CN102358900B - 与人类先天性巨结肠发生相关的血浆微小核糖核酸标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及临床医学领域，公开了与人类先天性巨结肠发生相关的血浆微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194中的多种。该标志物对先天性巨结肠具有特异性和敏感性，可用于制备先天性巨结肠诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，并可在早期进行筛查和诊断，可反复检测并易于动态监测。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及与人类先天性巨结肠发生相关的血浆微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。
背景技术
先天性巨结肠症(Hirschsprung′s disease，HSCR)，又称先天性肠神经节缺乏症，是一种以肠道末端神经节细胞完全缺如为特征的常见消化道发育畸形，主要表现为肠神经系统发育过程中肠神经发育异常，从而导致远端肠管粘膜肌及粘膜下层神经节细胞缺如，远端肠管功能受限，最终以胎粪排出延迟或无胎粪排出，腹胀及肠梗阻为主要临床症状。HSCR在先天性消化道畸形的发生中位居第二位，仅次于先天性肛门直肠畸形，目前我国统计活产儿发病率约为1∶3000，男女比大约为4∶1，即每年有近一万的的新生儿会出现该种出生缺陷。HSCR的发病原因目前尚不完全明了，主要认为：在胚胎发育过程中，胚胎第5周神经母细胞开始沿迷走神经干由头侧向尾侧迁移，于胚胎第12周到达消化道远端，在此过程中任何原因导致神经母细胞迁移发生停顿即可造成远端肠管肠壁神经节细胞缺如，即HSCR。病理解剖提示直肠及远端结肠狭窄，近端肠管扩张，狭窄段肠壁黏膜下层及黏膜肌层神经节细胞缺如。狭窄段肠壁胆碱能受体及肾上腺能β受体含量较正常肠段减少，导致肠管及内括约肌痉挛，并且缺乏正常的肠蠕动，因此会形成功能性肠梗阻。长期慢性肠梗阻导致患儿食欲下降、营养吸收障碍、生长发育迟缓、贫血等，严重者引起小肠结肠炎、肠穿孔及多器官功能衰竭，危及患儿生命，给患儿及其家庭带来严重后果。
先天性巨结肠患儿治疗多需手术，并且就目前来说手术是解决患儿临床症状的根治办法。但在临床工作中仍然会面临很多困难，特别是手术时机如何选择等。而新生儿HSCR的诊断相当困难，结合其临床表现：不排胎便及胎便排出延迟合并腹胀、梗阻、呕吐，直肠指检伴有气便排出，需考虑该疾病诊断，同时需对患儿进行一系列辅助检查如：X线，钡剂灌肠检查，肛门直肠测压，酶组织化学检查及活检等。以上辅助检查可以帮助诊断该疾病，但尚存在一些缺陷，如检查价格昂贵、射线辐射危险，操作繁琐且有一定的创伤性及风险。这都给患儿带来极大的痛苦并且给家庭带来严重的经济负担。更为重要的是，这类检查均基于不排胎便及胎便排出延迟等临床症状，而出现此类症状往往已在患病后数日常错过了最佳的早期手术时机，并给患儿带来了相当长时间的痛苦，寻找一种简单、准确、微创的早期HSCR诊断方法意义重大。
微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，血浆miRNA与HSCR等人类出生缺陷的相互关系尚未见报道。
最新的研究成果发现血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血浆miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血浆miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《Nature》杂志也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而血浆中miRNA在HSCR早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与HSCR发病相关的特异血浆miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国出生缺陷的防治也将是一次强有力的推动。
发明内容
本发明的目的是提供与人类先天性巨结肠发生相关的血浆microRNA标志物。
本发明的另一个目的是提供上述血浆microRNA标志物的引物。
本发明还有一个目的是提供含有上述血浆microRNA标志物或其引物的应用。
本发明再有一个目的是提供含有上述血浆microRNA标志物或其引物的用于人类先天性巨结肠诊断或监测的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
与人类先天性巨结肠相关的血浆microRNA标志物，选自hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141和hsa-miR-194中的多种。
所述的血浆microRNA标志物由hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141和hsa-miR-194构成。
所述的血浆microRNA标志物，其中hsa-miR-34b的序列为CAAUCACUAACUCCACUGCCAU(SEQ ID No.1)，hsa-miR-31*的序列为UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU(SEQ ID No.2)，hsa-miR-141的序列为UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID No.3)，hsa-miR-194的序列为UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA(SEQ ID No.4)。
所述的血浆microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引物为SEQ ID No.5，下游引物为SEQ ID No.6；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引物为SEQ ID No.7，下游引物为SEQ ID No.8；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引物为SEQ ID No.9，下游引物为SEQ ID No.10；序列为SEQ ID No.4的标志物的上游引物为SEQ ID No.11，下游引物为SEQ ID No.12。
所述的血浆microRNA标志物或其引物在制备HSCR诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血浆microRNA标志物在血浆中表达量的试剂。
一种人类先天性巨结肠诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血浆microRNA标志物(hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141和hsa-miR-194中的多种)的引物。
所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，以及SEQ ID No.11和SEQID No.12)中的多对。
所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有下列4对引物SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，以及SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
本发明详细描述如下：
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、Taqman miRNA Array、Real-time PCR(Taqman探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
一、研究对象选择和分组依据
A组：健康对照组(n＝100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证)：
1.年龄在0至6月间；
2.无消化系统疾病；
3.无其它先天畸形；
4.无其他全身性重大疾病。
B组：先天性巨结肠组(n＝100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证)：
1.年龄在0至6月间；
2.经钡剂灌肠、结肠测压、术后病理证实为先天性巨结肠；
3.无其他伴随先天畸形；
4.无其它消化系统疾病；
5.无其他全身性重大疾病。
二、血液血浆分离及前处理
(1)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000RPM离心5min，取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中
(2)向EP管中加入900μl Trizol，充分混匀后，12000转离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。
(3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
(4)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
(5)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。重复一遍。
(6)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。
(7)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μlDEPC处理的水，离心1分钟。
(8)-70℃保存处理后的样本。
本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自QiagenmiRNeasy Mini Kit(货号217004)这个试剂盒，下同。
三、Real-time PCR方法测量血浆miRNAs表达量
1.取经前处理的血浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
按下表所示配制反转录体系：
2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心，冰上放置5分钟。
3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：
反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
预扩增的反应条件如下表所示：
降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-time PCR反应。
5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。
预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系：
考虑到吸液损失而放量12.5％。
6.检测并比较健康对照组、先天性巨结肠组血浆样本中miRNAs表达量的差异。
检测到的存在差异表达的健康对照和先天性巨结肠患者血浆miRNAs包括hsa-miR-34b(SEQ ID No.1)、hsa-miR-31*(SEQ ID No.2)、hsa-miR-141(SEQ ID No.3)、hsa-miR-194(SEQ ID No.4)。这些miRNAs在先天性巨结肠患者中的拷贝数都显著异于健康对照组(hsa-miR-34b高于，其余三条低于)，并且这些miRNAs在血浆中表达具有稳定性。
四、Real-time PCR方法验证血浆miRNAs表达量
1.设计4条目标miRNAs的引物：运用Stem-loop PCR方法设计引物。
2.加入荧光染料进行Real-time PCR反应。检测并比较非消化道畸形健康儿童、先天性巨结肠患儿血浆样本中miRNAs表达量的差异(病例和对照各100人)。
3.选择独立人群(对照和病例各40人)进行Real-time PCR检测，结果一致的有4条miRNAs，具体为：hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194。
因此，最终确认为存在差异表达的健康对照和先天性巨结肠患儿血浆miRNAs包括hsa-miR-34b(SEQ ID No.1)、hsa-miR-31*(SEQ ID No.2)、hsa-miR-141(SEQ IDNo.3)、hsa-miR-194(SEQ ID No.4)，具体引物见表1。其中，SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4在先天性巨结肠患儿血浆中中的拷贝数都显著低于健康对照组，而SEQ ID No.1在先天性巨结肠患儿血浆中的拷贝数都显著高于健康对照组，并且这些miRNAs在血浆中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4这4个构成的组合可以将对照组、先天性巨结肠组区分开。虽然这4条单独也可以分开两组人群，但如果只用1条，可能会有重合，而如果同时使用4条，即使1条差异不大，但另外3条表达差异都很大，就可以将其带入评分高的组。
五、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于HSCR动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血浆中稳定存在且可检测的成熟hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血浆miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
本发明的有益效果：
本发明人通过分离和比较正常对照和先天性巨结肠患儿血浆中的miRNAs，发现了血浆中存在可用于评估是否患有HSCR的特异性和敏感性(实施例7的ROC曲线提示具有较好的灵敏度，实施例8对其实际效果进行了验证，即HSCR患儿均被正确检测识别)的miRNA组合，因而提出了HSCR的血浆miRNA标志物组合，以及该血浆miRNA标志物或其引物在制备HSCR诊断或监测试剂中的应用，研制出可便于临床应用的HSCR诊断、监测试剂盒。
本发明采用血浆miRNA作为HSCR评价的标志物的优越性在于：
(1)血浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高HSCR诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为出生缺陷的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血浆miRNA标志物可用于先天性巨结肠诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期通过微创方式获得HSCR的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用符合先天性巨结肠和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血浆miRNAs，应用Real-time PCR等方法进行二次验证和独立人群验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对血浆miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价，保证了该血浆miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。
附图说明
图1HSCR影像学诊断(钡剂灌肠)。
钡剂灌肠造影显示HSCR表现为结肠远端及直肠狭窄，提示无神经节段累计整个直肠及远端结肠。
图2HSCR病理确诊(HE染色)。
Group A：正常对照组肠壁神经节细胞；Group B：HSCR组肠壁神经纤维组织增生，未见正常神经节细胞形态。
图3以hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194作为标志物对健康对照和HSCR组进行区分。
图4个体血浆miRNAs表达水平波动性分析。
图5正常对照组和HSCR组之间的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1研究对象选择和分组依据
本发明人于2009年7月到2011年7月间从南京医科大学附属儿童医院等医院搜集符合要求的先天性巨结肠患儿及正常非先天性巨结肠儿童血液和组织样品(临床诊断标准见图1，图2)，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的100例健康对照(平均年龄：89.03±9.0天)、100例先天性巨结肠患者(平均年龄：97.5±7.07天)作为Real-time PCR检测miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：
A组：健康对照组(n＝100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证)：
1.年龄在0至6月间；
2.无消化系统疾病；
3.无其它先天畸形；
4.无其他全身性重大疾病。
B组：先天性巨结肠组(n＝100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证)：
1.年龄在0至6月间；
2.经钡剂灌肠、结肠测压、术后病理证实为先天性巨结肠；
3.无其他伴随先天畸形；
4.无其它消化系统疾病；
5.无其他全身性重大疾病。
实施例2研究对象病理诊断分型
在无胎便排出、胎便排出延迟、便秘或通过灌肠等手段使大便排出的患儿使用放射学检查、肛管直肠测压、直肠壁组织学检查诊断先天性巨结肠。放射学检查包括钡剂灌肠特征主要有如下表现：1.病变段与扩张段见可见一“锥体”状移行分隔区；2病变段有不规则收缩；3.钡剂潴留；4.直肠痉挛不扩张；5肠壁僵直。肛管直肠测压法主要表现为肛门内括约肌松弛反射缺如；肛管节律性收缩明显减少；直肠内和内括约肌部静止压高于正常。直肠壁组织学检查主要观察黏膜下及肌间神经丛有无神经节细胞及细胞发育程度。正常的神经节细胞核大、染色深、居正中、核仁明显、周围胞浆嗜碱性。以上临床检查方法均存在其局限性，其中放射学方法对患儿有潜在的损伤，对新生儿巨结肠、造瘘术后患儿、超短段型与特发型巨结肠诊断困难。直肠肛管测压诊断准确性在儿童组高达95％以上，新生儿组也有60％-85％，但存在假阴性报告。直肠壁活检方法较为精确，但对患儿有明显创伤性，且风险较大，难以普遍开展。临床工作中更多的患儿确诊的方法是术后对手术切除标本进行病理学检查(图2)，术后组织标本狭窄段未见神经节细胞者为该可诊断先天性巨结肠。
实施例3 Taqman miRNA array筛选
制备cDNA样品：a)取100μl血浆；b)加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000转离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000转离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA。i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。(若针对不同miRNA则采用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行)
逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
预扩增的反应条件如下表所示：
将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。
预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：
考虑到吸液损失而放量12.5％。
检测并比较健康对照、先天性巨结肠血浆样本中miRNAs表达谱的差异，筛选出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中4条成为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194。
实施例4 Real-time PCR方法测量血浆miRNA表达量
设计引物(表1)分别对80例健康对照、80例先天性巨结肠患儿的血浆进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。
(1)制备cDNA样品：a)取100μl血浆；b)加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000转离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000转离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离心收集RNA.i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
(2)Real-time PCR：染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物(URP)，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara公司)，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。10μl TaqMan universal PCR master Mix，6.6μl H2O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较健康对照、先天性巨结肠患儿血浆样本中miRNA表达量的变化，各组样品血浆miRNA的表达量比值可用方程2-ΔG表示，其中ΔG＝CT group1-CT group2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。
从结果分析得出，hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194这四条miRNA在各组间均有显著差别(图3)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。
表1 miRNAs的引物序列
| 引物名称 | 对应miRNA引物序列 |
| hsa-miR-34b-F | ACACTCCAGCTGGGCAATCACTAACTCCACTG |
| hsa-miR-34b-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAATGGCAG |
| hsa-miR-31*-F | ACACTCCAGCTGGGTGCTATGCCAACATATTG |
| hsa-miR-31*-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAATGGCAA |
| has-miR-141-F | ACACTCCAGCTGGGTAACACTGTCTGGTAAAG |
| has-miR-141-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCATCTT |
| hsa-miR-194-F | ACACTCCAGCTGGGTGTAACAGCAACTCCATG |
| hsa-miR-194-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCCACAT |
| U6-F | CTCGCTTCGGCAGCACA |
| U6-R | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
| URP | TGGTGTCGTGGAGTCG |
实施例5个体血浆miRNA表达量的稳定性分析
采用实施例3的方法对六名儿童的血浆miRNA水平的稳定性进行评价。和实施例2同样的采集方法采集研究对象连续三次血浆(间隔时间为2周，间隔期内无疾病)。结果显示，血浆中hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194这四个miRNA表达水平较稳定(图4)。这些都提示了个体血浆miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断/监测标志物的特性。
实施例6 miRNA组合对HSCR的判断
根据上述Real-time PCR方法，本发明人通过对病例和对照组血浆样品的miRNAs表达水平的分析，以正常对照组miRNAs表达量的四分位数为阈值，对hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这四个miRNAs低表达或高表达对HSCR的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194以86.41％的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和HSCR组分开(图5)。
在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194能够很好地将对照和HSCR患儿分开。
实施例7 miRNA分层评分和独立人群盲法验证
当对hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194这四个标志物的表达水平进行分层评分时(四分位数分层后累加)，能够对是否患有HSCR进行评估，表述为积分越高，确认为HSCR的风险越高。
表3四个miRNAs四分位数得分并求和
注：每个miRNA按表达量的四分位数分为四个等级0、1、2、3，最低的0分，最高的3分，4条miRNA综合可以得分为0～12分，而HSCR组绝大多数得分很低(表达量都低，hsa-miR-34b的积分按反向计算)，而正常对照组绝大多数得分很低。举例来说，如有一个样本评分为12分(最高的分值组)，则其不可能为HSCR病例，而应为正常对照。
针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入对照组，得低分的归入HSCR组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分)，对另一组独立采集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例儿童)同时进行常规诊断分析和血浆样品的miRNA检测，结果显示通过4个miRNA检测评分，可以将HSCR及对照儿童很好的区分开(40例随机选择样本中有12例评分较低(≤3分)，其中达到0分(最高分)的有6例，这6例经病理诊断均为HSCR，其余评分较高(≥9分)的均为非HSCR)，提示这几种miRNA可作为评估HSCR的标志物。
实施例6用于先天性巨结肠诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作
该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-time PCR技术。
首先通过测序的方法和Real-time PCR方法确定正常人和先天性巨结肠患儿血浆中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与先天性巨结肠相关的一类血浆miRNA，作为预测是否患有先天性巨结肠以及诊断病变程度的指标。最后筛选出对应的血浆miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血浆miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141、hsa-miR-194、U6的正反向引物(见表1)。还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(2ml)血液，即可检测血浆miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测先天性巨结肠发生可能性或诊断先天性巨结肠病，并易于进行动态监测和观察治疗效果。
具体试剂盒组成如下：
引物也可以是以下四对引物中的二对、三对或四对：：SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SE Q ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10以及SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12，各10μM 0.25μl。
试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。
试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。
或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM通用反向引物，10μl TaqMan通用PCR混合液，6.6μl H2O。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。
参考文献：
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Claims (6)
1.与人类先天性巨结肠发生相关的血浆microRNA标志物，其特征在于由hsa-miR-34b、hsa-miR-31*、hsa-miR-141和hsa-miR-194构成；
其中：hsa-miR-34b的序列如SEQ ID No.1所示，hsa-miR-31*的序列如SEQ ID No.2所示，hsa-miR-141的序列如SEQ ID No.3所示，hsa-miR-194的序列如SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述的血浆microRNA标志物的引物，其特征在于序列如SEQ ID No.1所示的标志物的上游引物的序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；序列如SEQ ID No.2所示的标志物的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；序列如SEQ ID No.3所示的标志物的上游引物的序列如SEQ ID No.9所示，下游引物的序列如SEQ ID No.10所示；序列如SEQ ID No.4所示的标志物的上游引物的序列如SEQ ID No.11所示，下游引物的序列如SEQ ID No.12所示。
3.权利要求1所述的血浆microRNA标志物在制备人类先天性巨结肠的诊断或监测试剂中的应用。
4.权利要求2所述的引物在制备人类先天性巨结肠诊断或监测试剂中的应用。
5.一种人类先天性巨结肠诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的血浆microRNA标志物的引物。
6.根据权利要求5所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列4对引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，以及SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
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