CN103757017B - 一种与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及生殖医学领域,公开了一种与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物为hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p中的多种。该标志物对胎儿生长受限具有特异性和敏感性,可用于制备胎儿生长受限诊断或监测的试剂,可反复检测,且易于动态监测胎儿生长受限的程度。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及临床医学领域,涉及与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸(microRNA,miRNA)标志物及其应用。
背景技术
胎儿生长受限(fetalgrowthrestriction,FGR)是指胎儿出生体重低于同孕龄平均体重的两个标准差,或低于同龄正常体重的第10百分位数。FGR是围生期的重要并发症,居围生儿死亡原因第2位,其围生儿死亡率为正常儿的6-10倍,在死亡中约占围生儿的30%,产时宫内缺氧围生儿中50%为FGR,据统计我国的发病率平均为6.39%。FGR会引起新生儿呼吸困难、红细胞增多症、低血糖、脑室出血、低温等并发症。FGR不仅直接影响胎儿的发育,远期也影响儿童期及青春期的体能与智能发育,以及增加成人对冠心病、2型糖尿病、高血压等心血管疾病和代谢性疾病的易感性。
FGR的病因迄今尚未完全阐明,其发生与孕妇、胎儿因素、胎盘、环境等多方面的因素密切相关。明确FGR的病因对早期诊断和治疗有重要的作用。30%~40%的FGR发生于孕母有各种疾患及妊娠合并症者,如子痫前期、妊娠合并高血压或高血压合并妊娠、妊娠期糖尿病等,此外母体血管疾病和血栓形成会导致子宫胎盘灌注不足而引起胎儿生长受限。10%由于多胎,多胎加重了子宫胎盘动脉的压力。10%由于胎儿问题——感染或畸形,约有40%发生于正常妊娠,其发病原因迄今仍未阐明,称为“特发性胎儿生长受限”。
有时即便孕妇和胎儿均无异常因素,胎盘及其附属物的变化亦可导致FGR。胎盘滋养细胞参与激活代谢、产生激素、吸收营养和排除代谢废物等,广泛的证据表明在FGR的发生中胎盘功能不足。导致胎儿生长受限的最主要最直接的原因是胎盘发育异常及循环功能障碍,造成胎儿营养物质供给和利用障碍。研究发现不同的胎盘因素参与疾病的发生,如解剖、血管、染色体和/或形态异常等。FGR组与正常对照组相比,胎盘绒毛数目、绒毛血管数目、胎盘体重和胎儿-胎盘重量比均明显下降。增厚的绒毛滋养细胞基底膜、绒毛梗死的发病率、血栓形成和血肿的存在和发生在FGR组中较常见。子宫-胎盘血管、胎儿-胎盘血管重构异常也发生于FGR。绒毛血管的生成障碍导致胎儿与母体间血运减少、营养物质的输送能力下降。同时绒毛间隙纤维素沉积可导致绒毛间血流减少,合体滋养细胞微绒毛膜表面的Na(+)/K(+)ATPase活性明显降低,导致Na(+)-偶联的转运功能削弱,母胎间的交换面积和效率均降低。已知许多生长因子,包括血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGF)等在绒毛细胞内产生,经其受体在局部起作用,控制胎盘血管的生成、迁移、入侵等能力。此外,MMP-9是滋养层细胞分泌的有效水解酶,选择性水解子宫内膜成分及基底膜,在胎盘的植入中发挥重要作用,其分泌的减少使滋养细胞对子宫肌层的浸润和螺旋动脉的形成发生变化,限制胎盘血供,使绒毛间隙含氧量减少,造成绒毛细胞缺氧。但是FGR的病因迄今尚未完全阐明。
微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点,它是一类长约19-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA,多位于基因组非编码区。它在生物进化过程中高度保守,在细胞中具有时空特异性表达模式,可在转录后水平对基因表达进行调节,并与动物的许多正常生理活动,同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。这些小分子RNA是从60~200nt的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟,在动物细胞中,miRNA的转录初产物(pri-miRNA)很快被一种核糖核酸酶IIIDrosha加工成miRNA前体(pre-miRNA),然后由细胞核转运至细胞质中,经另一种核糖核酸酶IIIDicer识别剪切为成熟miRNA。随后,这个单链与辅酶因子TRBP及PACT形成RNA诱导沉默复合物,再与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合,从而发挥其调控mRNA转录与蛋白翻译的总开关作用。miRNA诱发的基因沉默现象是通过直接切割或阻碍基因的转录。多数的miRNA与一个特定的mRNA不是完全互补的,因此相同的miRNA可以同时调控多个基因。另外,不同的miRNAs也可以靶向调控相同的mRNA,并且有相似的生物学功能。大约30%的人类基因表达可能受miRNAs调控。第一个ncRNA于1965年在面包酵母中被发现,但是它的生理功能直到1993年才被认识,在线虫体内时序性调控生长发育,所以叫做“小时空RNA”。直到20世纪初,才被称为miRNA,它在细胞内的RNA干扰机制开始被认识。最近的十几年,在人类中已发现了1000多种miRNAs,作为21世纪生命科学的重大发现,越来越多的研究显示,其参与的细胞转录后调控,在个体发育、细胞胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的调节作用。目前,已发现血清miRNA可作为多种肿瘤发生与预后的良好生物标志物。
最新的研究成果发现血清中存在数百种的miRNA,性质稳定、含量丰富、易于定量检测,且存在显著的疾病特异性,在肺癌、乳腺癌中已经证实血清miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋,血清miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物,开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注,路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道,《Nature》杂志也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而孕妇血清中miRNA在胎儿生长受限早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注,若能发现与胎儿生长受限发病相关的特异且稳定的血清miRNA作为生物标志物,并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒,不仅能创造令人瞩目的经济效益,对我国胎儿生长受限的防治也将是一次强有力的推动。
发明内容
本发明的目的是提供与人类胎儿生长受限发生相关的血清microRNA标志物。
本发明的另一个目的是提供上述血清microRNA标志物的引物。
本发明还有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物或其引物的应用。
本发明再有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物的引物的用于人类胎儿生长受限诊断或监测的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
与人类胎儿生长受限相关的血清microRNA标志物,选自hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p中的多种。
所述的血清microRNA标志物由hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p构成。所述的血清microRNA标志物,其中hsa-miR-10a的序列为uacccuguagauccgaauuugug(SEQIDNo.1),hsa-miR-320b的序列为aaaagcuggguugagagggcaa(SEQIDNo.2),hsa-miR-409-3p的序列为gaauguugcucggugaaccccu(SEQIDNo.3),hsa-miR-483-3p的序列为ucacuccucuccucccgucuu(SEQIDNo.4),hsa-miR-675-5p的序列为uggugcggagagggcccacagug(SEQIDNo.5)。
所述的血清microRNA标志物的引物,其中序列为SEQIDNo.1的标志物的上游引物为SEQIDNo.6,下游引物为SEQIDNo.7;序列为SEQIDNo.2的标志物的上游引物为SEQIDNo.8,下游引物为SEQIDNo.9;序列为SEQIDNo.3的标志物的上游引物为SEQIDNo.10,下游引物为SEQIDNo.11;序列为SEQIDNo.4的标志物的上游引物为SEQIDNo.12,下游引物为SEQIDNo.13;序列为SEQIDNo.5的标志物的上游引物为SEQIDNo.14,下游引物为SEQIDNo.15。
所述的血清microRNA标志物或其引物在制备胎儿生长受限诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的试剂。
一种人类胎儿生长受限诊断或监测试剂盒,该试剂盒含有上述血清microRNA标志物(hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p中的多种)的引物。
所述的诊断或监测试剂盒,该试剂盒含有上述引物(SEQIDNo.6和SEQIDNo.7,SEQIDNo.8和SEQIDNo.9,SEQIDNo.10和SEQIDNo.11,SEQIDNo.12和SEQIDNo.13,SEQIDNo.14和SEQIDNo.15)中的多对。
所述的诊断或监测试剂盒,该试剂盒含有下列5对引物SEQIDNo.6和SEQIDNo.7,SEQIDNo.8和SEQIDNo.9,SEQIDNo.10和SEQIDNo.11,SEQIDNo.12和SEQIDNo.13,SEQIDNo.14和SEQIDNo.15。
试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
本发明详细描述如下:
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人群基础信息和临床资料,并采用了RT-PCR方法、TaqManmiRNAArray、Real-timePCR(TaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
一、研究对象选择和分组依据
A组:健康对照组(n=80,10人芯片筛选,30人一期验证,40人独立人群验证),无其他全身性重大疾病。
B组:胎儿生长受限组(n=80,10人芯片筛选,30人一期验证,40人独立人群验证),无其他全身性重大疾病。
二、血液血清分离及miRNA提取
(1)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000g离心5min,取上清每100μl分装至洁净1.5mlEP管中;
(2)加入60μl裂解液,漩涡震荡5s,室温静置3min;
(3)加入20μl蛋白液,漩涡震荡5s,室温静置1min,11000g离心3min;
(4)取上清至新的2ml收集管,加入270μl异丙醇,漩涡震荡5s;
(5)将microRNA离心柱放在收集管中,将步骤4的液体加入离心柱中,室温静置2min,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;
(6)加入100μl洗脱液1至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;
(7)加入700μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;
(8)加入250μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心2min;
(9)将microRNA离心柱放置在新的1.5ml收集管中,加入25μl去核糖核酸酶水至microRNA离心柱膜上,室温静置1min,11000g离心1min;
(10)重复步骤9一次,-70℃保存收集管中的样本。
本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(裂解液、蛋白液、洗脱液1和洗脱液2)均来自ExiqonmiRCURYRNAisolationkit(货号300112)试剂盒,下同。
三、Real-timePCR方法测量血清miRNAs表达量
1.取经前处理的血清,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
按下表所示配制反转录体系:
2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心,冰上放置5分钟。
3.将PCR管放入PCR仪进行反转录,反应条件如下表所示:
反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增:
预扩增的反应条件如下表所示:
降至4℃后,将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-timePCR反应。
5.将预扩增产物简短离心后,加入0.1×TE(pH8.0)75μl,颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-timePCR。
预扩增产物进行Real-timePCR按下表所示配制反应体系:
考虑到吸液损失而放量12.5%。
6.检测并比较健康对照组、胎儿生长受限组血清样本中miRNAs表达量的差异。
检测到的存在差异表达的健康对照和胎儿生长受限患者血清miRNAs包括hsa-miR-10a(SEQIDNo.1)、hsa-miR-320b(SEQIDNo.2)、hsa-miR-409-3p(SEQIDNo.3)、hsa-miR-483-3p(SEQIDNo.4)、hsa-miR-675-5p(SEQIDNo.5)。这些miRNAs在胎儿生长受限患者中的拷贝数都显著低于健康对照组,并且这些miRNAs在血清中表达稳定。
四、Real-timePCR方法验证血清miRNAs表达量
1.设计5条目标miRNAs的引物:运用Stem-loopPCR方法设计引物。
2.加入荧光染料进行Real-timePCR反应。检测并比较健康组、胎儿生长受限组孕妇血清样本中miRNAs表达量的差异(病例和对照各80人)。
3.选择独立人群(对照和病例各40人)进行Real-timePCR检测,结果一致的有5条miRNAs,具体为:hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p。
因此,最终确认为存在差异表达的健康孕妇和胎儿生长受限患者血清miRNAs包括hsa-miR-10a(SEQIDNo.1)、hsa-miR-320b(SEQIDNo.2)、hsa-miR-409-3p(SEQIDNo.3)、hsa-miR-483-3p(SEQIDNo.4)、hsa-miR-675-5p(SEQIDNo.5),具体引物见表1。它们在胎儿生长受限患者血清中的拷贝数均显著低于健康对照组,并且这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5这5个构成的组合可以将对照组、胎儿生长受限组区分开。虽然这5条单独也可以分开两组人群,但如果只用1条,可能会有重合,而如果同时使用5条,即使1条差异不大,但另外4条表达差异都很大,就可以将其带入评分高的组。
五、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果,本发明人还制备了一种能用于胎儿生长受限动态监测的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中稳定存在且可检测的成熟hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清miRNAs引物,还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
本发明的有益效果:
本发明人通过分离和比较正常对照和胎儿生长受限患者血清中的miRNAs,发现了血清中存在可用于评估是否患有胎儿生长受限患者的特异性和敏感性(实施例5的ROC曲线提示具有较好的灵敏度,实施例6对其实际效果进行了验证,即胎儿生长受限患者均被正确检测识别)的miRNA组合,因而提出了胎儿生长受限患者的血清miRNA标志物组合,以及该血清miRNA标志物或其引物在制备胎儿生长受限诊断或监测试剂中的应用,研制出可便于临床应用的胎儿生长受限诊断、监测试剂盒。
本发明采用血清miRNA作为胎儿生长受限评价的标志物的优越性在于:
(1)血清miRNA是一种新型生物标志物,区别于传统生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,且定量精确,将大大提高胎儿生长受限诊断的敏感性和特异性,该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆,将为妊娠合并综合症的防治开创全新局面,为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血清miRNA标志物可用于胎儿生长受限诊断标志物,可避免侵入性诊断,并可在早期通过微创方式对胎儿生长受限进行辅助诊断,从而为临床医生进一步深入检查提供依据,为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持,延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用符合胎儿生长受限和健康对照人群的样本进行验证,证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定的表达,以说明该标志物具有特异性,可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系,初期通过预实验筛选多种血清miRNAs,应用Real-timePCR等方法进行二次验证和独立人群验证,采用分层评分系统对诊断结果进行标化,并在另一组独立人群中对血清miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价,保证了该血清miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。
附图说明
图1以hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p作为标志物对正常对照组和胎儿生长受限组进行区分。
图2个体血清miRNAs表达水平波动性分析。
图3正常对照组和胎儿生长受限组之间的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1研究对象选择和分组依据
本发明人于2010年7月到2013年1月间从南京医科大学附属淮安第一人民医院等医院搜集符合要求的胎儿生长受限病例及健康对照孕妇血液样品,通过对样品资料的整理,从中选择了符合要求的80例健康对照(孕妇平均年龄:26.39±3.42天)、80例胎儿生长受限病例(孕妇平均年龄:27.47±4.15天)作为Real-timePCR检测miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下:
A组:健康对照组(n=80,10人芯片筛选,30人一期验证,40人独立人群验证):
1.无其他全身性重大疾病。
B组:胎儿生长受限组(n=80,10人芯片筛选,30人一期验证,40人独立人群验证):
1.经临床诊断为胎儿生长受限;
2.无其他全身性重大疾病。
实施例2TaqManmiRNAarray筛选
制备cDNA样品:a)取100μl血清;b)加入60μl裂解液,漩涡震荡5s,室温静置3min;c)加入20μl蛋白液,漩涡震荡5s,室温静置1min,11000g离心3min;d)取上清至新的2ml收集管,加入270μl异丙醇,漩涡震荡5s;e)将microRNA离心柱放在收集管中,将步骤d的液体加入离心柱中,室温静置2min,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;f)加入100μl洗脱液1至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;g)加入700μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;h)加入250μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心2min;i)将microRNA离心柱放置在新的1.5ml收集管中,加入25μl去核糖核酸酶水至microRNA离心柱膜上,室温静置1min,11000g离心1min。重复步骤i一次,获得血清样本miRNA;j)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。按下表所表所示配制逆转录反应体系:
逆转录反应步骤如下表所示:
逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增:
预扩增的反应条件如下表所示:
将预扩增产物简短离心后,加入0.1×TE(pH8.0)75μl,颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。
预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系:
考虑到吸液损失而放量12.5%。预扩增产物稀释倍数为4倍。
检测并比较健康对照、胎儿生长受限血清样本中miRNAs表达谱的差异,筛选出有8倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果,选定其中8条成为候选并进行进一步验证,具体为:hsa-miR-10a、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-1291。
实施例3Real-timePCR方法测量血清miRNA表达量
设计引物(表1)分别对80例健康对照、80例胎儿生长受限患者的血清进行各miRNAs的定量Real-timePCR检测。
(1)制备cDNA样品:a)取100μl血清;b)加入60μl裂解液,漩涡震荡5s,室温静置3min;c)加入20μl蛋白液,漩涡震荡5s,室温静置1min,11000g离心3min;d)取上清至新的2ml收集管,加入270μl异丙醇,漩涡震荡5s;e)将microRNA离心柱放在收集管中,将步骤d的液体加入离心柱中,室温静置2min,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;f)加入100μl洗脱液1至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;g)加入700μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心30s,倒掉收集管中液体,将离心柱放回收集管;h)加入250μl洗脱液2至microRNA离心柱,11000g离心2min;i)将microRNA离心柱放置在新的1.5ml收集管中,加入25μl去核糖核酸酶水至microRNA离心柱膜上,室温静置1min,11000g离心1min。重复步骤i一次,获得血清样本miRNA;j)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(Takara公司)、0.5μlRNA酶抑制剂(Takara公司)、1μlAMV(Takara公司)以及1.5μlloop环的反转录引物(URP,见表1)。反应步骤为16℃孵育15分钟,42℃反应1小时,85℃孵育5分钟;
(2)Real-timePCR:染料法:取1μlcDNA,将cDNA倍比稀释,加入0.3μlTaq酶(Takara公司),1μl20×EVAGREEN,0.25μl10μM上述单一miRNA对应的正向引物,0.25μl10μM通用反向引物(URP),1.2μl25mMMgCl2,1.6μl2.5mMdNTP混合液(Takara公司),2μl10×PCR缓冲液,12.4μl纯水,10μlTaqManuniversalPCRmasterMix,3.7μlH2O,20μl体系进行实时荧光定量PCR。使用的仪器均为ABIPrism7900荧光定量PCR仪,PCR的反应条件为:95℃、5分钟进行1个循环→95℃反应15秒、60℃反应1分钟进行40个循环。检测并比较健康对照、胎儿生长受限病例血清样本中miRNA表达量的变化。为保证各次实验间的可比性,我们在每板上都设置了U6,以其表达量作为内参调整计算表达量,各组样品血清miRNA的表达量比值可用方程表示,其中△G=CTmiRNA–CTU6。
从结果分析得出,hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p这五条miRNA在各组间均有显著差异(图1)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。
表1miRNAs的引物序列
引物名称 | 对应miRNA引物序列 |
hsa-miR-10a-F | ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGATCCGAA |
hsa-miR-10a-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT |
hsa-miR-320b-F | ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA |
hsa-miR-320b-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTTGCCCTC |
hsa-miR-409-3p-F | ACACTCCAGCTGGGGAATGTTGCTCGGTGA |
hsa-miR-409-3p-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGGTTC |
hsa-miR-483-3p-F | ACACTCCAGCTGGGTCACTCCTCTCCTCC10 --> |
hsa-miR-483-3p-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG |
hsa-miR-675-5p-F | ACACTCCAGCTGGGTGGTGCGGAGAGGGCCC |
hsa-miR-675-5p-R | CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACTGTGG |
U6-F | CTCGCTTCGGCAGCACA |
U6-R | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
URP | TGGTGTCGTGGAGTCG |
实施例4个体血清miRNA表达量的稳定性分析
采用实施例3的方法对10名孕妇的血清miRNA水平的稳定性进行评价。和实施例1同样的采集方法采集研究对象连续三次血清(间隔时间为1周,间隔期内无疾病)。结果显示,血清中hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p这五个miRNA表达水平较稳定(图2)。这些都提示了个体血清miRNA的表达量较为稳定,具备作为诊断/监测标志物的特性。
实施例5miRNA组合对胎儿生长受限的判断
根据上述Real-timePCR方法,本发明人通过对病例组和对照组血清样品的miRNAs表达水平的分析,以健康对照组miRNAs表达量的五分位数为阈值,对hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p进行评分,进一步求得总得分,以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性,进而评估这五个miRNAs低表达对胎儿生长受限的评估能力。ROC分析结果显示,hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p以96.28%的AUC(ROC曲线下面积)(敏感度为91.25%,特异度为90.00%)将正常对照组和胎儿生长受限组分开(图3),远高于现有技术中的89.73%,具有更好的技术效果。
在上述一系列研究结果的基础上,本发明人证明了采用hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p能够很好地将胎儿生长受限患者和正常对照分开。
实施例6miRNA分层评分和独立人群盲法验证
当对hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p这五个标志物的表达水平进行分层评分时(五分位数分层后累加),能够对是否患有胎儿生长受限进行评估,表述为积分越高,确认为胎儿生长受限的风险越高(表2)。
表2五个miRNAs五分位数得分并求和
注:每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4,最低的0分,最高的4分,5个miRNA综合得分为0~20分,而胎儿生长受限组绝大多数得分很低,而正常对照组绝大多数得分很高。举例来说,如有一个样本评分为20分(最高的分值组),则其不可能为胎儿生长受限病例,而应为正常对照。
针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组,得高分的归入对照组,得低分的归入胎儿生长受限组;比较而言,≥17算高分,≤4算低分),对另一组独立采集的人群进行盲法首诊,即采用双盲试验,对独立人群(另一医院采集的40例孕妇)同时进行常规诊断分析和血清样品的miRNA检测,结果显示通过5个miRNA检测评分,可以将胎儿生长受限及正常对照很好的区分开(40例随机选择样本中有7例评分较低(≤4分),其中达到0分(最高分)的有3例,这3例经诊断均为胎儿生长受限,其余评分较高(≥17分)的均为非胎儿生长受限),提示这5个miRNAs的组合可作为评估胎儿生长受限的标志物。
实施例7用于胎儿生长受限诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作
该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-timePCR技术。
首先通过测序的方法和Real-timePCR方法确定正常人和胎儿生长受限患者血清中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与胎儿生长受限相关的一类血清miRNA,作为预测是否患有胎儿生长受限以及诊断的指标。最后筛选出对应的血清miRNA的数量控制在几条,这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清miRNA引物,其中miRNA的引物包括hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p、U6的正反向引物(见表1)。还可以有相关PCR技术常用的试剂,如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂,这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(2ml)血液,即可检测血清miRNA标志物的变化趋势,再通过该变化趋势预测胎儿生长受限发生可能性或诊断胎儿生长受限,并易于进行动态监测和观察治疗效果。
具体试剂盒组成如下:
引物也可以是以下五对引物中的二对、三对、四对或五对:SEQIDNO.6和SEQIDNO.7,SEQIDNO.8和SEQIDNO.9,SEQIDNO.10和SEQIDNO.11,SEQIDNo.12和SEQIDNo.13,SEQIDNo.14和SEQIDNo.15,各10μM2.5μl。
试剂盒中还可以含有3μlTaq酶、10μl20×EVAGREEN、12μl25mMMgCl2、16μl2.5mMdNTP混合液、20μl10×PCR缓冲液、114μl去核糖核酸水。
试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。
或者试剂盒中除正向引物外还含有10μM通用反向引物,TaqMan通用PCR混合液。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。
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Claims (5)
1.人类胎儿生长受限相关的血清microRNA标志物,其特征在于该标志物由hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p和hsa-miR-675-5p构成;其中:hsa-miR-10a的序列为SEQIDNo.1,hsa-miR-320b的序列为SEQIDNo.2,hsa-miR-409-3p的序列为SEQIDNo.3,hsa-miR-483-3p的序列为SEQIDNo.4,hsa-miR-675-5p的序列为SEQIDNo.5。
2.用于检测权利要求1所述血清microRNA标志物的引物,其特征在于序列为SEQIDNo.1的标志物的上游引物为SEQIDNo.6,下游引物为SEQIDNo.7;序列为SEQIDNo.2的标志物的上游引物为SEQIDNo.8,下游引物为SEQIDNo.9;序列为SEQIDNo.3的标志物的上游引物为SEQIDNo.10,下游引物为SEQIDNo.11;序列为SEQIDNo.4的标志物的上游引物为SEQIDNo.12,下游引物为SEQIDNo.13;序列为SEQIDNo.5的标志物的上游引物为SEQIDNo.14,下游引物为SEQIDNo.15。
3.权利要求2所述的引物在制备人类胎儿生长受限辅助诊断或监测试剂中的应用。
4.一种人类胎儿生长受限辅助诊断或监测试剂盒,其特征在于该试剂盒含有用于检测权利要求1所述血清microRNA标志物的引物。
5.根据权利要求4所述的辅助诊断或监测试剂盒,其特征在于该试剂盒含有引物SEQIDNo.6和SEQIDNo.7,SEQIDNo.8和SEQIDNo.9,SEQIDNo.10和SEQIDNo.11,SEQIDNo.12和SEQIDNo.13,以及SEQIDNo.14和SEQIDNo.15。
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