CN113403383B - 一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用。所述先天性巨结肠的标志物包括hsa_circ_0000740。本发明利用DNA诊断技术、首次采用高特异性的hsa_circ_0000740作为儿童先天性巨结肠的标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高以及成本低等众多综合优势。

Description

一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用。

背景技术

先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是一种儿童肠神经发育异常的出生缺陷疾病，病理机制为肠神经嵴细胞迁移和分化成肠神经元发生障碍，导致肠神经缺乏而发生持续性痉挛，是小儿常见的先天性肠道疾病之一。

先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。目前，钡灌肠为最重要的诊断方法，钡灌肠后可见扩张和狭窄段而诊断为巨结肠，但该方法只能诊断出有典型肠道形态改变的患儿，灵敏度需要提高，诊断的准确度80％左右；直肠活检是直接取直肠组织，检测是否有神经节细胞的缺失，准确率高，但取样部位对结果有影响，但该方法为介入有创型，且价格非常高；直肠测压是通过检测肛门内括约肌的松弛缺乏判定肠神经的支配异常，仅为辅助诊断方法，假阳性和假阴性都较多，不能用于单独检测，因此，寻找一种简单、准确、微创的早期HSCR诊断方法意义重大。

CN112708673A公开了与人类先天性巨结肠发生相关的血浆微小核糖核酸标志物及其应用，该标志物选自hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141和hsa-miR-194中的多种，该标志物对先天性巨结肠具有特异性和敏感性，可用于制备先天性巨结肠诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，并可在早期进行筛查和诊断，可反复检测并易于动态监测。

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子(在活体中有时也有表达)，是RNA领域最新的研究热点之一，最新的研究成果发现在哺乳动物细胞中存在多种环形RNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肝癌、结肠癌中已经证实circRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。

在人类中，hsa_circ_0000740位于17号染色体负链5364258至5365866处，目前现有技术中尚未有记载hsa_circ_0000740与先天性巨结肠的发生相关。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用，本发明首次发现hsa_circ_0000740与先天性巨结肠的发生相关，其在巨结肠组织中表达上调，因此，可通过hsa_circ_0000740的表达诊断或监测先天性巨结肠症。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种与先天性巨结肠发生相关的标志物，所述先天性巨结肠的标志物包括hsa_circ_0000740。

本发明使用的术语“标志物”指用作分析样本的靶标分子。

根据本发明，hsa_circ_0000740位于人17号染色体负链5364258至5365866处，本发明首次发现hsa_circ_0000740与先天性巨结肠的发生相关，其在巨结肠组织中表达上调，因此，通过分析巨结肠组织中hsa_circ_0000740的表达水平，即可诊断和/或监测先天性巨结肠症。

根据本发明，hsa_circ_0000740包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

SEQ ID NO.1：

atgaaaatgaacaaacactccgtgcatcacgagtaggaatagtacactgttgaacggaggaacacagacgcaaaagaacacagaacgtatggcttcattttctaaagttaaagcacaggctaatctaatggtgttacaagttaggacagtggctgcctgtcgggagggagttgtaagtgcggggaaagtgagggcttctggggtaccagctaatattctattgcttgatctcaatggtggttacacagatgttggttctggtatgtttggtgtatctgtatatgttttttttttctttcatgttgctatacttttaaaaagtttaaaagaaaataattagtatctttgtcagcaagtttccagtgcagcaggaaaacctaactaatacaaataaaggaaaggagaatcagaacctcctggcatttactgaccaattattttgaaagttattctttaaaaatctgtaaaacagagatcacagaatgatcagtaagaaatctttttacctgagggaaaataaaactgccaaatcttcaaggcaaaaaaaaacatgactatattttttgaatctttcatttaaataacccagtcatccctcatgggccacagtctataaaccctcccttacctggtgactcgaatcttcgctgctttgctttatgaagtcttccagctcctgcttatctttcattgtcttctctaactggtcattagcttgccttagcatcagctgtagttttttcacctgtatcattttaaaagtcaattagaaaaaccagaatccttttataatttttttttttttaaatctaactccagaattttaaaaaaaaatctcttatgtctttttctgggaaacaccacagattttctaattcagacagaaattagataaatgacctcaagagacaactgtactgtggtttacagttaacaaatcatttttcacacacatctcatctgaaaacatctgcttctccctcagatcctctagaccatgacactgttctccctaactagagtgtatcctctgtctccagtctacaatccacactaacaccagaaattttataaaagtgaaataatataatttccctacttaaaactctaaatgcctctcaaagtcttcagggtaaatttttttttttttttttttgagacaagagtctctcgctctgcaatctcggctcactgcaacctccacctcctggggttcaagggattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggattacaggcatgcaccaccacacctggctaattttgcatttttagtagaggtggggtttctccatgttagtcaggctggtctatgaactcctaacctcaggtgatcggcccgcctcggcctcccaaagtgctgggattataggcgtgagccaccatgcccggcttcagggtaaaatttaaatctcttcaatcatcacccctccctaagtgatgtcttcatggctttcccttgtagcttacattcccattatttcgtaacagtcaccccctgtgcccagccacataactactcatacttcctacaatacatcattttctttcctaactctgttctttgtatattttttctctccatg。

第二方面，本发明提供如第一方面所述的先天性巨结肠的标志物的引物，所述引物包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

SEQ ID NO.2：5’-GCTACGATGGATGTGGACCTG-3’。

SEQ ID NO.3：5’-GCTGTATTTCCGAAGCAAAGAGT-3’。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的先天性巨结肠的标志物或第二方面所述的先天性巨结肠的标志物的引物在制备先天性巨结肠诊断和/或监测产品中的应用。

第四方面，本发明提供一种先天性巨结肠的诊断和/或监测试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述先天性巨结肠的标志物的引物。

优选地，所述试剂盒还包括管家基因的引物。

优选地，所述管家基因包括β-actin。

优选地，所述β-actin的引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核酸序列。

SEQ ID NO.4：5’-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3’。

SEQ ID NO.5：5’-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3’。

优选地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂或PCR Mix中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，市售常规RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR Mix均能应用于本发明。

优选地，所述RNA提取试剂包括Trizol、氯仿、异丙醇和乙醇。

优选地，所述逆转录试剂包括逆转录反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。

优选地，所述PCR Mix包括2×PCR mastermix。

第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的先天性巨结肠的诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：

以样本中RNA为模板进行逆转录反应，以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述先天性巨结肠的标志物的引物进行实时荧光定量PCR，判读结果。

优选地，所述使用方法还包括制备梯度稀释DNA模板的步骤。

优选地，所述梯度稀释DNA模板的制备方法包括：

以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述先天性巨结肠的标志物的引物进行PCR反应，将所述PCR反应产物进行梯度稀释，得到所述梯度稀释DNA模板。

优选地，所述梯度稀释分别稀释1×10^-1倍、1×10^-2倍、1×10^-3倍、1×10^-4倍、1×10^-5倍、1×10^-6倍、1×10^-7倍、1×10^-8倍和1×10^-9倍。

优选地，实时荧光定量PCR的反应程序包括：

预变性：94～96℃，8～11min；

循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环。

优选为，预变性：95℃，10min；循环延伸：95℃变性10秒、60℃延伸60秒并收集荧光，40个循环。

本发明中，建立PCR产物的熔解曲线以检测扩增的特异性，扩增反应结束后，按程序(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。

本发明中，控制实时荧光定量PCR的反应程序可高特异性扩增目的基因。

作为优选的技术方案，所述先天性巨结肠诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法包括以下步骤：

(1)提取样本中RNA，并以所述RNA为模板进行逆转录反应，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，制备梯度稀释DNA模板；

(3)分别以所述cDNA和梯度稀释DNA模板为模板，利用第二方面所述先天性巨结肠的标志物的引物进行实时荧光定量PCR，所述实时荧光定量PCR反应程序包括：预变性：94～96℃，8～11min；循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环，判读结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用DNA诊断技术、首次采用高特异性的hsa_circ_0000740作为儿童先天性巨结肠的标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。

附图说明

图1为本发明实施例1中hsa_circ_0000740在巨结肠组织和正常肠组织中的表达水平图；

图2为本发明实施例4中hsa_circ_0000740在巨结肠组织和正常肠组织中的表达水平图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例筛选先天性巨结肠症相关基因标志物，包括以下步骤：

(1)样本收集：遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，收集4例先天性巨结肠患者的巨结肠组织和正常肠组织；

(2)RNA样品制备：用Rnase R(Epicentre，Inc.)处理步骤(1)收集的组织消化总RNA，去除线性RNA并富集环状RNA；

(3)逆转录和标记：利用随机引物法(Arraystar Super RNALabeling Kit；Arraystar)对步骤(2)的RNA进行反转录，得到cRNAs并进行标记；

(4)杂交：将标记的cRNAs杂交到Arraystar Human circRNA Array v2(8x15K，Arraystar)上，冲洗载玻片后，用Agilent扫描仪G2505C扫描芯片；

(5)数据处理：用Agilent特征提取软件(11.0.1.1版)分析获得的阵列图像，使用R软件limma包进行数据归一化和后续数据处理，样本间差异表达的circRNAs通过差异倍数过滤，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0且P值<＝0.05，结果如图1所示hsa_circ_0000740在巨结肠组织中的表达水平显著高于正常肠组织，因此，其可作为先天性巨结肠症的标志物。

实施例2

本实施例提取样品中RNA，包括以下步骤：

(1)样本：遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，收集15例先天性巨结肠患者的巨结肠组织和正常肠组织；

(2)RNA样品提取：

1)试剂包括TRIZOL试剂(Invitrogen life technologies)、氯仿(上海化学试剂有限公司)、异丙醇(上海化学试剂有限公司)、100％乙醇(上海化学试剂有限公司)、75％乙醇(以DEPC处理的水配制)、无RNA酶的水和无RNA酶的糖原(Invitrogen lifetechnologies)；

2)取70mg组织样品，加入1mL的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆；

3)将匀浆后样品于20℃孵育5min，每1mL的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15秒后，20℃孵育3min，4℃下12,000×g离心15min，RNA全部被分配于水相中；

4)将水相转移到新离心管中，加入异丙醇混合，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mL TRIZOL试剂此时加0.5mL的异丙醇，混匀后20℃孵育10min，于4℃、12,000×g离心10min，移去上清液；

5)每1mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入1mL的75％乙醇，清洗RNA沉淀，振荡后，于4℃、7,500×g离心5min，得到RNA；

(3)干燥所述RNA 10min，加入无RNA酶的水用枪反复吹打，然后55℃孵育10min，获得的RNA溶液保存于-70℃。

实施例3

本实施例利用实施例2制备的RNA进行cDNA合成。

试剂：RNA酶抑制剂(Epicentre)、SuperScript^TM III Reverse Transcriptase(Invitrogen)、5×RT缓冲液(Invitrogen)、2.5mM dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTest Ltd)和Primer(英骏生物技术有限公司)。

仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)和GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)。

操作过程包括以下步骤：

(1)配制退火混合液：

(2)将混合液置于65℃水浴5min，冰上放置2min，离心后，在离心管中依次加入RT反应液：

(3)混合后37℃恒温1min，移液枪轻轻吸打混合均匀，50℃温育60min，70℃温育15min使酶失活，得到cDNA，置于-20℃保存。

实施例4

本实施例通过qPCR验证hsa_circ_0000740在巨结肠组织和正常肠组织的表达差异。

试剂：2X PCRmastermix(Superarray)。

仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)和QuantStudio5Real-time PCR System(AppliedBiosystems)。

引物设计软件：Primer 5.0。

操作过程包括以下步骤：

(1)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板

1)利用hsa_circ_0000740的引物(SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3)和β-actin的引物(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)，分别以实施例3制备的cDNA为模板进行PCR反应，反应体系为：

2)轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒，进行40个循环；

3)将PCR产物与100bp DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物为单一特异性扩增条带；

4)将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8和1×10^-9梯度浓度的DNA，得到梯度稀释DNA。

(2)利用hsa_circ_0000740的引物(SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3)和β-actin的引物(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)，分别以实施例3制备的cDNA为模板和所述梯度稀释DNA进行qPCR，体系配制如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μL cDNA，离心混合，将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行反应，反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒(收集荧光)，进行40个循环。

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行反应，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。

(3)结果与计算，分别对各巨结肠组织和正常肠组织样品的hsa_circ_0000740和β-actin进行qPCR反应，并利用梯度稀释DNA进行qPCR反应绘制标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量，基因表达水平以β-actin进行标准化，使用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量，使用student ttest对巨结肠组织与正常肠组织之间基因表达量进行比较，统计分析使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.)，双侧P值小于0.05认为具有统计显著性，结果如图2所示，hsa_circ_0000740在巨结肠组织中的表达水平显著高于正常肠组织，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明本发明首次发现的先天巨结肠症标志物hsa_circ_0000740能够有效表征先天巨结肠症。

综上所述，本发明利用DNA诊断技术、首次采用高特异性的hsa_circ_0000740作为儿童先天性巨结肠的标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学附属儿童医院

<120> 一种与先天性巨结肠发生相关的标志物及其应用

<130> 20210618

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1609

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaatga acaaacactc cgtgcatcac gagtaggaat agtacactgt tgaacggagg 60

aacacagacg caaaagaaca cagaacgtat ggcttcattt tctaaagtta aagcacaggc 120

taatctaatg gtgttacaag ttaggacagt ggctgcctgt cgggagggag ttgtaagtgc 180

ggggaaagtg agggcttctg gggtaccagc taatattcta ttgcttgatc tcaatggtgg 240

ttacacagat gttggttctg gtatgtttgg tgtatctgta tatgtttttt ttttctttca 300

tgttgctata cttttaaaaa gtttaaaaga aaataattag tatctttgtc agcaagtttc 360

cagtgcagca ggaaaaccta actaatacaa ataaaggaaa ggagaatcag aacctcctgg 420

catttactga ccaattattt tgaaagttat tctttaaaaa tctgtaaaac agagatcaca 480

gaatgatcag taagaaatct ttttacctga gggaaaataa aactgccaaa tcttcaaggc 540

aaaaaaaaac atgactatat tttttgaatc tttcatttaa ataacccagt catccctcat 600

gggccacagt ctataaaccc tcccttacct ggtgactcga atcttcgctg ctttgcttta 660

tgaagtcttc cagctcctgc ttatctttca ttgtcttctc taactggtca ttagcttgcc 720

ttagcatcag ctgtagtttt ttcacctgta tcattttaaa agtcaattag aaaaaccaga 780

atccttttat aatttttttt tttttaaatc taactccaga attttaaaaa aaaatctctt 840

atgtcttttt ctgggaaaca ccacagattt tctaattcag acagaaatta gataaatgac 900

ctcaagagac aactgtactg tggtttacag ttaacaaatc atttttcaca cacatctcat 960

ctgaaaacat ctgcttctcc ctcagatcct ctagaccatg acactgttct ccctaactag 1020

agtgtatcct ctgtctccag tctacaatcc acactaacac cagaaatttt ataaaagtga 1080

aataatataa tttccctact taaaactcta aatgcctctc aaagtcttca gggtaaattt 1140

tttttttttt ttttttgaga caagagtctc tcgctctgca atctcggctc actgcaacct 1200

ccacctcctg gggttcaagg gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggattacag 1260

gcatgcacca ccacacctgg ctaattttgc atttttagta gaggtggggt ttctccatgt 1320

tagtcaggct ggtctatgaa ctcctaacct caggtgatcg gcccgcctcg gcctcccaaa 1380

gtgctgggat tataggcgtg agccaccatg cccggcttca gggtaaaatt taaatctctt 1440

caatcatcac ccctccctaa gtgatgtctt catggctttc ccttgtagct tacattccca 1500

ttatttcgta acagtcaccc cctgtgccca gccacataac tactcatact tcctacaata 1560

catcattttc tttcctaact ctgttctttg tatatttttt ctctccatg 1609

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctacgatgg atgtggacct g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctgtatttc cgaagcaaag agt 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggccgagg actttgattg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims (4)

1.检测hsa_circ_0000740的试剂在制备先天性巨结肠的诊断和/或监测产品中的应用；

所述试剂包括检测hsa_circ_0000740的引物；

所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述hsa_circ_0000740的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括RNA提取试剂、逆转录试剂或PCR Mix中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RNA提取试剂包括Trizol、氯仿、异丙醇和乙醇。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述逆转录试剂包括逆转录反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。

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