CN112080553A - 粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，通过处理粗品羊肝素钠样品，分别得到用于测量羊DNA和猪DNA的溶液；其中用于测量猪DNA的溶液采用单独的试剂盒提取对猪DNA进行提取；并针对待测DNA溶液进行PCR扩增设计引物、PCR反应体系及PCR反应程序；最后分别使用羊DNA和猪DNA标准品制作相应的DNA含量标准曲线，利用PCR扩增制备的PCR模板，通过计算得到羊和猪DNA含量。本发明利用了TaqMan探针法进行检测，灵敏度高、特异性好、操作简单。通过肝素酶和硫酸软骨素酶组合酶解粗品羊肝素钠，有效解除了肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素对PCR反应的抑制；由于羊肝素钠中猪DNA含量少，采用本发明提取方法，解决了微量猪DNA含量检测准确性问题，效果显著。

Description

粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法。
背景技术
肝素是临床上应用最广泛且最重要的一种抗凝剂，主要提取自猪、牛和羊的肠粘膜或肺，目前医用肝素的主要来源是猪的肠粘膜肝素，但牛、羊肝素在部分国家和地区(南美、东南亚与南亚)仍被广泛使用。肝素通常是从刮制肠衣后的小肠粘膜中提取的，我国是世界最大的肠衣生产加工和出口国，每年有多达3亿根的羊小肠被制成羊肠衣，大量的羊肠粘膜随后被提取肝素，预估粗品羊肝素的总量在20吨左右。已有技术表明羊肝素在理化性质和生物学活性上近似于猪肝素，专利CN2016106936194介绍了一种羊源的依诺肝素钠，它是从粗品羊肝素钠制备的低分子肝素，其除了种源为羊源外，符合USP依诺肝素钠的质量指标。
众所周知，穆斯林对食品和药品有明确的要求，哺乳动物牛、羊等可以食用，猪、狗等禁食，牛、羊肝素可开发成清真药物。通常意义上，牛源产品由于上世纪爆发的疯牛病，存在一定的隐患，羊源肝素则让人更容易接受一些。因此，检测粗品羊肝素的质量尤其是猪源肝素的混杂，是开发清真肝素制品的必要程序。
在粗品肝素中，动物组织中的部分DNA会在生产过程中保留下来。现有方法中，PCR方法用于快速检测物种来源应用比较广泛。荧光定量PCR技术是在PCR体系中加入荧光基团，监测PCR过程中荧光信号，通过最终Ct值和标准曲线对初始模板量进行定量分析。荧光定量PCR技术具有高灵敏度，高精度等特点。现有荧光定量PCR技术均用于检测猪肝素物料中猪和反刍基因的检测，大多以总DNA提取的方法检测其含量，专利CN201410115327.3中报道了使用肝素酶酶解肝素的方法用于鉴别猪肝素中的牛基因。
现有技术都不适用于羊肝素中羊DNA和猪DNA含量的检测，主要原因在于：(1)粗品肝素中除了有肝素多糖还有硫酸软骨素和硫酸皮肤素，它们都对PCR反应有抑制作用；(2)羊源肝素中猪基因含量较少，不适合用酶解后的溶液直接测定含量，专利CN201610853008.1和CN201510179643.1中总DNA提取的方法也不适用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测粗品羊肝素钠中羊、猪DNA的qPCR方法，用于定量检测粗品羊肝素中羊、猪DNA含量，监控粗品羊肝素质量。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，包括以下步骤：
步骤一：处理粗品羊肝素钠样品，分别得到用于测量羊DNA和猪DNA的溶液其中用于测量猪DNA的溶液采用单独的试剂盒提取对猪DNA进行提取。其中，用于样品中羊DNA含量的测定的处理，可通过处理粗品羊肝素钠样品，肝素酶II和硫酸软骨素酶酶解样品的方法，以降低肝素对于qPCR反应的影响。而用于样品中猪DNA含量的测定的处理则可以通过采用处理粗品羊肝素钠样品，肝素酶II酶解样品，DNA试剂盒提取总DNA的方法进行。
本发明通过不同的总DNA的提取方法用于检测羊DNA和猪DNA，原因在于粗品羊肝素钠中大量存在羊DNA，但猪DNA的含量极低，粗品羊肝素钠中的肝素多糖还有硫酸软骨素和硫酸皮肤素等多糖，都会干扰衡量猪DNA的qPCR检出。羊DNA因含量高，样品只需稀释也可以保持一定的浓度，可以直接依据本发明所述的qPCR条件定量检测；而猪DNA因含量稀少，本方法通过DNA试剂盒方法，富集DNA且大量去除抑制qPCR的多糖，从而使得猪DNA可以被qPCR定量检测，解决了本领域检测的难题。
步骤二：针对待测DNA溶液进行PCR扩增设计引物、PCR反应体系及PCR反应程序；
步骤三：分别使用羊DNA和猪DNA标准品制作相应的DNA含量标准曲线，利用PCR扩增制备的PCR模板，通过计算得到羊和猪DNA含量。
优选地，步骤一用于制得测量羊DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：
(1)称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，95～100℃水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；
(2)将样品溶液过微米级滤膜，经酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，硫酸软骨素酶，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23～28℃下水浴24小时；
(3)酶解液用无菌水稀释制得用于羊DNA含量检测的溶液。
优选地，步骤一中用于制得测量猪DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：
(1)称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，在95～100℃下水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；
(2)将样品溶液过微米级滤膜，经过酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23～28℃水浴下24小时；
(3)DNA试剂盒从酶解液中提取DNA用于猪DNA含量的检测；
所述DNA提取包括如下步骤：①.将酶解液于制备管中，离心，弃废液；②.加入Buffer W1，再次离心，弃废液；③.加BufferW2，离心，弃废液，重复一次，即再次加BufferW2，离心，弃废液；④.再次离心1min；⑤.转制备管于新的离心管中，在制备管的膜中央加入Eluent溶液，65℃水浴静置5min，经离心后即得。
优选地，所述步骤二中引物为：
其中，猪源引物：
上游引物：5＇-CCTACGCATTTCACTACAAG-3＇，
下游引物：5＇-GTTTGGGTTGATTGAATCTG-3＇，
探针引物：5＇-FAM-ACTAGCCCCATTATCAGTACTATGCCA-BHQ1-3＇。
其中，羊源引物：
上游引物：5＇-ACGAGGCCTATACTATGGATCATATACC-3＇，
下游引物：5＇-TCCTCATGGTAAAACATAGCCTATGAATG-3＇，
探针引物：5＇-FAM-CTCCTATTTGCGACAATAG-TAMRA-3＇。
优选地，所述步骤二中的PCR反应体系为：10×ExTaq Buffer，MgCl2，dNTP，上游引物，下游引物，探针，ExTaq，ddH2O，DNA/Sample。
优选地，所述步骤二中的PCR反应程序为：预变性95℃10min；变性95℃15s，退火60℃1min，40个热循环。
优选地，所述步骤三中羊和猪DNA含量标准曲线为通过各浓度DNA标准品溶液与其扩增曲线对应的Ct值，得出标准曲线，其中标准曲线的相关系数R的平方≥0.95，阴性对照的Ct值为No Ct(任何Ct值大于最后一次循环数将指定为No Ct，其中，NoCt为仪器自动显示值)。
优选地，所述步骤三中羊和猪DNA的含量公式为：
Figure BDA0002093109970000041
Figure BDA0002093109970000042
本发明的有益效果体现在：利用TaqMan探针法进行检测，具有灵敏度高、特异性好、线性范围广、操作简单和结果直观等特点。通过肝素酶和硫酸软骨素酶组合酶解粗品羊肝素钠，有效解除了肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素对PCR反应的抑制；由于羊肝素钠中猪DNA含量少，采用与现有技术不同的提取方法，解决了微量猪DNA含量检测准确性问题，经济效果显著。
附图说明
图1：实时荧光定量检测的羊DNA含量的标准曲线示意图。
图2：实时荧光定量检测的猪DNA含量的标准曲线示意图。
具体实施方式
以下结合实施例具体阐述本发明的技术方案，本发明揭示了一种用于检测粗品羊肝素钠中羊DNA和猪DNA含量的检测方法，本方法灵敏度高，可用于检测猪源混杂的粗品羊肝素钠，更好地监控产品质量。
实施例1
qPCR方法检测粗品羊肝素中羊DNA含量
1、溶液配制
(1)0.5×TE缓冲液：精密量取250μL TE Buffer(100×)，用超纯水定容至50mL。
(2)1M Tris-HCl(pH 8.0)：溶解约6.0g Tris碱于40mL水中，盐酸调节pH至8.0，转移至50mL容量瓶，用超纯水稀释至刻度线。
(3)肝素酶消化缓冲液：取10mL浓度为1M的Tris-HCl buffer solution，加超纯水稀释到1L，混匀。称量约0.735g的CaCl2·H2O溶解其中，即得。
(4)硫酸软骨素酶B：根据厂家说明，用100μL超纯水复溶硫酸软骨素酶B冻干粉，得10000IU/L，即10IU/mL，-20℃保存。
(5)引物和探针：将装有引物的EP管于离心机上，10000rpm离心1min。根据厂家说明用0.5×TE Buffer稀释到20μM，-20℃保存。
(6)羊DNA标准品溶液：用0.5×TE缓冲液稀释羊DNA标准品(1mg/mL)为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL。
2、肝素样品溶液
(1)称取252.0mg粗品羊肝素钠样品溶于10mL肝素酶消化缓冲液，95～100℃水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀。
(2)将样品溶液过0.22μm滤膜，50μL酶解体系：40μL过滤后样品溶液，0.06IU肝素酶II，0.008IU硫酸软骨素酶B，加消化缓冲液至50μL，震荡摇匀。25℃水浴24小时后待用，酶解液用无菌水稀释20倍用于羊DNA含量检测。
(3)酶解控制：50μL酶解体系：40μL消化缓冲液，0.06IU肝素酶II，0.008IU硫酸软骨素酶B，加消化缓冲液至50μL，震荡摇匀。25℃水浴24小时后待用，酶解液用无菌水稀释20倍用于羊DNA含量检测。
3、引物设计和qPCR扩增
(1)羊源引物：
上游引物：5＇-ACGAGGCCTATACTATGGATCATATACC-3＇
下游引物：5＇-TCCTCATGGTAAAACATAGCCTATGAATG-3＇
探针引物：5＇-FAM-CTCCTATTTGCGACAATAG-TAMRA-3＇
(2)PCR体系：10×ExTaq Buffer 2.5μL，MgCl2 2μL，dNTP 2μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，探针0.1μL，ExTaq 0.2μL，ddH2O 15.6μL，DNA/Sample 2μL。
(3)PCR程序：预变性95℃，10min；变性95℃，15s，退火60℃，1min；40个热循环。
4、结果分析
(1)标准曲线适用性：各浓度的羊DNA标准品溶液和其扩增所对应的Ct值，得到标准曲线如图1所示，其相关系数R的平方≥0.95。
(2)以酶解控制和ddH2O设为阴性对照，它们的Ct值均为No Ct，显示检测体系符合需求。
(3)肝素样品溶液的羊DNA检测结果，其Ct值为22.42，由标准曲线可得测试溶液的羊DNA浓度为158.0pg/uL；
Figure BDA0002093109970000061
实施例2
qPCR方法检测粗品羊肝素中猪DNA含量
本实验用于DNA提取的试剂盒来自康宁生命科学(吴江)有限公司。
1、溶液配制
(1)0.5×TE缓冲液：精密量取250μL TE Buffer(100×)，用超纯水定容至50mL。
(2)1M Tris-HCl(pH 8.0)：溶解约6.06g Tris碱于40mL水中，盐酸调节pH至8.0，转移至50mL容量瓶，用超纯水稀释至刻度线。
(3)肝素酶消化缓冲液：取10mL浓度为1M的Tris-HCl buffer solution，加超纯水稀释到1L，混匀。称量约0.735g的CaCl2·H2O溶解其中，即得。
(4)引物和探针：将装有引物的EP管于离心机上，10000rpm离心1min。根据厂家说明用0.5×TE Buffer稀释到20μM，-20℃保存。
(5)猪DNA标准品溶液：用0.5×TE缓冲液稀释猪DNA标准品(1mg/mL)为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL。
2、肝素样品溶液总DNA
(1)称取250.5mg粗品羊肝素钠溶于10mL肝素酶消化缓冲液，95～100℃水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀。
(2)将样品溶液过0.22μm滤膜，500μL酶解体系：400μL过滤后样品溶液，0.3IU肝素酶II，加消化缓冲液至500μL，震荡摇匀。25℃水浴24小时后待用，
(3)酶解控制：500μL酶解体系：400μL消化缓冲液，0.3IU肝素酶II，0.008IU加消化缓冲液至500μL，震荡摇匀。25℃水浴24小时后待用。
(4)DNA提取步骤：①.300μL酶解液于制备管中，12500rpm离心1min，弃废液；②.加500μL BufferW1，12500rpm离心1min，弃废液；③.加700μL BufferW2，12500rpm离心1min，弃废液，重复一次；④.12500rpm离心1min；⑤.转制备管于新的离心管中，在制备管的膜中央加入50μL Eluent溶液，65℃水浴静置5min，12500rpm离心1min，即得。
3、引物设计和qPCR扩增
(1)猪源引物：
上游引物：5＇-CCTACGCATTTCACTACAAG-3＇
下游引物：5＇-GTTTGGGTTGATTGAATCTG-3＇
探针引物：5＇-FAM-ACTAGCCCCATTATCAGTACTATGCCA-BHQ1-3＇
(2)PCR体系：10×ExTaq Buffer 2.5μL，MgCl2 2μL，dNTP 2μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，探针0.1μL，ExTaq 0.2μL，ddH2O 15.6μL，DNA/Sample 2μL。
(3)PCR程序：预变性95℃10min；变性95℃15s，退火60℃1min，40个热循环。
4、结果分析
(1)标准曲线适用性：各浓度的猪DNA标准品溶液和其扩增所对应的Ct值，得到标准曲线，如图2所示，其相关系数R的平方≥0.95。
(2)以酶解控制、Eluent溶液和ddH2O分别作为阴性对照，它们的Ct值均为No Ct，显示检测体系符合需求
(3)肝素样品溶液的猪DNA检测结果，其Ct值为28.41，由标准曲线可得测试溶液的羊DNA浓度为28.3pg/uL；
Figure BDA0002093109970000081
实施例3
现有5个粗品羊肝素钠样品。根据实施例1和实施例2中所述步骤，测定粗品羊肝素钠中羊DNA和猪DNA的含量，结果如表1所示。
表1：粗品羊肝素钠样品的羊DNA和猪DNA含量
样品编号 粗品中羊DNA含量(ppm) 粗品中猪DNA含量(ppm) 猪DNA与羊DNA含量之比
1 12905.15 13.01 0.10％
2 9666.19 51.42 0.53％
3 8400.17 5.23 0.06％
4 10953.36 1.39 0.01％
5 10545.84 3.05 0.03％
测得的5个样品中羊DNA含量和猪DNA含量如表1所示，仅有样品2的猪DNA与羊DNA含量之比大于0.5％。根据FDA通则，其他种源的掺入比例应在0.5％以下，样品2中猪DNA含量与羊DNA含量之比为0.53％，故判定样品2羊肝素中猪源成分超标，不合格，其余样品合格。
当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (9)

1.粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：处理粗品羊肝素钠样品，分别得到用于测量羊DNA和猪DNA的溶液；其中用于测量猪DNA的溶液采用单独的试剂盒提取对猪DNA进行提取；
步骤二：针对待测DNA溶液进行PCR扩增设计引物、PCR反应体系及PCR反应程序；
步骤三：分别使用羊DNA和猪DNA标准品制作相应的DNA含量标准曲线，利用PCR扩增制备的PCR模板，通过计算得到羊和猪DNA含量。
2.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，步骤一用于制得测量羊DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：
（1）称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，95~100℃水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；
（2）将样品溶液过微米级滤膜，经酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，硫酸软骨素酶，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23~28℃下水浴24小时；
（3）酶解液用无菌水稀释制得用于羊DNA含量检测的溶液。
3.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，步骤一中用于制得测量猪DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：
（1）称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，在95~100℃下水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；
（2）将样品溶液过微米级滤膜，经过酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23~28℃水浴下24小时；
（3）DNA试剂盒从酶解液中提取DNA用于猪DNA含量的检测；
所述DNA提取包括如下步骤：①.将酶解液于制备管中，离心，弃废液；②.加入BufferW1，再次离心，弃废液；③.加Buffer W2，离心，弃废液，重复一次；④.再次离心1min；⑤.转制备管于新的离心管中，在制备管的膜中央加入Eluent溶液，65℃水浴静置5min，经离心后即得。
4.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中引物为：
其中，猪源引物：
上游引物：5＇-CCTACGCATTTCACTACAAG-3＇，
下游引物：5＇-GTTTGGGTTGATTGAATCTG-3＇，
探针引物：5＇-FAM -ACTAGCCCCATTATCAGTACTATGCCA-BHQ1-3＇；
其中，羊源引物：
上游引物：5＇-ACGAGGCCTATACTATGGATCATATACC-3＇，
下游引物：5＇-TCCTCATGGTAAAACATAGCCTATGAATG-3＇，
探针引物：5＇-FAM -CTCCTATTTGCGACAATAG-TAMRA-3＇。
5.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中的PCR反应体系为：10×ExTaq Buffer，MgCl2，dNTP，上游引物，下游引物，探针，ExTaq，ddH2O，DNA/Sample。
6.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中的PCR反应程序为：预变性 95℃ 10min；变性 95℃ 15s，退火 60℃1min，40个热循环。
7.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤三中羊和猪DNA含量标准曲线为通过各浓度DNA标准品溶液与其扩增曲线对应的Ct值，得出标准曲线，其中标准曲线的相关系数R的平方≥0.95，阴性对照的Ct值为NoCt。
8.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤三中羊和猪DNA的含量公式为：
粗品羊肝素中羊DNA含量（ppm）=
Figure DEST_PATH_IMAGE002
粗品羊肝素中猪DNA含量（ppm）=
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
9.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法在羊肝素制品质量检测分析中的应用。
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