CN105018606A

CN105018606A - 一种基于dna质量鉴定牛奶新鲜度的方法

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Publication number: CN105018606A
Application number: CN201510394427.9A
Authority: CN
Inventors: 刘永峰; 高俊岭; 库婷
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-07
Also published as: CN105018606B

Abstract

本发明公开了一种基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，具体主要依托牛奶中牛基因组DNA质量来鉴别生鲜牛奶新鲜程度的方法，该方法拟建立不同贮藏条件(冷藏2℃、10℃和室温20℃)下牛奶中DNA质量与牛奶新鲜度(乳糖、pH、酸度)的相关关系，有利于为乳品加工企业和广大消费者提供新鲜的牛奶。首次建立了牛奶中牛基因组DNA质量与牛奶中乳糖、PH、酸度的关联性，为牛奶新鲜程度的鉴别提供一种新方法，本发明针对日常家庭生活中生鲜牛奶存放的各种温度，可以依据本发明的温度结果判定牛奶新鲜度，本发明操作简单、费用低、应用前景广阔，对于牛奶的质量安全检测具有重要的意义。

Description

一种基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法

技术领域

本发明属于食品科学领域，具体涉及一种基于牛奶中牛基因组DNA质量鉴别牛奶新鲜度的方法。该方法拟建立不同贮藏条件(冷藏2℃、10℃和室温20℃)下牛奶中牛基因组DNA质量与牛奶新鲜度(乳糖、pH、酸度)的相关关系，有利于为乳品加工企业和广大消费者提供新鲜的牛奶。

背景技术

随着我国奶牛业和乳品工业的发展，牛奶和乳制品已成为人们喜爱的食品，优质的乳制品是以新鲜的原料奶为基础的，没有新鲜原料奶，就不可能生产出优质的乳制品。通常原料奶的新鲜度指标包括乳糖、pH和酸度等。正常牛奶中这些指标值基本上是恒定在一定变化范围内的。然而当牛奶品质发生变化时，这些牛奶新鲜度指标也会在某种程度上发生改变。

牛奶中乳糖、pH和酸度是评价牛乳新鲜度的重要指标。新鲜牛奶的滴定酸度为16～18°T。牛奶新鲜度变化的过程中，牛奶中的乳糖、pH和酸度均会发生变化。在牛奶新鲜度检测技术中，许多国家使用的最常用的方法仍然是传统的化学分析法。近年来，随着生鲜乳品质检测技术的日益更新，对于牛奶新鲜度的评价研究也从传统的经验判断和感官鉴别发展到经典的生化分析和现代仪器分析，甚至更深层次的分子生物学技术与其它检测方法的综合应用。从形态的表观描述发展到生物化学水平，再到分子细胞水平，对牛奶品质的机理解释也越来越深入。分子生物学技术已成为原料奶新鲜度检测和分子营养研究中的有利工具，正逐渐被应用于食品营养功能鉴定、食品可溯性、食品毒理作用等食品科学领域。

目前，国内外检测乳品中乳糖的方法有直接滴定法、酶-比色法、高效液相色谱法和莱因-埃农氏法。此外还有碘量法、蒽酮比色法、碘结合酶法、光谱法、色谱法以及高效毛细管电泳法配合紫外检测器等。酶-比色法和高效液相色谱法虽然灵敏，但费用大，难以普及；莱因-埃农氏法是我国乳糖检测的标准中推荐的化学分析法，该方法回收率良好，准确度较高，终点不易判定、操作繁琐、无法避免其他还原糖的干扰，仅适于测定原料奶和成分简单的乳制品中的乳糖含量，但与比色法相比精密度更高；比色法测定样品中的乳糖，回收率高，重现性优于莱因－埃农氏法，且操作简单，需要的样品量及试剂量较少，但有人对比色法测定乳糖进行了分析，发现该法以还原糖而非特定的乳糖为测定对象仅适用于少量多批次原料乳和成分简单的乳制品样品的测定，测定乳糖含量所用显色剂成分之一的苦味酸为危险品，且不易获得；蒽酮比色法具有简便、快速、准确、灵敏且耗样量少、回收率高的优点；高效液相色谱法操作步骤简单，可同时测定多种组分，对乳糖有良好的选择性，结果准确，但其稳定性、重复性和选择性均有一定程度的不足；碘法与酶法结合测定乳糖含量，样品回收率高，但只适于低乳糖乳制品中乳糖含量的检测；光谱法如近红外光漫反射光谱技术分析法、Elman网络与近红外光谱技术结合技术等具有快速、低成本、无需样品预处理且可同时无损测量多种成分等优点，但要建立涵盖不同浓度范围的不同模型在预测分析前，要先对未知样品光谱的适用性进行判断，以选择正确的校正模型并降低预测误差均方根，同时噪声、样品背景及仪器漂移等也会对光谱造成一定的影响，从而影响模型精度，新鲜奶中的含水量是影响近红外光谱的主要因素；高效毛细管电泳法配合紫外检测器测定乳糖，该方法具有良好的重复性、精密度和准确度，但实验结果的谱图均存在显著的系统峰，还需进一步的实验探索怎样消除系统峰，并且发现在两种样品类型的谱图中，乳糖出峰后均出现了其他峰，其具体为何种物质也有待进一步分析测定；配有脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱技术检测样品中的乳糖无需预处理、高效、快速、微量、选择性和重现性好，但乙酸钡作为淋洗液，较易生成碳酸钡沉淀，对柱子的寿命和淋洗液的稳定造成一定的影响，且所用仪器设备昂贵；直接滴定法为中华人民共和国国家标准规定乳品中乳糖含量测定方法，是牛乳中乳糖含量测定最经典的方法，准确度高。pH和酸度则分别采用pH计和碱式滴定法测定，准确度高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于，提供一种基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，该方法通过牛奶中牛基因组DNA的分离提取，测定DNA含量和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA大小，运用牛内参引物和特异性引物开展PCR扩增，综合分析判断牛奶中所提取牛基因组DNA的质量，根据牛基因组DNA含量与牛奶中乳糖、PH、酸度等新鲜度指标的关系方程，确定生鲜牛奶的新鲜程度。

为了实现上述任务，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，该方法包括进行牛奶中牛基因组DNA质量的测定，通过牛奶中牛基因组DNA的质量鉴定牛奶的新鲜度；

所述的牛奶中牛基因组DNA质量包括牛奶中牛基因组DNA含量、牛奶中牛基因组DNA纯度、牛奶中牛基因组DNA琼脂糖凝胶电泳质量和牛奶中牛基因组DNA的PCR扩增能力；

所述的牛奶新鲜度包括牛奶酸度值、牛奶pH值和牛奶乳糖含量；

所述的牛奶中牛基因组DNA的质量与牛奶酸度值呈负相关，牛奶中牛基因组DNA的质量与牛奶pH值呈正相关，牛奶中牛基因组DNA的质量与牛奶乳糖含量呈正相关。

具体的，以牛奶中牛基因组DNA含量代表牛奶中牛基因组DNA质量鉴定牛奶的新鲜度；

牛奶中牛基因组DNA的含量与牛奶酸度值呈负相关，牛奶中牛基因组DNA的含量与牛奶pH值呈正相关，牛奶中牛基因组DNA的含量与牛奶乳糖含量呈正相关。

更具体的，该方法还包括建立牛奶酸度值与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程、建立牛奶pH值与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程和建立牛奶乳糖含量与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程。

与现有技术相比，所带来的技术效果是：

(1)首次建立了牛奶中牛基因组DNA质量与牛奶中乳糖、PH、酸度的关联性，为牛奶新鲜程度的鉴别提供一种新方法；

(2)本发明针对日常家庭生活中生鲜牛奶存放的各种温度，可以依据本发明的温度结果判定牛奶新鲜度；

(3)本发明操作简单、费用低、应用前景广阔，对于牛奶的质量安全检测具有重要的意义。

附图说明

图1为冷藏条件下保存15天奶样中提取的牛基因组DNA纯度与时间关系测定结果图；

图2为10℃下贮藏7天奶样中提取的牛基因组DNA纯度与时间关系测定结果图；

图3为室温下贮藏7天奶样中提取的牛基因组DNA纯度与时间测定结果图；

图4为冷藏条件下保存15天奶样中提取的牛基因组DNA含量与时间关系测定结果图；

图5为10℃下保存7天奶样中提取的牛基因组DNA含量与时间测定结果图；

图6为室温下保存7天奶样中提取的牛基因组DNA含量与时间测定结果图；

图7为冷藏下奶样中牛基因组DNA凝胶电泳结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8、9分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中牛基因组DNA条带；

图8为10℃下奶样中牛基因组DNA凝胶电泳结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA条带；

图9为室温下奶样中牛基因组DNA凝胶电泳结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA条带；

图10为冷藏下牛奶中牛基因组DNA内参引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8、9分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增内参引物的PCR条带；

图11为冷藏下牛奶中牛基因组DNA特异性引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8、9分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增特异性引物的PCR条带；

图12为10℃下牛奶中牛基因组DNA内参引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增内参引物的PCR条带；

图13为10℃下牛奶中牛基因组DNA特异性引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增特异性引物的PCR条带；

图14为室温下牛奶中牛基因组DNA内参引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增内参引物的PCR条带；

图15为室温下牛奶中牛基因组DNA特异性引物的PCR扩增结果，M：DL2000marker；1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7天牛奶中牛基因组DNA为模板扩增特异性引物的PCR条带；

图16为冷藏下牛奶乳糖含量测定结果；

图17为10℃下牛奶乳糖含量测定结果；

图18为室温下牛奶乳糖含量测定结果；

图19为不同贮藏温度下牛奶pH测定结果；

图20为不同温度下牛奶酸度测定结果；

图21为乳糖含量与牛奶中牛基因组DNA含量的相关性结果；

图22为pH值与牛奶中牛基因组DNA含量的相关性结果；

图23为酸度值与牛奶中牛基因组DNA含量的相关性结果；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明作更详细的描述。

具体实施方式

本发明以期依托牛奶中牛基因组DNA质量鉴别牛奶新鲜度的变化情况，进而为从分子生物学角度解释牛乳新鲜度变化的的机理提供参考依据，为牛奶新鲜度变化情况的评估开辟新的途径。

本发明所述的牛奶中牛基因组DNA质量包括牛奶中牛基因组DNA含量、牛奶中牛基因组DNA纯度、牛奶中牛基因组DNA琼脂糖凝胶电泳条带质量和牛奶中牛基因组DNA的PCR扩增能力；

牛奶中牛基因组DNA琼脂糖凝胶电泳条带质量指的是琼脂糖凝胶电泳条带的亮度和大小；

牛奶中牛基因组DNA的PCR扩增能力指以牛奶中的牛基因组DNA为模板，组成PCR体系，进行PCR扩增，再通过PCR产物条带的亮度和大小判断扩增结果。

本发明所述的牛奶新鲜度是指牛奶酸度值、牛奶pH值和牛奶的乳糖含量。本发明所述的冷藏是指在温度为2℃条件下贮藏；本发明所述的室温下贮藏是指在20℃下贮藏。通过大量的实验研究发现不同贮藏条件下牛奶中牛基因组DNA含量与其纯度、琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增结果的变化规律基本一致，因此，选择具有数据的DNA含量代表DNA质量来判断其与牛奶新鲜度的关系。

实施例一：

1、试验样品来源

牛奶样本采集于陕西省西安市郊区奶牛养殖户家中的5头成年奶牛，每个样品的采取量为15mL，装入15mL的离心管中。采集后，立即置于冰盒中带回，分别置于冰箱中冷藏保存15天、10℃保存3天、室温(室温)保存2天，待用。

2、试验试剂

氯化钠、异戊醇等试剂为分析纯试剂或溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Triton-x 100、Tris-Cl、十二烷基硫酸钠、浓盐酸、蛋白酶、EDTA、Na₂-EDTA、冰乙酸均购自于西安森博生物有限公司。

磷酸缓冲液(PBS)的配置：分别称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，将各种物质溶解于800mL蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L；

OP乳化剂的配置：90％的Triton-x 10020mL，95％乙醇125mL，0.9g/LNaCl溶液855mL；

DNA提取缓冲液的配置：NaCl 1M/L，Tris-Cl 0.5M/L，EDTA-Na 0.5M/L，pH调至7.5～8.0；

20％SDS裂解液的配置：将20g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于80mL双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH7.2，定容至100mL，4℃保存备用；

蛋白酶K的配置：将20mg蛋白酶溶解于1mL无菌三蒸水，室温备用；

TE缓冲液的配置：分别称取pH为8.0的1M/L Tris-Cl 2mL和0.5M/LEDTA 0.4mL，将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200mL，调pH至8.0；

电泳缓冲液(1×TAE)的配置：称取24.2g Tris-Cl，10mL 0.5M/L的Na₂-EDTA，5.71mL的冰乙酸，充分溶解后定容至1000mL，pH调至8.0～8.4。

3、主要仪器

牛奶分析仪(保加利亚Lactoscan)、超高速低温离心机(3k30，美国Sigma公司)、低速大容量离心机(DL-4C，上海安亭科学仪器厂)、冷冻高速离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)、精密微量移液器(德国Eppendorf)、漩涡混合仪(XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、水浴锅(陕西师范大学基础实验室)、微波炉、电泳仪(DYY-4C，北京市六一仪器厂)、全自动凝胶成像分析仪(JS-680B，上海培清科技有限公司)、梯度PCR仪(BLO-RAD)、手掌型离心机(LX-100)、紫外分光光度计、万分之一分析天平、TU1810紫外可见分光光度计(北京普析公司)、三角瓶、胶头滴管、碱式滴定管、烧杯、移液管等玻璃器皿。

4、试验方法

(1)牛奶中DNA提取

将新鲜奶样，先冷藏解冻，随后室温缓慢解冻，于超高速低温(4℃)离心机中在优化转速时间下离心7500rpm、30min，用小勺刮去离心管上层的乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白去掉，留下最底部的一层的沉淀。向离心管底部加入600μL PBS，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，12000rpm低温离心10min，弃去上层液体，保留底部沉淀。再向底部沉淀加乳化剂60μL、PBS 540μL，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的乳脂，12000rpm，低温离心10min，弃上清，加PBS 500μL悬浮沉淀，于12000rpm低温离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清。向体细胞沉淀中加入350μL的DNA提取缓冲液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜。

为了准确高效地提取DNA，本研究采用SDS苯酚法提取DNA。首先，向消化产物中加等体积的Tris饱和酚溶液，离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，酚、氯仿和异戊醇按体积比为25︰24︰1配制，来回颠倒，使沉淀溶解，12000rpm，离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL的离心管，加入冰无水乙醇(-室温)沉淀，轻轻振摇，-室温，静置，12000rpm离心10min，弃去上层乙醇。底部沉淀用冰乙醇(-室温)洗涤，12000rpm，低温离心10min，小心去除上层乙醇，快速挥发乙醇，加入25μL的TE溶解DNA，室温保存备用。

(2)DNA质量检测

用紫外分光光度计检测DNA的含量和纯度。取DNA提取液5μL，用TE缓冲液稀释300倍后，在紫外分光光度计上检测其在260nm和280nm处的吸收值。则DNA含量的计算公式为

DNA(ng/μL)＝A₂₆₀×稀释倍数×50

通过计算其在A₂₆₀及A₂₈₀的吸收值的比值来获得DNA的纯度，计算公式为：A₂₆₀/A₂₈₀。每个样重复测三次。若比值小于1.8，则蛋白质含量偏高，若比值大于2.0，则RNA含量偏高。

(3)琼脂糖电泳分析

取3μL DNA样，1μL上样缓冲液，于1％琼脂凝胶，100V稳定电压下电泳30min。电泳结束后在凝胶成像分析仪紫外灯下观察。

(4)牛基因组DNA的PCR检测

第一组扩增长度为212bp的牛内参基因的引物(Primer 1)，上游引物：5’CAT CTG TCT TTC CCT GCC GC 3'，下游引物：5'CTA CAG CCT TCC TCATCT CCC CT 3'；根据NCBI中牛B2M(NM_007308)基因序列，经Primer 5软件分析设计了第二组扩增编码区的特异性引物(Primer2)，上游引物：5’GGC TTT CCC AGC ATC ACT AAC 3’，下游引物：5’TCA CAG CAC CAC CAAACT TAT CT 3’，扩增729bp的片段，用作解冻方式优化的评价指标。

用于扩增编码区片段的10μL PCR反应体系：牛奶中DNA 1μL，2×Taq Master Buffer(5mmol/L Mg²⁺)3.3μL，NTP(各2.5mmol/L)1μL，上游引物(10pmol/μL)0.3μL，下游引物(10pmol/μL)0.3μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.1μL，ddH₂O补至10μL。

PCR扩增条件：引物1的PCR反应条件为95℃，预变性5min；94℃，变性30s，60℃，退火30s，7冷藏延伸30s，30个循环；7冷藏延伸10min。引物2的PCR反应条件为95℃，预变性5min；94℃，变性30s，6冷藏，退火30s，7冷藏延伸30s，30个循环；7冷藏延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(5)牛奶中乳糖、pH和酸度检测

采用牛奶分析仪检测。

5、试验结果

(1)牛奶中牛基因组DNA的纯度结果

冷藏下奶样保存15天，应用紫外分光光度计检测牛基因组DNA纯度，结果见图1。得到的不同时间段奶样中牛基因组DNA纯度变化范围为1.69～1.99，平均值为1.92，纯度相对较高；前4天奶样的纯度值均高于1.9，第6～15天奶样的纯度值均低于1.8，总体纯度较好。

10℃下奶样贮藏7天，其纯度值结果见图2。变化范围为1.71～1.99，DNA纯度计算平均值得1.92，纯度较高；前5天奶样的纯度值均高于1.8，第6～7天奶样的纯度值均低于1.8。

室温下奶样贮藏7天，其纯度值结果见图3。变化范围为1.58～1.99，DNA纯度计算平均值得1.80，纯度较高；前4天奶样的纯度值均高于1.8，第5～7天奶样的纯度值均低于1.8。

(2)牛奶中牛基因组DNA的含量结果

冷藏下奶样保存15天，DNA含量值结果见图4。随着天数的增加，牛奶中牛基因组DNA含量在总体上呈一个缓慢下降的趋势，含量范围为30～

50ng/μL，27个牛奶样品平均含量达42ng/μL，含量与时间的关系为

Y＝48.38e^-0.0386X，R²＝0.9782

10℃下保存7天牛奶中DNA含量结果见图5。在总体上呈一个快速下降的趋势，含量范围为10～50ng/μL，24个牛奶样品平均含量达27.28ng/μL。含量与时间的关系为

Y＝55.365e^-0.2453X，R²＝0.9741

室温下牛奶中DNA含量结果见图6。在总体上呈一个指数性下降的趋势，含量值范围为2～50ng/μL，24个牛奶样品平均含量达16.91ng/μL。含量与时间的关系为

Y＝55.493e^-0.5147X，R²＝0.953

(3)牛奶中牛基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果

琼脂糖凝胶电泳分析结果见图7。冷藏条件下，电泳条带亮度随着贮藏时间的推移而逐渐减弱，前7天的DNA条带的亮度变化不明显，第1天与第15天相比则有明显的光暗对比，这一现象与DNA含量曲线图结果一致，且带型清晰一致，基本无杂带，几乎没有拖尾及弥散现象。

10℃储藏条件下，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图8。电泳条带亮度随着贮藏时间的推移而快速减弱，第4天所提牛基因组DNA的条带亮度与前3天相比明显降低，随着时间的推移，第7天所提的牛基因组DNA的条带亮度极低，这一现象与DNA含量曲线图结果一致；带型清晰一致，基本无杂带，牛基因组DNA的条带出现拖尾及弥散现象。

室温储藏条件下，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图9。电泳条带亮度随着贮藏时间的推移而极速减弱，第3天所提牛基因组DNA的条带亮度与第1天相比明显降低，第6天牛基因组DNA的条带亮度变得很低，到了第8天牛基因组DNA条带很浅且几乎不可见。

(4)牛奶中牛基因组DNA的PCR扩增结果

冷藏条件下，采用牛基因组DNA为模板，扩增长度为212bp的牛内参基因的引物(Primer 1)和长度为729bp的特异性引物(primer 2)，结果分别见图10和图11。奶样在15天内所提的牛基因组DNA均可以扩增出牛内参引物和特异性引物的基因片段；前7天的奶样中提取的牛基因组DNA的PCR条带亮度变化不大，第15天样品的PCR条带亮度与其他条带亮度相比，明显较暗，这说明第15天的奶样中牛基因组DNA的含量显著降低。这与凝胶电泳结果和DNA含量结果一致。

10℃下贮藏下，扩增牛内参基因的引物和特异性引物结果分别见图12和图13。奶样前5天提取的牛奶中牛基因组DNA均可以扩增出牛内参引物和特异性引物的基因片段且亮度变化不大；第6天的PCR条带亮度明显低于前5天，第6天和第7天的PCR条带几乎不可见，这与凝胶电泳结果和DNA含量结果一致。

室温下贮藏下，扩增牛内参基因的引物和特异性引物结果分别见图14和图15。奶样前4天提取的牛奶中牛基因组DNA均可以扩增出牛内参引物和特异性引物的基因片段且亮度变化不大；第5天，第6天和第7天的PCR条带几乎不可见，这与凝胶电泳结果和DNA含量结果一致。

(5)牛奶中乳糖含量测定结果

冷藏条件下，牛奶中乳糖含量测定结果见图16。发现乳糖含量总体上呈下降趋势，含量范围为4.42％～4.93％；第2到第7天乳糖含量有所波动。

乳糖含量与时间的关系为

Y＝-0.0017X²-0.0085X+4.9248，R²＝0.9975

10℃贮藏下，牛奶中乳糖含量测定结果见图17。随着时间的推移，奶样腐败严重，只能测定前3天的乳糖含量；乳糖含量呈下降趋势，下降速度比2℃下奶样快，乳糖含量范围为3.62％～4.96％。乳糖含量与时间的关系为

Y＝4.6886e^-0.0897X+4.6997，R²＝0.8223

室温条件下，牛奶中乳糖含量测定结果见图18。随着贮藏天数增加，室温贮藏下奶样腐败速度极快，只能测定前2天的乳糖含量；乳糖含量呈下降趋势，下降速度比2℃、10℃下奶样快，乳糖含量范围为3.53％～4.96％。乳糖含量与时间的关系为

Y＝4.8314e^-0.1476X+4.8311，R²＝0.9467

(6)牛奶pH和酸度测定结果

不同贮藏条件下牛奶pH测定结果见图19。所有奶样的pH值呈下降趋势，冷藏下贮藏奶样的pH值变化缓慢，下降趋势不明显；10℃、室温下贮藏奶样腐败速度较快，pH值下降速度较快。pH值与贮藏时间的关系方程如下，冷藏下贮藏奶样的pH值与贮藏时间的关系方程：

Y＝0.0073X²-0.18115X+6.318，R²＝0.9589

10℃下贮藏奶样的pH值与贮藏时间的关系方程：

Y＝0.0448X²-0.6571X+6.0624，R²＝0.9549

室温下贮藏奶样的pH值与贮藏时间的关系方程：

Y＝0.0884X²-0.8954X+5.8531，R²＝0.8021

不同贮藏条件下牛奶酸度测定结果见图20。所有奶样的酸度值呈上升趋势，冷藏下贮藏奶样的酸度值变化缓慢，上升趋势不明显；10℃、室温下贮藏奶样腐败速度较快，速度值上升速度较快，这一结果与pH值变化趋势一致。

酸度值与贮藏时间的关系方程如下，冷藏下贮藏奶样的酸度值与贮藏时间的关系方程：

Y＝-0.0395X²+1.1071X+14.409，R²＝0.7358

10℃下贮藏奶样的酸度值与贮藏时间的关系方程：

Y＝-0.1427X²+6.7605X+11.344，R²＝0.957

室温下贮藏奶样的酸度值与贮藏时间的关系方程：

Y＝-1.3691X²+23.146X+19.413，R²＝0.8981

根据以上结果发现，不同贮藏条件下牛奶中牛基因组DNA含量与其琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增结果的变化规律基本一致，因此，我们选择具有数据的DNA含量代表DNA质量，建立与牛奶中乳蛋白、乳脂肪的相关关系，分别见图21、图22和图23。

因为10℃、20℃下贮藏的奶样腐败速度较快、数据较少，因此本试验只分析了2℃下贮藏奶样中牛基因组DNA含量与各品质指标的相关性。

通过应用DPS处理软件分析，乳糖含量与基因组DNA含量呈极显著正相关(P＝0.0008)(图21)，线性方程为：

Y＝-0.0017X²+0.1612X+1.1418，R²＝0.9813

Y：乳糖含量；X：牛基因组DNA含量，ng/μL；

pH值与牛奶中DNA含量呈极显著正相关(P＝0.0014)(图22)，线性方程为：

Y＝-0.0063X²+0.5611X-5.7214，R²＝0.9541

Y：pH；X：牛基因组DNA含量，ng/μL；

酸度值与牛奶中DNA含量呈极显著负相关(P＝0.0031)(图23)，线性方程为：

Y＝0.0135X²-1.3233X+46.684，R²＝0.9065

Y：酸度；X：牛基因组DNA含量，ng/μL。

其他牛奶保藏温度，可根据此关系方程以及贮藏的时间，来估计其牛奶的新鲜程度。

Claims

1.一种基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，其特征在于，该方法包括进行牛奶中牛基因组DNA质量的测定，通过牛奶中牛基因组DNA的质量鉴定牛奶的新鲜度；

所述的牛奶中牛基因组DNA质量包括牛奶中牛基因组DNA含量、牛奶中牛基因组DNA纯度、牛奶中牛基因组DNA琼脂糖凝胶电泳条带质量和牛奶中牛基因组DNA的PCR扩增能力；

2.如权利要求1所述的基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，其特征在于，以牛奶中牛基因组DNA含量代表牛奶中牛基因组DNA质量鉴定牛奶的新鲜度；

3.如权利要求2所述的基于DNA质量鉴定牛奶新鲜度的方法，其特征在于，该方法还包括建立牛奶酸度值与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程、建立牛奶pH值与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程和建立牛奶乳糖含量与牛奶中牛基因组DNA含量的线性回归方程。