CN112553308A - 药物样品的残留dna的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种药物样品的残留DNA的检测方法，所述药物为蛋白药物、细胞治疗药物或基因治疗药物，该方法包括：(1)将药物样品在蛋白酶K存在的条件下进行消化处理，所述消化处理是在TE缓冲液中进行的；(2)将消化处理产物进行灭活处理；(3)将步骤(2)的灭活处理后体系在预定的PCR反应体系中进行Q‑PCR扩增，以便获得样品残留DNA的含量。相比于现有的检测蛋白药物或细胞治疗药物或基因治疗药物DNA残留的方法，本申请的准确度得到显著提高。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及药物样品的残留DNA的检测方法。
背景技术
宿主DNA残留是重组蛋白药物、细胞治疗药物和基因治疗药物的质量控制项目之一，DNA残留限度多为10ng/剂量。美国药典(USP40-NF35)通则中推荐使用荧光定量PCR(简称Q-PCR)作为生物制品中宿主DNA残留的检测方法。但Q-PCR法所面临的一个挑战是受样品基质干扰而影响其检测准确性，有效去除样品基质干扰是Q-PCR定量成败的关键。目前Q-PCR法去除基质干扰的方法是先将样品中微量的DNA提取出来，然后进行Q-PCR扩增检测。这种样品处理方式存在以下缺陷：A.提取效率不高，特别对微量的DNA残留的样品，提取法存在较为严重的DNA损失，因而检测准确度不高。B.提取法检测成本高昂，如市面上微量核酸提取试剂盒价格一般数千元。C.提取法操作繁琐复杂，效率低。
因此，重组蛋白药物、细胞治疗药物和基因治疗药物中残留DNA的检测方法仍迫切需要开发和改进，以满足重组蛋白药物、细胞治疗药物和基因治疗药物质量监控的需求。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请的发明人发现，将待检测的蛋白药物或细胞治疗药物或基因治疗药物在蛋白酶K的作用下进行消化处理后，进而进行Q-PCR法检测，回收率介于70％-130％之间，大大提高了重组蛋白药物、细胞治疗药物和基因治疗药物中残留DNA检测的准确度。且该方法相对于现有技术，检测方法成本低廉、操作简单、检测效率高，更加适于工业应用。
第一方面，本发明提出了一种药物样品的残留DNA的检测方法。根据本发明的实施例，所述药物为蛋白药物、细胞治疗药物或基因治疗药物，所述方法包括：(1)将药物样品在蛋白酶K存在的条件下进行消化处理，所述消化处理是在TE缓冲液中进行的；(2)将消化处理产物进行灭活处理；(3)将步骤(2)的灭活处理后体系在预定的PCR反应体系中进行Q-PCR扩增，以便获得样品残留DNA的含量。发明人在方法开发过程中，尝试采用了多种蛋白酶或蛋白酶的组合进行药物样品的消化，以排除对后续Q-PCR的干扰，但发明人发现，只有在蛋白酶K的消化作用下，回收率才能得到显著提高，才能满足蛋白药物或细胞治疗药物或基因治疗药物的质量监控的需求。同时，发明人发现，相比于现有的检测蛋白药物或细胞治疗药物或基因治疗药物DNA残留的方法，本申请的准确度及检测效率得到显著提高。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述蛋白酶K在消化体系中的浓度不低于0.1‰。发明人发现，所述蛋白酶K在消化体系中的浓度不低于0.1‰，既可以彻底消化组蛋白，释放DNA，又可以排除Q-PCR的干扰。蛋白酶K在消化体系中的浓度不低于0.1‰可进一步提高了残留DNA含量检测的准确性。
根据本发明的实施例，所述消化是在pH为7.0-12.0、温度为55-70℃的条件下进行不低于2小时。发明人发现，消化反应在上述条件下进行，反应条件温和，消化反应彻底，样品中残留DNA释放完全，可进一步提高残留DNA含量检测的准确性。
根据本发明的实施例，所述灭活处理是在温度为90～98℃的条件下进行25～35min。如可在95℃的条件下进行30min。
根据本发明的实施例，所述药物为蛋白药物，所述药物在消化体系中的浓度为0.5mg/mL～2.0mg/mL，优选，0.7mg/mL～1.8mg/mL。
根据本发明的实施例，所述药物为基因治疗药物，所述药物在消化体系中的浓度为5×107pfu/mL～1.5×1010pfu/mL，在本发明的某些实施例中，所述药物在消化体系中的浓度为5×107pfu/mL～1.5×108pfu/mL。
本发明所述的基因治疗药物包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、慢病毒药物。
第二方面，本发明提出了一种本发明所述的检测方法在检测药物样品中残留DNA含量的应用。
根据本发明实施例的药物样品的残留DNA的检测方法，能有效去除样品基质对Q-PCR检测的影响，避免了DNA提取过程中的损失，具有简单快速、检测准确度高、成本低等优点。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1不同样品的处理过程
利拉鲁肽样品处理
供试品溶液：取利拉鲁肽27mg，精密称定，置于15mL容量瓶中，加入TE缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
供试品模板溶液：取供试品溶液99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h；95℃，灭活30min。
重组人胰岛素样品处理
供试品溶液：取重组人胰岛素14mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加入TE缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
供试品模板溶液：供试品溶液99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，摇匀，然后放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，2h；95℃，30min。
门冬胰岛素样品处理
供试品溶液：取本品约35mg，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入TE缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
供试品模板溶液：取供试品溶液99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h；95℃，灭活30min。
甘精胰岛素样品处理
供试品溶液：取甘精胰岛素约36.4mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入TE缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
供试品模板溶液：取供试品溶液199μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化2h；95℃，灭活30min。
慢病毒样品处理
供试品溶液：用PBS将慢病毒配制成约5×107pfu/mL。
供试品模板溶液：取供试品溶液99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化5h；95℃，灭活30min。
单纯疱疹病毒样品处理
供试品溶液：用PBS将单纯疱疹病毒配制成约1.5×108pfu/mL。
供试品模板溶液：取供试品溶液99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化5h；95℃，灭活30min。
以下实施例以实施例1所制备的单纯疱疹病毒样品考察消化温度、蛋白酶K用量以及消化时间，以及以利拉鲁肽样品考察TE缓冲液pH对最终检测结果的影响。
实施例2 TE缓冲液pH范围考察：6.0-7.0-9.5-10-12.0
1)溶液配制
氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4.0001g溶于100mL超纯水中，混合均匀。
20×TE缓冲液：称取Tris 6.0549g，EDTA-2Na 1.8615g溶于250mL超纯水中，混合均匀。
蛋白酶K溶液(1.5％W/V)：称取蛋白酶K 30.96mg溶于2mL超纯水中，混合均匀。
前引物溶液F(10μM)：取前引物冻干管，10000rpm离心1min，加入超纯水500μL，混合均匀，分装后于-20℃保存；根据大肠杆菌基因组DNA设计的特异性引物。
后引物溶液R(10μM)：取后引物冻干管，10000rpm离心1min，加入超纯水410μL，混合均匀，分装后于-20℃保存；根据大肠杆菌基因组DNA设计的特异性引物。
探针溶液(5μM)：取探针冻干管，10000rpm离心1min，加入超纯水760μL，混合均匀，分装后于-20℃保存；根据大肠杆菌基因组DNA设计的特异性探针。
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，平均分装到5个10mL的EP管中，编号为T1，T2，T3,T4,T5号，用氢氧化钠溶液依次将上述TE缓冲液分别调pH至6.0,7.0，9.5，10.0,12.0，混合均匀，即得相应pH值下的空白溶液。
供试品溶液：取利拉鲁肽27.01mg，精密称定，置于15mL容量瓶中，加入空白溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液，将供试品溶液平均分装到五个10mL的EP管中，每管3mL，分别编号S1，S2，S3，S4，S5。用氢氧化钠溶液依次将上述溶液分别调pH至6.0，7.0，9.5，11.0，12.0，混合均匀。
供试品模板溶液：分别取供试品溶液(S1，S2，S3,S4,S5)99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h；95℃，灭活30min，所得溶液即可作为Q-PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
阴性模板溶液：分别取空白溶液(T1，T2，T3,T4,T5)99μL于干净EP管中，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h；95℃，灭活30min，所得溶液即可作为Q-PCR的阴性模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：吸取重组大肠杆菌基因组标准DNA 2μL，加入空白溶液适量配制成10ng/μL的DNA标准溶液，分别取空白溶液(T1，T2，T3，T4,T5)将10ng/μL的DNA标准溶液逐级稀释成1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL系列标准溶液。
10pg/μL准确度溶液：分别取供试品溶液(S1，S2，S3，S4，S5)98μL于干净EP管中，上述DNA标准溶液(1ng/μL，pH值6.0，7.0，9.5，11.0,12.0)各1μL，蛋白酶K溶液1μL，加到对应pH值的EP管中，混合均匀后，取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h；95℃，灭活30min(4℃保存)。
2)定量PCR体系如表1所示。
表1：
注：体系中不可有气泡，如有，需将气泡去除，然后6000rpm离心1min。
3)定量PCR扩增程序如表2所示。
表2：
Lid temperature:105℃
4)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液和10pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
5)计算
回收率计算公式：
C2＝C1-Cs
其中，
C1为准确度溶液DNA测得值，pg/μL
CS为供试品模板溶液DNA测得值，pg/μL
C2为准确度溶液加标DNA测得值，pg/μL
CL为准确度溶液加标理论值，pg/μL
可接受标准：标准曲线线性相关系数R≥0.99，扩增效率介于90％-105％，回收率应在70.0％-130.0％之间。
6)结果如表3所示。
表3：
结论：在pH7.0到pH12.0范围内各实验组的平均回收率介于70.0％-130.0％之间，符合可接受标准，说明当TE缓冲液的pH值的范围为7.0-12.0时，用该Q-PCR方法检测宿主DNA残留都是可行的。另，pH6时的实验组回收率不合格，不适宜用该方法检测。
实施例3消化温度考察：30-40-55-60-70℃
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为8.8，混合均匀即得。
阴性模板溶液：取5个干净的EP管，编号为B1,B2,B3,B4,B5号，向各管中加入空白溶液99μL，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：B1号管消化温度为30℃，B2号管消化温度为40℃，B3号管消化温度为55℃，B4号管消化温度为60℃,B5号管消化温度为70℃。消化4h后，95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：将单纯疱疹病毒样品溶液于90℃水浴中灭活10min后,再用900μL 1×TE缓冲液与100μL单纯疱疹病毒样品混合均匀，得到的单纯疱疹病毒样品10倍稀释液，即为供试品溶液。
供试品模板溶液：取5个干净的EP管，编号为S1,S2,S3,S4,S5号，向各管中加入供试品溶液99μL，1.5％的蛋白酶K溶液1μL，各取50μL然后放入PCR仪中按下列程序进行处理：S1-S5号管消化温度分别为30℃，40℃，55℃，60℃，70℃，均消化4h；95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：吸取vero细胞基因组标准DNA 2.76μL(565ng/μL)，加入空白溶液17.24μL混合均匀，即得78ng/μL的DNA标准溶液，然后分别取10μL DNA标准溶液加入90μL的1×TE溶液，逐级稀释成7.8ng/μL、780pg/μL、78pg/μL、7.8pg/μL、0.78pg/μL系列标准溶液。
7.8pg/μL准确度溶液：取5个干净的EP管，编号为S1+7.8pg/μL、S2+7.8pg/μL、S3+7.8pg/μL、S4+7.8pg/μL、S5+7.8pg/μL号,分别向各管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：S1+7.8pg/μL号管消化温度为30℃，S2+7.8pg/μL号管消化温度为40℃，S3+7.8pg/μL号管消化温度为55℃，S4+7.8pg/μL号管消化温度为60℃、S5+7.8pg/μL号管消化温度为70℃均消化4h；95℃，灭活30min；
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液和7.8pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果如表4所示。
表4：
结论：55℃-70℃范围内，各实验组的平均回收率介于70.0％-130.0％之间，符合可接受标准，说明当消化温度范围为55℃-70℃时，用该Q-PCR方法检测宿主DNA残留都是可行的。而40℃及以下，样品消化不完全，存在基质干扰导致检测方法准确度较低。
实施例4蛋白酶K用量考察：0.05‰-0.1‰-0.2‰-0.4‰。
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为8.8，混合均匀即得。
阴性模板溶液：取4个干净的EP管，编号为B1、B2、B3、B4号，向B1管中分别加入空白溶液99μL，0.5％的蛋白酶K溶液1μL，向B2管中分别加入空白溶液98μL，0.5％的蛋白酶K溶液2μL，向B3管中加入空白溶液99μL，2％的蛋白酶K溶液1μL，向B4管中加入空白溶液98μL，2％的蛋白酶K溶液2μL，混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：参照“实施例3”项下“供试品溶液”
供试品模板溶液：取4个干净的EP管，编号为S1、S2、S3、S4号，向S1管中分别加入供试品溶液99μL，0.5％的蛋白酶K溶液1μL；向S2管中分别加入供试品溶液98μL，0.5％的蛋白酶K溶液2μL；向S3管中加入供试品溶液99μL，2％的蛋白酶K溶液1μL；向S4管中加入供试品溶液98μL，2％的蛋白酶K溶液2μL，分别混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：参照“实施例3”项下“DNA标准溶液”。
7.8pg/μL准确度溶液：取4个干净的EP管，编号为S1+7.8pg/μL、S2+7.8pg/μL、S3+7.8pg/μL、S4+7.8pg/μL号,向S1+7.8pg/μL管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，0.5％的蛋白酶K溶液1μL；向S2+7.8pg/μL管中加入供试品溶液97μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，0.5％的蛋白酶K溶液2μL；向S3+7.8pg/μL管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，2％的蛋白酶K溶液1μL；向S4+7.8pg/μL管中加入供试品溶液97μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，2％的蛋白酶K溶液2μL混合均匀后，取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min，所得溶液即可作为荧光定量PCR的10pg/μL准确度溶液(4℃保存)。
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液和7.8pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果如表5所示。
表5：
结论：除0.05‰外，其它各实验组的平均回收率介于70.0％-130.0％之间，符合可接受标准，说明当蛋白酶K的用量不低于0.1‰时，如0.1‰～0.4‰时，用该Q-PCR方法检测宿主DNA残留都是可行的。而0.05‰由于基质干扰严重，回收率较低，检测准确度亦较低。
实施例5消化时间考察：0.5h-1h-2h-4h。
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为8.8，混合均匀即得(1×TE缓冲液)。
阴性模板溶液：取4个干净的EP管，编号为B1、B2、B3、B4号，向各管中加入空白溶液99μL，加入1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，B1号管消化0.5h；B2号管消化1h；B3号管消化2h；B4号管消化4h消化完成后，95℃灭活30min。所得溶液即可作为荧光定量PCR的阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：参照“实施例3”项下“供试品溶液”。
供试品模板溶液：取4个干净的EP管，编号为S1、S2、S3、S4号，向各管中加入供试品溶液99μL，1.5％的蛋白酶K溶液1μL，各取50μL然后放入PCR仪中按下列程序进行处理：S1号管消化0.5h；S2号管消化1h；S3号管消化2h；S4号管消化4h消化完成后，95℃灭活30min。所得溶液即可作为荧光定量PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：参照“实施例3”项下“DNA标准溶液”。
7.8pg/μL准确度溶液：取4个干净的EP管，编号为S1+7.8pg/μL、S2+7.8pg/μL、S3+7.8pg/μL、S4+7.8pg/μL号,分别向各管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，S1+7.8pg/μL号管消化0.5h；S2+7.8pg/μL号管消化1h；S3+7.8pg/μL号管消化2h；S4+7.8pg/μL号管消化4h。消化完成后，95℃灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的10pg/μL准确度溶液(4℃保存)。
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液和7.8pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果如表6所示。
表6：
结论：消化时间在2h-4h时各实验组的平均回收率介于70.0％-130.0％之间，符合可接受标准，说明当消化时间为不低于2h时，用该Q-PCR方法检测宿主DNA残留都是可行的。当消化时间≤1h时，样品基质干扰严重，回收率均不合格。
对比例1对比试剂盒提取法与蛋白酶K消化法对检测结果的影响
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为9.5，混合均匀即得(1×TE缓冲液)。
阴性模板溶液：取2个干净的EP管，编号为B1、B2，向B1管中加入空白溶液100μL，使用TIANGEN核酸提取试剂盒提取处理，提取样品作为试剂盒提取法阴性模板溶液，提取方法参照TIANGEN微量样品基因组DNA提取试剂盒(目录：DP316)说明书“从干血点中提取基因组DNA”项下(下同)。
向B2管中加入空白溶液99μL，1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃消化3h，95℃灭活30min，所得溶液作为蛋白酶K消化法阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：取利拉鲁肽27.01mg，精密称定，置于15mL容量瓶中，加入空白溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
供试品模板溶液：取2个干净的EP管，编号为S1、S2，向S1管中加入供试品溶液100μL，使用TIANGEN试剂盒提取处理，提取方法参照TIANGEN试剂盒微量核酸提取说明书。
向S2管中加入供试品溶液99μL，1.5％的蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃消化3h，95℃灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：吸取重组大肠杆菌基因组标准DNA 2μL，加入空白溶液适量配制成10ng/μL的DNA标准溶液。
262.7ng/μL标准DNA溶液：吸取重组大肠杆菌基因组标准DNA 5μL，用空白溶液稀释至262.7ng/μL，混合均匀。
2ng/μL标准DNA溶液：用空白溶液将262.7ng/μL标准DNA溶液稀释至2ng/μL，混合均匀。
2.63ng/μL准确度溶液：取2个干净的EP管，编号为S1+2.63ng/μL、S2+2.63ng/μL，向S1+2.63ng/μL管中加入标准DNA溶液(262.7ng/μL)1μL，供试品溶液100μL，混合均匀后，使用TIANGEN试剂盒提取处理，提取方法参照TIANGEN试剂盒微量核酸提取说明书。向S2+2.62ng/μL管中加入DNA标准溶液(262.7ng/μL)1μL,供试品溶液98μL，蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h，95℃灭活30min，所得溶液即可作为荧光定量PCR的2.63ng/μL准确度溶液(4℃保存)。
20pg/μL准确度溶液：取1个干净的EP管，加入标准2ng/μL DNA溶液1μL,供试品溶液100μL，混合均匀后，使用TIANGEN试剂盒提取处理，提取方法参照TIANGEN试剂盒微量核酸提取说明书。所得溶液即可作为荧光定量PCR的20pg/μL准确度溶液(4℃保存)。
10pg/μL准确度溶液：取1个干净的EP管，加入1ng/μL DNA标准溶液1μL,供试品溶液98μL，蛋白酶K溶液1μL，混合均匀后，放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化3h，95℃灭活30min，所得溶液即可作为荧光定量PCR的10pg/μL准确度溶液(4℃保存)。
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液，2.63ng/μL准确度溶液，20pg/μL准确度溶液，10pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果：
试剂盒提取法的Q-PCR检测结果如表7所示。
表7：
蛋白酶K消化法的Q-PCR检测结果如表8所示。
表8：
结论：TIANGEN试剂盒提取法的实验组的回收率介于44.15％-66.92％之间，整体平均回收率为55.76％，均低于70％。蛋白酶K消化法实验组的回收率介于70％-130％之间，符合可接受标准，说明蛋白酶K消化法来检测宿主DNA残留是可行的。蛋白酶K消化法相比于试剂盒提取法检测准确度更高。
对比例2对比其它消化酶消化与蛋白酶K消化对检测结果的影响
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为9.5，混合均匀即得。
阴性模板溶液：取2个干净的EP管，编号为B1、B2号，向B1管中分别加入空白溶液99μL，1.5％的肠激酶溶液1μL；向B2管中分别加入空白溶液99μL，1.5％的胰酶溶液1μL。混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：参照“实施例3”项下“供试品溶液”
供试品模板溶液：取2个干净的EP管，编号为S1、S2号，向S1管中分别加入供试品溶液99μL，1.5％的肠激酶溶液1μL；向S2管中分别加入供试品溶液99μL，1.5％的胰酶溶液1μL。分别混合均匀后，然后取50μL放入PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min；所得溶液即可作为荧光定量PCR的供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：参照“实施例3”项下“DNA标准溶液”。
7.8pg/μL准确度溶液：取2个干净的EP管，编号为S1+7.8pg/μL、S2+7.8pg/μL号,向S1+7.8pg/μL管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，1.5％的肠激酶溶液1μL；向S2+7.8pg/μL管中加入供试品溶液98μL，DNA标准溶液(780pg/μL)1μL，1.5％的胰酶溶液1μL。混合均匀后，取50μL放入Q-PCR仪中按下列程序进行处理：55℃，消化4h；95℃，灭活30min，所得溶液即可作为荧光定量PCR的10pg/μL准确度溶液(4℃保存)。
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液和7.8pg/μL准确度溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果如表9所示。
表9：
结论：各实验组的平均回收率不在70.0％-130.0％之间，不符合可接受标准，说明胰蛋白酶和肠激酶不能用于样品消化处理。
对比例3对比自动核酸提取仪提取法与蛋白酶K消化法对检测结果的影响
1)溶液配制：
空白溶液(1×TE缓冲液)：取20×TE缓冲液1mL与19mL的超纯水混合均匀，用氢氧化钠溶液调pH值为9.5，混合均匀即得(1×TE缓冲液)。
阴性模板溶液：取2个干净的EP管，编号为B1、B2，向B1管中加入空白溶液100μL，使用自动核酸提取仪提取法处理，提取样品作为自动核酸提取仪提取法阴性模板溶液，提取方法参照Thermo PrepSEQ核酸提取试剂盒说明书。
向B2管中加入空白溶液100μL，2％的蛋白酶K溶液25μL，混合均匀后，放入PCR仪中按下列程序进行处理：56℃消化2h，95℃灭活30min，用空白溶液稀释100倍，所得溶液作为蛋白酶K消化法阴性模板溶液(4℃保存)。
供试品溶液：将单纯疱疹病毒样品(滴度1.05×1010pfu/ml)溶液于90℃水浴中灭活30min后,即为供试品溶液。
供试品模板溶液：取2个干净的EP管，编号为S1、S2，向S1管中加入供试品溶液100μL，使用自动核酸提取仪提取法处理，提取方法参照Thermo自动核酸提取仪提取法说明书，所得溶液作为自动核酸提取法供试品模板溶液(4℃保存)。
向S2管中加入供试品溶液100μL，2％的蛋白酶K溶液25μL，混合均匀后，放入PCR仪中按下列程序进行处理：56℃消化2h，95℃灭活30min，所得溶液作为蛋白酶K消化法供试品模板溶液(4℃保存)。
DNA标准溶液：吸取vero细胞基因组标准DNA1.77μL(565ng/μL)，加入空白溶液98.23μL混合均匀，即得10ng/μL的DNA标准溶液，然后分别取10μL DNA标准溶液加入90μL的1×TE溶液，逐级稀释成1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL系列标准溶液。
10pg/μL准确度模板溶液：取2个干净的EP管，编号为S1+10pg/μL和S2+10pg/μL，向S1+10pg/μL管中加入标准DNA溶液(1ng/μL)1μL，供试品溶液99μL，混合均匀后，使用自动核酸提取仪提取法处理，提取方法参照Thermo自动核酸提取仪提取法说明书。所得溶液作为自动核酸提取法10pg/μL准确度模板溶液(4℃保存)。向S2+10pg/μL管中加入供试品溶液100μL，2％的蛋白酶K溶液25μL，混合均匀后，放入PCR仪中按下列程序进行处理：56℃，消化2h，95℃灭活30min后，取该溶液99μL，加入DNA标准溶液(1ng/μL)1μL,所得溶液即可作为蛋白酶K消化法10pg/μL准确度模板溶液(4℃保存)。
2)操作：
取DNA标准模板溶液，阴性模板溶液，供试品模板溶液，10ng/μL准确度模板溶液，按表1所述体系配好后，按表2扩增程序进行Q-PCR扩增，每个模板溶液做2个复孔，反应完全后进行数据分析。
3)结果：
自动核酸提取法的Q-PCR检测结果如表10所示。
表10：
蛋白酶K消化法的Q-PCR检测结果如表11所示。
表11：
结论：自动核酸提取法的实验组的回收率介于70.60％-80.00％之间，整体平均回收率为75.30％。蛋白酶K消化法实验组的回收率介于94.10％-99.10％之间，平均收率96.60％，高于自动核酸提取法实验组的收率，说明蛋白酶K消化法相比于试剂盒提取法检测准确度更高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种药物样品的残留DNA的检测方法，其特征在于，所述药物为蛋白药物、细胞治疗药物或基因治疗药物，所述方法包括：
(1)将药物样品在蛋白酶K存在的条件下进行消化处理，所述消化处理是在TE缓冲液中进行的；
(2)将消化处理产物进行灭活处理；
(3)将步骤(2)的灭活处理后体系在预定的PCR反应体系中进行Q-PCR扩增，以便获得样品残留DNA的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K在消化体系中的浓度不低于0.1‰。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化是在pH为7.0-12.0、温度为55-70℃的条件下进行不低于2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活处理是在温度为90～98℃的条件下进行25～35min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为蛋白药物，所述药物在消化体系中的浓度为0.5mg/mL～2.0mg/mL，优选，0.7mg/mL～1.8mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为基因治疗药物，所述药物在消化体系中的浓度为5×107pfu/mL～1.5×1010pfu/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为基因治疗药物，所述药物在消化体系中的浓度为5×107pfu/mL～1.5×108pfu/mL。
8.权利要求1～7所述的方法在检测药物样品中残留DNA含量的应用。
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