	F0.05(14，30)
					pXL07	4.62	6.53	1.5	2.04

均匀性统计结果见表2，在95%置信水平下，F值小于F_0.05(14，30)，证明该质粒标准分子pXL07是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》均匀检验合格要求。

实施例3质粒标准分pXL07的稳定性考察

稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规定范围内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。稳定性良好的质粒标准分子，其特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推移而改变，检测结果不会受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液（pH7.5），实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。

1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月对制备的质粒标准分子（-20℃保存）随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法对质粒标准分子进行了跟踪考察。

2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如下：

直线斜率可用下式计算：

${\mathrm{\β}}_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；

——所有时间点的平均值；

——所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

${\mathrm{\β}}_0=\stackrel{\‾}{Y}-{\mathrm{\β}}_1\stackrel{\‾}{X}$

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

$s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(Y_i-{\mathrm{\β}}_0-{\mathrm{\β}}_1{X}_i)}^2}{n-2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；β₁，β₀——回归系数；n——测量系数。

β₁的标准偏差由下式给出：

$s\left({\mathrm{\β}}_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}$

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β₁|＜t_0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

实验结果：质粒标准分子pXL07稳定性考察结果如图2所示，具体结果请参见表3：

表3-20℃保存的质粒pXL07的稳定性监测数据（单位：ng/μL）

时间(月）	重复1	重复2	重复3	平均值	SD
						0	86.67	86.07	85.83	86.19	0.43
0.5	86.30	86.00	86.10	86.13	0.15
						1	85.60	85.50	85.30	85.47	0.15
2	85.97	83.73	86.30	85.33	1.40
						4	89.60	84.90	84.50	86.33	2.84
6	85.50	86.50	86.90	86.30	0.72

统计结果如表4所示：

表4质粒pXL07的稳定性统计结果

质粒DNA标准物质	β1	β0	s(β1)	t0.95,n-2·s(β1)
					pXL07	0.07	85.82	0.09	0.24

由统计结果可知，质粒标准分子pXL07在-20℃条件下保存6个月是稳定的。

实验例4用紫外分光光度法对质粒标准分子pXL07进行定量

实验试剂TE缓冲液（pH7.5），实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法包括以下步骤：

1、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

2、取实施例制备所得DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；

3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。

4、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果为：经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子pXL07的浓度如表5所示：

表5紫外分光光度法定值结果（单位：ng/μL）

质粒	重复1	2	3	4	5	6	7	8	平均值	SD
											pXL07	86.7	86.1	85.8	86.1	86.0	87.0	86.1	86.0	86.2	0.40

实施例5用HR-ICP-MS对质粒标准分子pXL07进行定量

实验试剂为P标准溶液（NIST美国国家标准与技术研究院，SRM3139a），实验仪器为：高分辨电感耦合等离子体发射质谱仪（Thermofisher element2）。

实验方法包括以下步骤：

1、根据质粒标准分子pXL07的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元素的含量；

2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。

3、配制梯度浓度的磷标准溶液（0、1、2、3、4、5μg/L），并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；

4、将质粒标准分子pXL07稀释2000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标准分子，并根据标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；

5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子pXL07的浓度；

6、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果：经计算，质粒标准分子pXL07的磷元素的含量为10.23%。经过HR-ICP-MS定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表6所示，稀释倍数为2000，换算得到质粒分子pXL07的质量浓度，如表7所示：

表6质粒标准分子pXL07的磷元素含量（单位：μg/L）

表7质粒标准分子pXL07的质量浓度结果（单位：ng/μL）

实施例6研制的质粒标准分子pXL07在实时荧光PCR检测中的应用

实验试剂：所用引物及探针由宝生物工程（大连）有限公司合成，MasterMix购自Life technology公司。实验仪器包括：实时荧光定量PCR扩增仪（Lifetechnology）离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。

实验中采用的引物和探针序列如序列表中SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5所示，详见表8。

表8实验中采用的引物和探针序列

质粒标准分子pXL07在实时荧光PCR检测中的应用

采用文献《A study into the occurrence of Cronobacter spp.in TheNetherlands between2001and2005》(KANDHAI M C,HEUVELINK A E,REIJM W,et al.Food Control,2010,21(8):1127-1136.)中的引物、探针、PCR检测体系及反应条件，分别以不同浓度的质粒标准分子pXL07（如2.07×10⁶copies/μL、2.07×10⁵copies/μL、2.07×10⁴copies/μL、2.07×10³copies/μL、2.07×10²copies/μL、2.07×10¹copies/μL、2.07×10⁰copies/μL）作为模板进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线。

采用所述PCR检测体系及反应条件，分别以不同浓度的质粒标准分子pXL07（如2.07×10⁶copies/μL、2.07×10⁵copies/μL、2.07×10⁴copies/μL、2.07×10³copies/μL、2.07×10²copies/μL、2.07×10¹copies/μL、2.07×10⁰copies/μL）作为标准品建立实时荧光PCR的标准曲线。建立的标准曲线见图3，相关系数达到0.995，线性良好，表明质粒标准分子pXL07适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增阪崎肠杆菌外膜蛋白基因（ompA）基因的阳性标准物质。

在实际阪崎肠杆菌检测时，可利用该线性良好的标准曲线，通过实验荧光PCR方法检测出待测样品中阪崎肠杆菌特定基因的拷贝数，并可根据阪崎肠杆菌特定基因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出阪崎肠杆菌的具体个数。由于目前针对阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空白，在实际阪崎肠杆菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准分子可以解决实时荧光PCR检测阪崎肠杆菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增阪崎肠杆菌外膜蛋白基因（ompA）基因的实时荧光PCR方法，保证检测结果的可比性，为阪崎肠杆菌实时荧光PCR方法检测提供了新的生物计量技术支持手段和方法。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种阪崎肠杆菌的质粒标准分子，其特征在于，该质粒标准分子包含阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.一种阪崎肠杆菌的质粒标准分子，其特征在于，该质粒标准分子的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1或2所述阪崎肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其特征在于，其包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

4.如权利要求3所述阪崎肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其特征在于，步骤③所述高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件为：冷却气流量为10L/min～25L/min，辅助气流量为0.5L/min～3.0L/min，雾化气流量为0.5L/min～1.5L/min，功率为1200W～1400W。

5.如权利要求3所述阪崎肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其特征在于，步骤③所述高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件为：冷却气流量为16.86L/min，辅助气流量为0.88L/min，雾化气流量为1.123L/min，功率为1350W。

6.一种阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所采用的标准物质是如权利要求1或2所述的质粒标准分子。

7.如权利要求1或2所述的质粒标准分子在阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测中的应用。

8.一种如权利要求1或2所述的阪崎肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①人工合成阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

②将步骤①所得阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因（ompA）序列克隆至克隆载体上，得到阪崎肠杆菌的质粒标准分子。

9.如权利要求8所述的阪崎肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，步骤②所述克隆载体为pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM。

10.如权利要求8所述的阪崎肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，步骤②所述克隆载体为pUC19。

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