CN109957561A - 一种提取残留dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速、有效的从生物制品中提取残留DNA的方法，包括1)向待提取样品中加入裂解液以释放核酸分子，混合并孵育；2)向样品中加入月桂酰肌氨酸钠盐溶液；3)向样品中加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液，并在室温环境下孵育；4)将样品离心，除去上清液，收集沉淀。本发明的提取方法步骤简单，结果重复性好且提取的DNA量准确度更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速、有效的从生物制品中提取残留DNA的方法和提取DNA的新型试剂盒。
背景技术
动物细胞来源的CHO细胞株目前作为药物类蛋白生产的主要宿主细胞之一，其最终产品的杂质含量、安全性都受到严格的控制，比如连续传代宿主细胞系的残留DNA(rDNA)的含量。动物细胞研究表明，当受试体基因组与rDNA发生不正确嵌合反应，有可能会激活肿瘤基因或者使肿瘤抑制基因失活，从而给受试体的健康带来极大威胁。虽然在下游纯化工艺过程中采用一些去除方法，比如protein A亲和色谱、阴/阳离子交换色谱、疏水层析等方法可以显著去除核酸，但是最终的产品中仍残留着痕量的DNA。目前FDA严格规定其rDNA含量不得超过100pg/支，因此高效、准确的全基因组纯化方法和定量方法对药物是否能满足其要求显得非常重要。
对于生物制品中痕量(pg)级的残留DNA含量进行分析，不但要保证有效去除样品本身基质的干扰物质，并在多步提取过程中避免环境中的交叉污染，而且要保证本身提取方法的精准回收率、精密度、重复性等(中国药典2015年版第三部通则9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》技术指南)。USP<1130>介绍，在提取过程中，使用多种处理方式，如蛋白质进行酶解、化学沉淀、洗涤可以显著提高DNA的提取回收率。最初在分子生物学研究中，以苯酚-氯仿为基础的提取方法和以乙醇沉淀为基础沉淀方法，得到了广泛应用，但是其远不能满足生物工程类药物低水平残留DNA的检测。一些商业化的试剂盒(Wako PureChemical Industries,Ltd.公司的DNA Extractor Kit(Code No.295-50201)、Ivy FineChemicals Corporation公司的DNA Extractor EZ-Kit(Code No.B48202)已获得推广，其主要原理是纯化过程中DNA发生沉淀反应，高速离心后得到含DNA的白色球珠，之后仍用含乙醇的洗涤液进行进一步的纯化处理，已除去细胞代谢、脂等物质，再经过干燥、复融后即得纯化DNA液。此种方法需要操作步骤较多，且洗涤步骤容易造成DNA的损失和交叉污染，且洗涤步骤所用到的部分醇类物质仍能造成环境的污染。另外一种广泛使用的提取方法是磁珠法，如Applied Biosystems公司的PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit，提取主要过程为：使用蛋白酶K对样品进行适当的酶解处理，之后在高盐环境下向样品中加入磁珠，在异丙醇存在下、利用“盐桥作用”使DNA与磁珠表面活性基团发生特异的吸附结合，之后利用磁力架将含DNA的磁珠进行转移，之后经过一系列的洗涤移除磁珠表面残留的蛋白降解物质、多糖、细胞代谢物质等，之后用洗脱液从磁珠上面将纯化的DNA洗脱之后进行PCR定量分析(User Guide:Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System)。此种提取方法操作步骤繁琐、所需时间较长、样品通量较低，且洗涤步骤所用到的部分醇类物质也能造成环境的污染。目前针对两种方法的商业化试剂盒虽然已广泛使用，但是除了两种方法自身的技术缺点之外，对于国内公司来说，两种试剂盒都存在着货期较长、采购成本过高的不足。
目前，在样品提取过程中，为了避免回收率过低或者产生额外的污染，对未知样品进行已知浓度的DNA加标处理，然后通过加标浓度回收率的数值来评定提取方法的可靠性，目前广泛接受的标准为：标曲：决定系数(R2)≥0.980，扩增效率：90.0-110.0％，回收率为70.0％-130.0％，RSD％≤30.0％。
发明内容
本发明提供了一种提取核酸的方法，该方法包括：
步骤1、向待提取样品中加入裂解液以释放核酸分子，混合并孵育；
步骤2、向样品中加入月桂酰肌氨酸钠盐溶液；
步骤3、向样品中加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液，并在室温环境下孵育；
步骤4、将样品离心，除去上清液，收集沉淀。
在一个实施例中，步骤1向样品加入裂解液以释放核酸分子，混合并孵育的时间优选为30分钟以上。
在一个实施例中，步骤3向样品中加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液，并在室温环境下孵育的时间优选为15分钟以上。
在一个实施例中，前述提取核酸的方法还包括以下步骤：
溶解提取的核酸，进行PCR检测，计算加标回收率。
在一个实施例中，所述裂解液为包含去垢剂和蛋白酶K的混合液，其中去垢剂包含EDTA溶液和SDS溶液。
在一个具体实施例中，经步骤1混合后的溶液中EDTA终浓度为10mM以上，SDS的质量百分含量为0.1％至1％，优选SDS的质量百分含量在步骤1混合后的溶液中为0.1％。
在一个具体实施例中，经步骤3混合后的溶液中月桂酰肌氨酸钠盐的质量百分含量为0.5％以上。
在一个具体实施例中，经步骤3混合后的溶液中碘化钠的终浓度为1.6M以上，优选经步骤3混合后的溶液中碘化钠的终浓度为1.6M。
在一个实施例中，所述待提取样品是由宿主细胞生产的蛋白质，优选由CHO细胞株生产的蛋白质。
在一个具体实施例中，步骤1中所述孵育使用的温度优选为57℃。
在一个具体实施例中，步骤3中所述的室温为10℃至30℃中任一温度。
本发明还提供了一种提取核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、月桂酰肌氨酸钠盐溶液、含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液。
在一个实施例中，所述裂解液为包含去垢剂和蛋白酶K的混合液，其中去垢剂包含EDTA溶液和SDS溶液。
在一个具体实施例中，使用所述试剂盒，经步骤1混合后的溶液中EDTA终浓度为10mM以上，SDS的质量百分含量为0.1％至1％，优选SDS的质量百分含量在步骤1混合后的溶液中为0.1％。
在一个具体实施例中，使用所述试剂盒，经步骤3混合后的溶液中月桂酰肌氨酸钠盐的质量百分含量为0.5％以上。
在一个具体实施例中，使用所述试剂盒，经步骤3混合后的溶液中碘化钠的终浓度为1.6M以上，优选经步骤3混合后的溶液中碘化钠的终浓度为1.6M。
本发明中，所述试剂盒还包括样本提取装置或使用如前所述提取方法的说明书。
在一个具体实施例中所述样本提取装置为96孔板。
发明有益效果
本发明的方法和试剂盒不采用有机试剂洗涤步骤，可降低对环境的污染。林外，无需购买商业化试剂盒，解决了试剂盒采购周期长、成本高的问题。
附图说明
图1示出采用商业化试剂盒进行提取后定量的标准曲线的分析结果。
图2示出采用商业化试剂盒进行提取后定量的标准曲线的扩增曲线图。
图3示出本发明中的方法进行提取后定量的标准曲线的分析结果。
图4示出本发明中的方法进行提取后定量的标准曲线的扩增曲线图。
具体实施方式
下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。
除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
实施例1提取残留DNA的方法
1.本发明中所涉及的仪器(表1)、引物探针配置(表2)、扩增参数(表3)、仪器参数设置(表4)、试剂信息(表5)如下：
表1.仪器信息
| 序号 | 仪器名称 | 生产厂家/型号 |
| 1 | PCR仪 | Applied Biosystems/7500，7500 Fast |
| 2 | 漩涡混匀器 | IKA/MS3 Digital |
| 3 | 恒温混匀仪 | Eppendorf/5355 |
| 4 | 离心机 | Eppendorf/5810R |
表2.引物/探针混合液配制
| 试剂 | 体积 |
| 100μM正向引物 | 36μL |
| 100μM反向引物 | 36μL |
| 100μM探针 | 10μL |
| 无核酸酶水 | 118μL |
表3.扩增参数
表4.部分仪器参数设置(PCR仪器)
| CHO DNA | 荧光报告基团：FAM | 淬灭：无 |
| IPC | 荧光报告基团：VIC | 淬灭：无 |
表5.试剂信息
本实验以10mg/mL BSA溶液作为典型的蛋白基质样品，并配置不同浓度DNA加标质控品。将标准品、样品、加标样品同时进行提取，之后进行real-time qPCR分析。详细实施过程如下：
去垢剂配制：0.5mol/L EDTA溶液：20％SDS溶液：525mmol/L Tris-HCl溶液(v:v:v)＝13:3:4；
NaI溶液配制：1g NaI固体溶于100μL 0.5mol/L EDTA溶液，100μL 1mol/L Tris-HCl溶液，800μL无核酸酶水中。
上述所述溶液的配制可根据实际用量进行适当调整。
2.使用10mmol/L Tris缓冲液对DNA标准品进行梯度稀释，制备1、10、100、1000、10000、100000pg/mL的标准品溶液STD(表6)，并配置相应的加标质控品。
表6.标准品配置
| 编号 | 10mM Tris缓冲液 | DNA(μL)Standard | 浓度(pg/mL) |
| STD1 | 1960 | 20(9.9μg/mL) | 100000 |
| STD2 | 1800 | 200(STD1) | 10000 |
| STD3 | 1800 | 200(STD2) | 1000 |
| STD4 | 1800 | 200(STD3) | 100 |
| STD5 | 1800 | 200(STD4) | 10 |
| STD6 | 1800 | 200(STD5) | 1 |
表7.
| 样品类型 | 加标标准品浓度 | 加标标准品体积 | 理论DNA加标量 |
| 加标样品 | STD3:1000pg/mL | 40μL | 40pg |
注：加标浓度可以根据测试的目的和实验条件进行调整。
3.样品DNA抽提前，将恒温混匀仪温度设定为57℃。
4.DNA标准品的样品制备
使用96孔深孔板，向设定为标准品的对应孔中各加入400μL不同浓度的DNA标准品，之后向各标准品孔中加入40μL 100mg/mL BSA溶液。
5.过程空白样品制备(监控来自试剂和实验操作过程的污染，NEG)
使用96孔深孔板，向设定为过程空白样品孔中加入400μL 10mM Tris缓冲液，之后加入40μL 100mg/mL BSA。
6.加标样品的制备
使用96孔深孔板，向设定为加标样品的孔中加入400μL BSA样品，之后加入40μL相应的STD。
分别制备1、3、10、100、1000pg/mL水平的加标样品。
7.样品的制备
向设定为样品的孔中加入400μL BSA样品，之后加入40μL 10mM Tris缓冲液。
8.蛋白酶K酶解
按照表8配制Tris/去垢剂/蛋白酶K混合液：
表8.Tris/去垢剂/蛋白酶K混合液
| 提取孔数 | 2M Tris缓冲液 | 去垢剂 | 蛋白酶K(20mg/mL) |
| N | 20×NμL | 20×NμL | 10×NμL |
向96孔深孔板中，加入40μL上述混合液。用封板模封好96孔板，将其置于恒温混匀仪上，1000rpm，57℃温育40至60分钟。
9.向各孔中加入40μL月桂酰肌氨酸钠盐。
10.按下表制备足够的碘化钠/糖原/异丙醇混合液，混合液放在冰面上至少5分钟。
表9.碘化钠/糖原/异丙醇混合液
| 提取孔数 | NaI溶液 | 糖原(15mg/mL) | 异丙醇 |
| N | 0.4×(3+N)mL | 4×(3+N)μL | 0.74×(3+N)mL |
向96孔深孔板中加入1.1mL碘化钠/糖原/异丙醇混合液，并用96孔板封板垫封好。混匀后室温(10-30℃)放置20±2分钟。
将96孔深孔板放入离心机内，2700g，离心20分钟，收集沉淀。
11.离心后，取出封板垫，颠倒96孔板去除上清液，将96孔板放在吸水纸上静止7±1分钟，期间更换几次新的吸水纸，尽快地吸除96孔板中的上清液。
12.将96孔深孔板正面朝上，置于恒温混匀仪中。设置55℃，3分钟以除去多余的异丙醇。
13.向96孔深孔板中加入400μL无核酸酶水NFW，用封板垫封好，置于恒温混匀仪中。1100rpm，25℃温育4分钟以溶解提取的DNA。可以上述已提取样品在-20℃保存，一周内完成测试。
14.制备引物/探针混合液
表10
| 试剂 | 体积 |
| 100μM正向引物 | 36μL |
| 100μM反向引物 | 36μL |
| 100μM探针 | 10μL |
| NFW | 118μL |
15.定量PCR
根据下表，制备足够的PCR试剂/引物/探针：
表11
| 提取孔数 | 2×PCR Master Mix | 20×引物/探针 |
| N | 20×N μL | 2×N μL |
用移液器向96孔PCR板中每孔加入16.5μL已配置好的PCR Master Mix/primer/probe混合液。用移液器每孔加入13.5μL DNA提取液。用96孔封板膜封板，将96孔PCR板置于恒温混匀仪上，800rpm振荡30秒。将其置于离心机内4000rpm，离心2分钟，放入PCR仪器内，按照提前设置的程序进行PCR反应。
16.计算公式：
RSD％＝Quantity SD/Quantity Mean×100％
表12
备注：10mg/mL BSA溶液样品的本底值皆为“未检测到”，以零带入计算公式。
结论：以10mg/mL的BSA溶液作为样品，用本发明所述的方法进行提取和定量检测，其结果显示：实验确定了在3pg/mL-1000pg/mL范围内的专属性、精密度及准确度。本方法显示出可以用于提取宿主细胞残留DNA的合理性。
实施例2两种不同来源的试剂和提取方法的比较
具体实验步骤参见实施例1所述。
图1和图2分别采用商业化试剂盒进行提取后定量的标准曲线的分析结果和扩增曲线图。图3和图4分别为按照本发明所说方法进行提取后定量的标准曲线的分析结果和扩增曲线图。
参数列表对比：
表13
| 参数 | 商业化试剂盒处理结果 | 本专利配制试剂处理结果 |
| R<sup>2</sup> | 0.999 | 1 |
| 扩增效率％ | 99.453 | 98.545 |
结果分析：两种不同来源的试剂和提取方法，所得结果的系统适应性都可以满足系统接受标准。
实施例3各试剂组分的配比优化实验
1.各试剂组分的配比确定实验：
1.1实验过程描述：
以10mg/mL的BSA为典型的蛋白质样品，向其加入100pg/mL的CHO DNA标准品，经提取后进行PCR数据分析。且用商业化试剂盒(Ivy Fine Chemicals Corporation公司的DNAExtractor EZ-Kit(Code No.B48202)作为比对试验。主要过程如下：
1)样品DNA抽提前，将恒温混匀仪温度设定为57℃。
2)使用96孔深孔板，向设定为标准品的对应孔中各加入400μL不同浓度的DNA标准品，之后向各标准品孔中加入40μL 100mg/mL BSA。每一浓度标准品制备两个复孔。
3)向设定为非加标样品和加标样品的孔中各加入400μL BSA样品，之后向非加标样品孔中加入40μL 10mM tris缓冲液，向加标样品的孔中加入40μL STD3标准液。每个样品制备两个复孔。
4)按照下表配制Tris/去垢剂/蛋白酶K混合液。
表14
| 提取孔数 | 2M Tris缓冲液 | 去垢剂 | 蛋白酶K(20mg/mL) |
| 1 | 20μL | 20μL | 10μL |
| 2 | 40μL | 40μL | 20μL |
| 3 | 60μL | 60μL | 30μL |
| N | 20×N μL | 20×N μL | 10×NμL |
N：为提取孔的数量
向96孔深孔板中，加入40μL上述混合液。用ABI封板模封好96孔板，将其置于恒温混匀仪上，1000rpm，57℃温育40至60分钟。
5)按下表制备足够的碘化钠/糖原/异丙醇混合液，混合液放在冰面上至少5分钟。
表15
| 提取孔数 | NaI溶液 | 糖原(15mg/mL) | 异丙醇 |
| 1 | 1.6mL | 16μL | 3.0mL |
| 2 | 2mL | 20μL | 3.7mL |
| 3 | 2.4mL | 24μL | 4.4mL |
| N | 0.4×(3+N)mL | 4×(3+N)μL | 0.74×(3+N)mL |
N：为提取孔的数量
向96孔深孔板中加入1.1mL碘化钠/糖原/异丙醇混合液，并用96孔板封板垫封好。混匀后室温(10-30℃)放置20±2分钟
6)将96孔深孔板放入离心机内，2700g，离心20分钟，收集沉淀。
7)离心后，取出封板垫，颠倒96孔板去除上清液，将96孔板放在吸水纸上静止7±1分钟，期间更换几次新的吸水纸，尽快地吸除96孔板中的上清液。
8)将96孔深孔板正面朝上，置于恒温混匀仪中。设置55℃，3分钟以除去多余的异丙醇。
9)向96孔深孔板中加入400μL NFW，用封板垫封好，置于恒温混匀仪中。1100rpm，25℃温育4分钟以溶解提取的DNA。
10)溶解后的DNA液体，进行实时荧光定量PCR分析。
1.2去垢剂溶液的配制(Detergent Solution)
采取单因素变量设计方法，本次实验除去垢剂需要按照以下条件配置外，其它试剂、操作步骤皆未改变。不同浓度去垢剂所得到的提取结果如下：
表16
结果分析：根据以上条件配制四种不同浓度的去垢剂，经回收率和RSD考察，皆在接受范围之内。根据实验室基本情况，最终确认溶液组分为：0.5mol/L EDTA溶液：20％SDS溶液：525mmol/L Tris-HCl溶液(v:v:v)＝13:3:4，并用于以下实验的考察。即去垢剂中SDS含量优选为3％，Tris/去垢剂/蛋白酶K混合液中SDS的含量优选为1.2％，将Tris/去垢剂/蛋白酶K混合液加入样品溶液后，SDS的终浓度优选为0.1％。
1.3 NaI溶液的配制(NAI Solution)
采取单因素变量设计方法，本次实验除NAI溶液需要按照以下条件配置外，其它试剂、操作步骤皆参照1.2中结果分析进行操作。不同浓度NAI溶液所得到的提取结果如下：
表17
结果分析：四种不同浓度的NAI溶液，经回收率和RSD考察，其结果较优的组分为NAI-2溶液，但是仍不能满足接受标准。因此将NAI-2溶液用于以下实验的考察。在这个步骤之前，未加入N-月桂酰肌氨酸钠盐。碘化钠溶液中优选其浓度为1g/mL，在碘化钠/糖原/异丙醇混合液中碘化钠的浓度为0.35g/mL。按照1.1中步骤5)中所述，在0.48mL的溶液中加入1.1mL的碘化钠/糖原/异丙醇混合液后，碘化钠终浓度为1.62M。
1.4 N-月桂酰肌氨酸钠盐的用量
本次实验除NAI溶液需要按照以下条件配置外，其它试剂、操作步骤皆参照结论1.3中结果分析进行操作，且此溶液是在1.1.4步骤结束后加入，且混匀后，在进行1.1.5步骤操作。不同浓度NAI溶液所得到的提取结果如下：
表18
结果分析：用N-1至N-6溶液所处理结果皆在可接受的范围之内，综合回收率和RSD％的结果，最终确认N-5溶液，且用于以下实验的对比分析。
2.本发明方法缩减步骤的考察
本实验仍以10mg/mL的BSA为典型的蛋白质样品，向其加入100pg/mL的CHO DNA标准品，每次试验制备六个平行。测试1：用1.4中所确认的试剂组分和方法对样品进行提取处理；测试2：用商业化试剂盒(Ivy Fine Chemicals Corporation公司的DNA Extractor EZ-Kit(Code No.B48202))和说明书方法对样品进行提取处理。为避免操作误差，测试1和测试2中的共用试剂组分来自同一批号。数据如下：
表19
结果分析：与100％的理论回收率相比，使用本发明方法所得到的结果相差的绝对值为6.2％，商业化试剂盒所得到的结果相差的绝对值为11.5％；说明本发明方法所得到的结果更能接近真实值。且本发明方法的的％RSD值为9.0％，小于商业化试剂盒的13.4％，说明本发明方法具有更优的重复性。
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
Claims (16)
1.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括：
步骤1、向待提取样品中加入裂解液以释放核酸分子，混合并孵育；
步骤2、向样品中加入月桂酰肌氨酸钠盐溶液；
步骤3、向样品中加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液，并在室温环境下孵育；
步骤4、将样品离心，除去上清液，收集沉淀。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
溶解提取的核酸，进行PCR检测，计算加标回收率。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述裂解液为包含去垢剂和蛋白酶K的混合液，其中去垢剂包含EDTA溶液和SDS溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，经步骤1混合后的溶液中EDTA终浓度为10mM以上，SDS的质量百分含量为0.1％至1％。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，经步骤3混合后的溶液中月桂酰肌氨酸钠盐的质量百分含量为0.5％以上。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，经步骤3混合后的溶液中碘化钠的终浓度为大于1.6M。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待提取样品是由宿主细胞生产的蛋白质，优选由CHO细胞株生产的蛋白质。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1中所述孵育使用的温度为57℃。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的室温为10℃至30℃中任一温度。
10.一种提取核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、月桂酰肌氨酸钠盐溶液、含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液为包含去垢剂和蛋白酶K的混合液，其中去垢剂包含EDTA溶液和SDS溶液。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，在向样品加入裂解液后，SDS的质量百分含量为0.1％至1％。
13.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，在加入月桂酰肌氨酸钠盐混后的溶液和含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液混合后的溶液后，所述月桂酰肌氨酸钠盐的质量百分含量为0.5％以上。
14.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，经加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液混合后的溶液中，碘化钠的终浓度为1.62M。
15.如权利要求10至14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本提取装置或使用如权利要求1只9任一项所述方法的说明书。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述样本提取装置为96孔板。
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